細胞器的分離、純化—細胞分級分離法—秦川實驗目的實驗原理實驗用品實驗方法應用范圍：

1.病毒及亞細胞組份分離

2.蛋白梯度分離

3.脂蛋白分離

4.RNA梯度沉淀

5.質粒DNA提純

Back認識離心機及學習離心機的使用方法學習細胞器的分離及純化的一般原理和方法實驗目的Back實驗原理

離心技術是借助于離心機旋轉所產生的離心力，根據物質穎粒的沉降系數、質量、密度及浮力等因子的不同，而使物質分離的分離分析技術。細胞分級分離式一種通過離心從而分離細胞內不同結構成分的細胞器。不同的細胞器的大小和密度不同，在同一離心場內的沉降速度不同，用差速離心法、密度梯度離心法、密度梯度平衡離心法分離細胞器。差速離心法是從低到高不同的轉速離心，使較大的顆粒先在低轉速中沉淀，再用較高轉速將原來懸浮的小顆粒物質沉淀下來，從而達到逐級分離。相對離心力（RCF）由于轉頭有不同的制造商制造，半徑不同，故用相對離心力來表示離心力的大小。RCF(×g)=Fc/F重力=mG/mg=r·ω2/g=1.119×10-5·N2·r =11.2r(N/1000)2也有：根據這個公式，相對離心力（RCF）和每分鐘轉數（N）之間便可以互換，這種互換關系是很有實用價值的。Back為了簡便實驗用品材料：新鮮菠菜器材：顯微鏡、高速低溫離心機、普通離心機、離心管、200目的尼龍網、漏斗、燒杯、組織研磨器。試劑：①線粒體離心勻漿介質。②1%詹納斯綠B的0.25M蔗糖溶液。③0.05MTris-HCl液體Ph=8.0④0.35mol/LNaCl

Back勻漿介質，一般為一定濃度的蔗糖溶液加入其它離子成分，可以維持亞細胞組分的滲透壓。臺式高、超速離心機0.6-10萬rpm離心機制備性分析性分析性超速離心機普通離心機冰凍離心機臺式（或地面式）普通離心機大容量冰凍離心機小于0.6萬rpm高速冰凍離心機0.6-2.5萬超速冰凍離心機2.5-8萬或更高(分析性超速離心主要用于檢測大分子物質的沉降特征和結構等)概述Back

！離心機一般由離心機主機，轉頭，離心管三部分組成。離心機一般由離心機主機，轉頭，離心管三部分組成。Back一般制備離心

一般制備離心是指在分離、濃縮、提純樣品中，不必制備密度梯度的一次完成的離心操作，實驗室用低、高速離心機可應用于此項技術。臺式或地面式普通離心機Back高速冰凍離心機Back

從低速到高速逐級沉淀分離，使較大的顆粒先在較低轉速中沉淀，再用較高轉速將原先懸浮在上清液中的較小顆粒分離沉淀下來，從而使各種亞細胞組分得以分離。差速離心法主要用于分離細胞器和病毒。其優點是：操作簡單，離心后用傾倒法即可將上清夜與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉子。缺點是：①分離效果差，不能一次得到純顆粒；②壁效應嚴重，特別是當顆粒很大或濃度很高時，在離心管一側會出現沉淀；③顆粒被擠壓，離心力過大、離心時間過長會使顆粒變形、聚集而失活。細胞器沉降順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內質網與高基體、核蛋白體。差速離心法：LowspeedHighspeed差數離心法Back密度梯度離心法：用具有梯度的介質來替換離心管中密度均一的介質，使介質分為不同的層次，濃度低的在上層，高的在底層。細胞勻漿加在最上層，隨后離心。這樣，不同大小、形態、密度的顆粒，就會以不同的速度向下移動，擊中到不同的區域，可以分別收集。該法的優點是：①分離效果好，可一次獲得較純顆粒；②適應范圍廣，既能分離具有沉淀系數差的顆粒，又能分離有一定浮力密度的顆粒；③顆粒不會積壓變形，能保持顆粒活性，并防止已形成的區帶由于對流而引起混合。缺點：①離心時間較長；②需要制備梯度；③操作嚴格，不宜掌握。

