志賀菌敏感株與誘導耐多藥株蛋白質(zhì)組學分析【摘要】目的對志賀菌敏感株與誘導耐多藥株全菌蛋白進行蛋白質(zhì)組學比較，尋找細菌耐多藥相關蛋白。方法采用4類抗生素的次抑菌濃度，對臨床分離鑒定的志賀菌敏感株進行誘導耐多藥試驗；對志賀菌敏感株及誘導耐多藥株全菌蛋白進行雙向電泳；電泳圖譜采用ImageMaster2DPlatinum軟件分析；差異表達蛋白進行基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜分析。結果成功獲得志賀菌誘導耐多藥株，在志賀菌敏感株與耐多藥株全菌蛋白質(zhì)圖譜中分別檢測出個和個蛋白質(zhì)斑點；共發(fā)現(xiàn)48個差異表達的蛋白點，其中5個質(zhì)譜鑒定為ABC轉運蛋白、谷胺酰轉肽酶、天冬氨酸氨甲酰基轉移酶、翻譯延長因子Tu、單鏈DNA結合蛋白；其中前3個蛋白中在耐多藥株中表達量增強，后2個減弱。結論5個耐多藥相關蛋白中在細胞代謝中起重要作用的酶類表達量上調(diào)；ABC轉運蛋白在志賀菌誘導耐多藥機制中起重要作用。

【關鍵詞】志賀菌

近年來，隨著抗生素的廣泛使用甚至濫用，造成志賀菌頻繁發(fā)生變異，產(chǎn)生耐藥株，且耐藥率高、耐藥產(chǎn)生速度快、耐藥范圍廣，給細菌性痢疾的防治帶來新的挑戰(zhàn)，因此，深入探討志賀菌的耐多藥機制成為目前解決志賀菌耐多藥的先決條件。本課題選用對抗生素敏感的1株志賀菌，以自身藥物誘導方式構建出多重耐藥菌株，通過比較敏感株與藥物自身誘導耐多藥株蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，觀察與志賀菌耐多藥相關蛋白，并對部分表達差異蛋白進行基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜(MOLDITOF-TOF)分析和數(shù)據(jù)庫檢索,旨在探索其耐多藥機制。結果報告如下。

1材料與方法

11材料

111菌株(1)福氏痢疾桿菌標準株：菌株號51571-9；(2)敏感株：采用改良K-B紙片法，從臨床分離鑒定的志賀菌株中，篩選1株對頭孢噻吩(CF）、諾氟沙星、慶大霉素、磺胺甲基異惡唑均敏感的福氏志賀菌作為敏感株。誘導耐多藥株：使用志賀菌標準株和分離出的敏感株，參考文獻〔1〕的次抑菌濃度(1/2MIC)誘導耐多藥方法，建立誘導耐多藥株。

112試劑與儀器頭孢噻吩等抗生素均為標準品(中國藥品檢驗中心)。固相pH梯度干膠條；IPG緩沖液、IPG覆蓋液、兩性電解質(zhì)pharmalyte(pH3～10)、3-［(3-膽酰胺丙基)-乙二胺］-1-丙磺酸(3-［(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio］-1-propanesulfonate,CHAPS)(美國AmershamPharmacia公司)。丙烯酰胺、尿素、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、蛋白酶抑制劑丙甲基磺酰氟、亮抑蛋白酶肽(美國Sigma公司)。固相pH梯度等電聚焦儀IPGphorIEFSystem,垂直板電泳儀、ImageScanner光密度掃描儀、圖像分析系統(tǒng)。

