實驗三

離心技術及物質代謝實驗徐清清實驗內容離心技術鄰甲苯胺法測血糖含量糖酵解中間產物磷酸丙糖的鑒定酶法測定血漿膽固醇（下午）定義：離心技術（Centrifugetechnology）是利用物體高速旋轉時產生強大的離心力，使置于旋轉體中的懸浮顆粒發生沉降或漂浮，從而使某些顆粒達到濃縮或與其他顆粒分離之目的。用途：離心是蛋白質、酶、核酸及細胞亞組分分離的最常用的方法之一。離心技術第一節離心技術的原理

當一個粒子在高速旋轉下會受到離心力F作用，其大小為：

。m：沉降粒子的有效質量

r：粒子的旋轉半徑，單位cmω：粒子旋轉的角速度離心機轉速的表示方法：1.每分鐘轉數RevolutionsPerMinute(rpm)2.相對離心力RelativeCentrifugalForce(RCF)RCF表示實際離心力相當于地球引力的倍數，常用數字乘“g”來表示。

9802rwRCF==FmgRCF=1.119×10-5×(rpm)2rrpm：每分鐘轉數，單位r/ming：重力加速度，約等于980cm/s2ω：單位弧度/秒（rad/s）相對離心力：沉降顆粒在離心管中所處位置也不同，則所受離心力不同。因此在描述超速離心條件時，通常用RCF代替rpm，因為它可以真實地反映顆粒在離心管內不同位置的離心力及其動態變化。

F=m*ω2*r沉降系數定義：沉降速度與離心力加速度的比值，即單位離心場中顆粒的沉降速度，單位為“S”。S=V/ω2r人們規定1S=1×10-13

秒S=V(D-D’)/f

用途：對于某些大分子化合物，當它們的詳細結構和分子量不很清楚時，常常用沉降系數這個概念去描述它們。如核糖體RNA有30S亞基和50S亞基，這里的S就是沉降系數。。第二節離心機的主要類型和構造

工業用離心機離心機制備型離心機實驗用離心機分析型離心機制備性離心機一、制備性離心機的類型：

1.普通離心機2.高速冷凍離心機

3.超速離心機普通離心機高速冷凍離心機超速離心機最大轉速（rpm）600020000～2500050000～80000

超速離心機裝有真空系統，這是它與高速離心機的主要區別.轉頭：包括角式轉頭、蕩平式轉頭、區帶轉頭、垂直轉頭、連續流動轉頭離心管：包括塑料離心管、玻璃離心管、不銹鋼離心管制備性離心機的主要構件：角式轉頭蕩平式轉頭塑料離心管玻璃離心管首先根據待離心液體的性質及體積選用合適的離心管使用各種離心機前，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內容物，對稱放置，不得使用奇數個離心管。離心過程中不得隨意離開若要在低于室溫的溫度下離心時，提前預冷注意最高轉速，不得超速使用。離心操作的注意事項二、慘胰島艘素對江血糖唐含量雙的影沾響及施測定實驗鄰目的估：通過饞實驗挪方法嫁證實忍胰島真素對念血糖嗚含量淚的降混低作趙用，侮即檢懲測家滲兔注享射胰咳島素膏前后篇血糖南濃度別的改形變.掌握景鄰甲獸苯胺眼法測遷定血旱糖濃服度。實驗講原理密：1.胰島灰素降疏血糖睜的機閱理：1)促進配肌肉夕、脂蘭肪組歇織對絲式葡萄母糖的介通透鉤性，劫促進殖葡萄剖糖進微入這獎些細獵胞；2)糖原滔合成斷↑,糖原滿分解隱↓；3)糖有停氧氧略化↑些；4)磷酸拜烯醇影式丙攤酮酸織羧激技酶合飲成↓刃→糖吊異生刪↓；5)激素篇敏感旅性脂拉肪酶斑↓→騙脂肪酷動員任↓。2.鄰甲伏苯胺列法測壟血糖偏含量葡萄圍糖在抱濃酸忙溶液筆中（突加在挎含有潮硼酸享的冰林醋溶碎液中）流，水烏浴辛加熱稱至10朗0℃左右凝，脫腿水生咱成羥停甲基細呋喃甲醛泳（或并稱羥旨甲基板糠醛勸），羅后者暖能與喘鄰甲壇苯胺沖縮合誤生成藍忙綠色獻的化耕合物裂，根房誠據顏銷色深勇淺并肅進行63曠0加nm波長比色舌測定巡壽其含帆量。實驗菠方法1.胰島拉素對墓血糖兔含量臥的影唱響：鳥家兔介注射貼胰島騾素前哪后血糖好含量揮的變蘆化。1）取幸饑餓12小時拉家兔殊一只蝕，記集錄體箏重。2）采迎取血爹標本滋：用紀二甲側苯棉沫球涂敬擦家災兔耳定部，吧使局肯部血態管擴張虧，然姿后用抽刀片縱行鴉切開鐘邊緣櫻耳靜脈錦，讓偏血液殊自然贊滴入試看管中動，收如集約2m盤l，待慮血凝丘固后海，分婦離血面清。3）按沒家兔朗體重吵，皮矮下或倆腹腔羨注射1.催5單位茶／kg胰島慰素，筑記錄注射估時間農，待40分鐘屋后，暮用同澆樣方弓法取犯血，液分離時血清栗。4）將涌注射加胰島晴素前灣后的辟血清來，分鳳別測調定血箭糖含箭量。2.血糖徒含量僚的測煤定：1.1）取發試管雷四支業，按船下表甜操作試劑（ml）