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將離心機轉數換算為相對離心力時，首先，在r標尺上取已知的半徑和在N標尺上取已知的離心機轉數。然后，將這兩點間劃一條直線，在圖中間RCF標尺上的交叉點即為相應的相對離心力數值。注意，若已知的轉數值處于N標尺的右邊，則應讀取RCF標尺右邊的數值；同樣，轉數值處于N標尺左邊，則讀取RCF標尺左邊的數值。半徑相對離心力轉速方法：兩點一線法Back應急雕處理戴：如果波離心曾時發雪現離久心管達破裂蹈，必屠須先佳停止計實驗思，將陸破裂曲管密述封放顯入生乏物垃伐圾桶角，再震用75叼%酒精童進行抽擦拭危消毒添，如始必要廁需用渣移動慘紫外睬燈照妖射30～60分鐘庸后才船能開棚始實凳驗。注意吃事項泳：a）離卵心機蚊應始僻終處斗于水抵平位浙置，蝦與外密接電餅源電掃壓匹彎配，賭并要賞求有烏良好沈的接貴地線貝。b）開問機前蛛應檢貼查機殃腔有板無異鳴物掉枯入。素注意兩事項稀：c）樣特品應窩預先攻平衡聽，使琴用離漫心機倆微量川離心唉時離戀心套鈴管與凳樣品權應同撓時平證衡。d）揮枝發性刑或腐漲蝕性謙液體跟離心庭時，羊應使夕用帶錦蓋的趣離心腰管，跳并確厲保液屑體不屬外漏抄以免概侵蝕批機腔烘或造項成事梅故。e）每色次操戰作完嘩畢，塌應做艱好使枯用情遇況記昂錄，鳥應定憲期對螺機器梯各項砍性能給進行者檢修準。f）離厚心過寄程中對若發未現異擇常現之象，蕉應立鮮即關綢閉電沙源，披報請表有關友技術希人員僅檢修鄉豐。Ba獸ck玉米科黃化啦幼苗蟻線粒融體的際分離坊（整壯個過左程保候持在0-序4℃）1.將玉茶米黃兼化幼顯苗剪油下，厲稱重堡每小獲組約5g，在費冰箱皮中放塘置1小時2.將幼膊苗剪著碎直既接倒賤入研搖缽中蝴以1:牛3(重量導體積法比g:叮ml洪)比例坐加入賽離心唱勻漿辟介質寇，快還速研冷磨，器注意任先加辯入少測許介嬌質液筋，研菜碎后啦將余縮慧液加完入3.用雙駐層尼軌龍網爬過濾申，除世去殘買渣。4.取濾舒液在遼低溫冠高速鄉豐離心接機傷23經00牛rp消m離心10迫mi辛n棄沉變淀5.取上冶清液讀在低挽溫高逆速離鎮心機傲上99鼓50集rp冶m離心10掛mi套n棄上淚清液6.所留朱沉淀敏用勻臘漿介題質液腿洗滌功，以99法50伴rp紙m離心10芹mi鄙n棄上紅清7.將所慰得沉苗淀懸域浮于0.兄5M，ph伏=7礙.2甘露積醇中峰，至暗于冰籍箱備悄用。8.將制聾備的差線粒醋體懸權液滴靠于干圣凈的做載玻蠢片上辭用1%詹納渣斯綠B的0.則25劈燕M蔗糖鎖液（ph饒=7后.4）染設色20抗mi晝n9.加干沫凈的朵蓋玻倡片。嚴鏡檢磚最好宜用相物差顯邀微鏡少，所腫有的時線粒楚體都帖被染何成藍勞綠色斥顆粒色，檢膀驗制嬌備的糧線粒寺體的嘗純度實驗救方法菠菜獨葉葉膝綠體杰的分申離（閣整個御過程殼保持0℃）1取去顛葉脈詞的的炊新鮮受菠菜竊葉5g于研覆缽中售，加娘入0.蟻35徑mo蘭l/蝕L富Na見Cl溶液15漸ml研磨押。注普意開艘始研佩磨時客也是蒸先加繁入少堅許介春質，厭研磨城后加采入余滅液2綠色餓的勻繭漿液籃用尼耐龍網稍過濾任，濾役液分酬別轉檔入兩虧支干墓凈的霧離心襯管中傾，以10艘00歉rp冤m離心4m駛in，除菜去沉賠淀。3上清過液在難高速陸低溫庫離心超機上駱