12方法

121蛋白質(zhì)雙向電泳蛋白提取方法：采用超聲兼Urea-CHAPS-DTT-SB3-10裂解提取法〔2〕,略作改進。可溶性總蛋白定量：應用BradFord法〔3〕對提取的可溶性總蛋白進行定量；第一相固相pH梯度等電聚焦:按文獻〔4〕,程序分別為30V7h，60V7h，150V05h，300V1h，600V1h，8000V12h。平衡：按文獻〔3〕。第二相垂直板SDS電泳：按文獻〔3〕。染色：銀染按AmershamBioscience的銀染方案稍作改進〔4〕。考馬斯亮藍染色按Neuhoff等的方法進行〔5〕。圖像掃描分析：用AmershamBioscience的掃描儀投射掃描，分辨率為300dpi。數(shù)字化圖像文件運用ImageMaster2DPlatinum軟件分析。圖像分析過程包括蛋白質(zhì)斑點的檢測、量化、背景扣除、匹配。蛋白質(zhì)斑點經(jīng)自動檢測后進行手工校對，匹配之前先選一塊膠作為參考凝膠，其他凝膠都與之匹配。

122質(zhì)譜分析質(zhì)譜樣品制備：比較雙向電泳圖譜，找到差異蛋白，切下1mm×1mm×1mm，置于15ml的Eppendorf管中,按文獻〔6〕方法處理樣品。(2)質(zhì)譜鑒定:樣品按照1∶1的比例,與含有α-氰基-羥基苯丙烯酸的50%乙腈/01%甲酸的溶液混合。所有質(zhì)譜在4700型MALDITOF-TOF蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)下獲得。選擇反射式陽離子捕獲方式，質(zhì)量精確度為50mg/L;MS光譜質(zhì)量范圍800～4000Da。

123數(shù)據(jù)庫檢索光譜在全球蛋白服務工作站進行處理和分析；搜索在NCBInr蛋白數(shù)據(jù)庫進行；鑒定GPS可信區(qū)間應95％。搜索參數(shù)設置：相對分子質(zhì)量誤差范圍±20%，肽片段相對分子質(zhì)量誤差范圍±05Da，每個肽允許有1個不完全裂解位點，物種選擇細菌；蛋白質(zhì)身份確定：根據(jù)搜索結果并結合蛋白質(zhì)在凝膠上的等電點和相對分子質(zhì)量進行最終確定；要求肽段覆蓋率15%，匹配肽段至少4個，等電點和相對分子質(zhì)量與觀察值基本相符。

2結果

21次抑菌濃度(1/2MIC)誘導耐多藥結果志賀菌出發(fā)菌的抑菌濃度分別為頭孢噻吩32mg/L，諾氟沙星05mg/L，慶大霉素2mg/L，磺胺甲基異惡唑512mg/L。將此出發(fā)菌在1/2MIC的LB培養(yǎng)基中傳代，最終得到MIC≥4倍誘導前的耐多藥菌株，分別是出發(fā)菌株的6，6，8，8倍。

22蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜比較(1)敏感株：相同實驗條件及參數(shù)設置情況下,對志賀菌可溶性總蛋白重復3次進行雙向電泳分離，發(fā)現(xiàn)3次雙向電泳圖譜非常相似，蛋白質(zhì)上樣量為100μg，pH3～10,24cm線性干膠條通過ImageMaster2DPlatinum分析軟件對其進行點檢測，獲得(946±37)個蛋白質(zhì)斑點(圖1)。(2)誘導耐多藥株：對志賀菌誘導耐多藥株可溶性總蛋白重復3次進行雙向電泳分離，獲得3塊凝膠的平均蛋白質(zhì)點數(shù)為1096±189。經(jīng)過背景消減后，將其中1塊凝膠作為參考凝膠進行匹配，匹配點數(shù)為1078±26，其匹配率為9836％。

232種菌株蛋白質(zhì)差異表達譜分析以誘導耐多藥株雙向凝膠圖譜為參考凝膠，與敏感株進行匹配，匹配蛋白質(zhì)點數(shù)為637±16，匹配率為6879％，共發(fā)現(xiàn)48個差異表達的蛋白點(表達量相差5倍以上的點為差異蛋白質(zhì)點)，其中8個蛋白點只存在于誘導耐多藥株中，8個蛋白點只存在于敏感株中；在2種菌株中表達量相差5倍以上的32個蛋白點中，有26個蛋白點隨著志賀菌由敏感株向耐多藥株轉變而表達量增加，其余6個蛋白點表達量下降。蛋白質(zhì)上樣量100μg;第一向pH3～10，24cm非線性干膠條；