測定管（前）測定管（后)標準管空白管血清（前）血清（后）糖標準蒸餾水鄰甲苯胺試劑0.1－－－4.0－0.1－－4.0－－0.1－4.0－－－0.14.02）混偵勻，利置沸但水浴疊中加規熱10分鐘脂，取彈出立炮即置奴冷水鞋中冷蝕卻．3）用63愈0n少m波長板，以槍空白姿管校輛正吸皇光度骨為0，分鐮別測辱定各伸管吸李光度陰值．4）計兆算：

180目前狼國內披醫院祥多采恐用葡萄刪糖氧嬌化酶欣法和鄰甲蒼苯胺增法測陰定血速糖。葡萄糖氧化酶法鄰甲苯胺法測定血糖優點特異性強、價廉、方法簡單不易出現假性過高或過低,結果較可靠正常值空腹全血為3.6～5.3mM/L空腹全血為3.3～5.6mM/L注意勁問題二甲捷苯能捉擴血卷管但挨是它夠有溶默血的交作用廢，所詞以切體開取載血前策要晾終一會汪。沸水屢浴時逃注意搞安全獨；管毯口朝洋墻，吹防止竟高溫咽濺出插傷到免自己耗。糖酵柿解中壯間產賞物的降鑒定【實驗眨目的】檢測駛糖酵活解中下間產逢物磷泡酸丙祥糖的豪生成雹。【實驗掩原理】3-磷酸甘油醛

磷酸二羥丙酮6-磷酸果糖1,6-二磷酸果糖ADPATP6-磷酸葡萄糖ADPATP葡萄糖3-磷酸甘油醛脫氫酶NAD+1,3-二磷酸甘油酸3-磷酸甘油酸ADPATPNADH+H+丙酮酸酶-S知H+童IC梅H2眉CO松OH衰→酶S-示CH氧2C沖OO炮H+磁HI一碘醋酸一碘醋酸一碘醋酸一碘醋酸一碘醋酸一碘醋酸一碘醋酸一碘醋酸紅棕跑色【實驗嘆方法】取試僻管3支，申編號率，按禮下表帖進行厭操作．記錄冬三管絞所發胳生的威情況象，并奧加以密簡要隊的分福析．CC濤L3CO蟻OH的作棄用：書強酸雁，使蜜糖酵釀解的始全部夸酶失鼓活。一碘徒醋酸偉的作蛇用：通使3-磷酸擱甘油必醛脫點氫酶癥失活惜。硫酸次肼的怪作用開：穩蓮定磷質酸丙枝糖，肅使其豈不向助其它狂方向謙轉變敬。試劑（ml）123pH7.4磷酸鹽緩沖液一碘醋酸硫酸肼10％CCL3COOH酵母液水2.0

0.5

0.51.04.0－2.00.50.5－4.01.02.0－－－4.02.0混勻，在37℃－38℃恒溫水浴中保溫30分鐘一碘醋酸硫酸肼10％CCL3COOH

水－－－2.0

－－1.01.0

0.50.51.0－混勻，靜置10分鐘，離心,3000轉/min,10分鐘，再取三支試管，對號按下表操作上清液1mol/LNaOH

0.50.50.5

0.50.50.5混勻，在室溫放置10分鐘2，4－二硝基苯肼1mol/LNaOH0.53.50.53.50.53.5實驗防注意嫁事項磁：試管臣、移呀液管顫洗干朽凈；加入左的試小劑正局確；混勻流；成腙膨反應玻前，濕溶液枝必須貧先堿緒化并雪在室原溫放努置10蚊mi壇n，目聲的是聚使磷宋酸丙蜂糖中深的磷到酸基菊水解欠脫去愈，生楊成的統顏色近比較選穩定候。血清跑膽固喇醇測療定（犯酶法舍）【實驗辟目的】1.了解為膽固講醇氧搜化酶喂法測鐮定血蝦清膽媽固醇城的原籌理。2.掌握幻玉血清和膽固繼醇測做定的撈臨床杰意義惑。血清腹中總茂膽固楊醇包或括膽患固醇幣酯(C咽E,尖7乒0%攪)和游瓣離型丸膽固封醇(F適C,族3語0%招)。膽瘡固醇噴酯酶辮（CE馳H）先改將膽街固醇夫酯水間解為昂膽固晶醇和貧游離越脂肪磚酸（FF搜A），釋膽固炸醇在膽固諷醇氧劃化酶（CO觀D）的站作用皂下氧誰化生尾成Δ-帳4-膽甾燦烯酮勇和過幟氧化廁氫。爐后者頸經過姨氧化河物酶鏈（PO訂D）催催化與4-氨基潔安替璃比林解（4-約AA染P）和窮酚反構應，們生成撒紅色瓜的醌嘉亞胺隨，其殘顏色嘴深淺適與膽團固醇磨的含沈量呈甚正比銜，在50那0街nm波長緞處測占定吸暮光度生，與驅標準勻管比吊較可寬計算損出血浮清膽鵝固醇忽的含患量。收反應劃式如掏下：【實驗哪原理】1.標本幫：不舌溶血淚的血導清或姜血漿夠標