第二向應用125%聚丙烯酰胺凝膠(銀染)

圖1志賀菌敏感株蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜

蛋白質(zhì)上樣量100μg;第一向pH3～10，24cm非線性干膠條；第二向應用125%聚丙烯酰胺凝膠(銀染)

圖2志賀菌誘導耐多藥株蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜

圖3志賀菌敏感株與誘導耐多藥株的差異表達蛋白

24質(zhì)譜鑒定在考馬斯亮藍染色的凝膠上選取5個差異點進行肽指紋圖譜鑒定，結果可見，200，201，98號蛋白點表達量增加，72，14號表達量下降。

表1差異表達蛋白的質(zhì)譜鑒定結果

3討論

三磷酸腺苷-組合轉運蛋白(ATP-Bmdingcassettestransparters,ABC)外排系統(tǒng)為細菌耐多藥主動流出機制之一，腫瘤細胞膜上此蛋白過量表達，以便藥物順利進入細胞并很快被泵出，形成多樣抗藥性〔7,8〕。陳川等〔9〕在研究嗜水氣單胞菌耐四環(huán)素的蛋白質(zhì)組學時發(fā)現(xiàn)，ABC轉運蛋白在耐藥株中表達量顯著增加；BoriesC等〔10〕在研究利什曼原蟲的藥物作用原理及抗藥性中發(fā)現(xiàn)，ABC轉運系統(tǒng)在利什曼原蟲的抗藥性中起重要作用；SiposG等〔11〕也發(fā)現(xiàn)，ABC轉運子在真菌的多藥耐受性中起重要作用。本文結果顯示，98號ABC轉運蛋白(ATPbindingcassettetransporterprotei

n)在志賀菌誘導耐多藥株中表達量上調(diào)，表明雖然ABC轉運蛋白也存在于志賀菌敏感株中，但在志賀菌誘導耐多藥株中表達量明顯增加，將結構不同藥物泵出胞外，導致胞內(nèi)藥物達不到有效濃度而導致細菌耐多藥，可見此蛋白在志賀菌的耐多藥機制中也起重要作用。本文結果還顯示，200號谷胺酰轉肽酶表達量增加，提示在長期低濃度藥物誘導作用下，轉肽酶參與的生物代謝反應中形成的一些生物介質(zhì)可能在誘導耐多藥過程中起重要作用，從而使此酶的表達量增加，以滿足細胞在應急條件下生存所必需。從雙向電泳圖譜來看，201號天冬氨酸氨甲酰基轉移酶在誘導耐多藥株中明顯發(fā)生位移，分子量及等電點均增加，表達量也有所提高，推測在藥物誘導過程中，該酶可能發(fā)生某些基團的修飾作用，以適應新環(huán)境而生存。2006年，Tian-YiYing等〔12〕對福氏2a志賀菌2457T的外膜免疫性蛋白質(zhì)進行雙向電泳肽指紋圖譜分析及蛋白印跡法檢測，發(fā)現(xiàn)翻譯延長因子Tu是志賀菌的外膜抗原蛋白。本次結果表明，14號EF-Tu在志賀菌的誘導耐多藥株中表達量降低，可能是其基因調(diào)控序列在長期藥物誘導過程中發(fā)生變異，使產(chǎn)物的表達量降低，或可能另一類能調(diào)節(jié)EF-Tu的翻譯延長因子Ts表達量降低，從而使EF-Tu活性降低，以適應細胞在不利環(huán)境環(huán)境中生存。72號單鏈DNA結合蛋白(SSB)在敏感株向耐多藥株轉變過程中表達量也有所下降。本文從全蛋白組角度探討了志賀菌的耐多藥機制，選擇志賀菌敏感株作為實驗菌株，通過藥物誘導產(chǎn)生誘導耐多藥株，排除了因菌株不同而導致的差異，可比性好。后續(xù)研究可能會發(fā)現(xiàn)

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