葉黃顆粒對(duì)視網(wǎng)膜光損傷大鼠及血清游離氨基酸的作用,中醫(yī)眼科論文光化學(xué)損傷是視網(wǎng)膜光損傷中最普遍的一種損傷，其病理經(jīng)過(guò)與年齡相關(guān)性黃斑變性等視網(wǎng)膜變性疾病有很多類似之處，主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的凋亡，是一個(gè)退行性變性經(jīng)過(guò)。氨基酸也是視網(wǎng)膜中一類重要的神經(jīng)遞質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜興奮性氨基酸的過(guò)量可導(dǎo)致興奮毒性作用，引起視網(wǎng)膜神經(jīng)元的死亡。光損傷能夠引起視網(wǎng)膜多種游離氨基酸含量增高，故檢測(cè)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化對(duì)于了解視網(wǎng)膜光損傷的發(fā)病機(jī)制有重要的參考價(jià)值。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)，葉黃素與玉米黃質(zhì)共同構(gòu)成視網(wǎng)膜黃斑色素，且存在于整個(gè)視網(wǎng)膜，是人眼中唯一存在的兩種胡蘿卜素。國(guó)內(nèi)外研究表示清楚:葉黃素與玉米黃質(zhì)均能夠預(yù)防眼睛光損傷。本研究通過(guò)建立大鼠視網(wǎng)膜光損傷模型，在前期重點(diǎn)研究葉黃顆粒(主要含葉黃素和玉米黃質(zhì)，葉黃素與玉米黃質(zhì)的比例為5:1)對(duì)視網(wǎng)膜光損傷的防護(hù)作用及作用機(jī)制基礎(chǔ)上，進(jìn)一步了解葉黃顆粒對(duì)光損傷大鼠視網(wǎng)膜及血清游離氨基酸水平的影響，為將來(lái)研制開(kāi)發(fā)愈加安全、有效、方便的防治視網(wǎng)模光損傷的新制劑，提供新的研究思路及一定的理論根據(jù)。1材料與方式方法1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD大鼠48只，體重190g～230g，8周齡，清潔級(jí)，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào):SYXK(浙)2008－0115)。1．2實(shí)驗(yàn)藥品葉黃顆粒由荷蘭帝斯曼(DSM)公司提供，葉黃顆粒含葉黃素(lutein)含量為10%，玉米黃質(zhì)(zeaxanthin)含量為2%(lutein:zeaxanthin的比例為5:1)，制劑輔料主要為淀粉。1．3實(shí)驗(yàn)分組及給藥將48只大鼠隨機(jī)分為6組，每組8只，分別為:空白對(duì)照組;模型對(duì)照組;陽(yáng)性對(duì)照組;葉黃顆粒低劑量組;葉黃顆粒中劑量組;葉黃顆粒高劑量組。試驗(yàn)前將葉黃顆粒制劑采用蒸餾水配置，灌胃劑量1ml/200gBW，每日1次。試驗(yàn)期間，空白對(duì)照組給予蒸餾水，不光照;模型對(duì)照組給予蒸餾水，接受光照;葉黃顆粒低劑量組給予葉黃顆粒5mg/kgBW，葉黃顆粒中劑量組給予葉黃顆粒25mg/kgBW，葉黃顆粒高劑量組給予葉黃顆粒50mg/kgBW。連續(xù)給藥7d后造模，造模后繼續(xù)給藥7d后，0．3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后，斷髓處死。1．4大鼠視網(wǎng)膜光損傷模型的建立參考Noell等報(bào)導(dǎo)的方式方法，建立大鼠視網(wǎng)膜光損傷動(dòng)物模型。光照箱制備:自制長(zhǎng)(1m)x寬(1m)x高(0．5m)的光照箱，無(wú)面均裝有日光燈管，箱內(nèi)照度經(jīng)數(shù)字式光照度計(jì)(北京師范大學(xué)光電儀器廠產(chǎn)品)測(cè)定為3000lux200lux，箱內(nèi)溫度控制在22℃～25℃。模型制備:所有實(shí)驗(yàn)用大鼠均在12h明(20～50)Lux以及12h暗的循環(huán)光環(huán)境下適應(yīng)7d，實(shí)驗(yàn)組在光照前暗適應(yīng)36h，然后放入光照箱，接受24h持續(xù)光照，光照完成后大鼠置于暗室。光照箱6面放置一根白色冷光源熒光燈管，動(dòng)物可自由飲水和獲得食物。1．5方式方法1．5．1視網(wǎng)膜勻漿的制備大鼠光照后7d，0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后取出眼球，解剖顯微鏡下，于冰臺(tái)上剝?nèi)∈笱垡暰W(wǎng)膜，用濾紙吸去外表液體，加生理鹽水，充分研磨制成10%勻漿，冷凍離心機(jī)離心3500r/min15min，取上清液用作生化檢驗(yàn)。1．5．2大鼠血清的制備大鼠光照后7d，稱重，腹腔注射0．3%戊巴比妥鈉0．2倍體重劑量麻醉，麻醉后眼球取出后，用10ml注射器下腔靜脈取血，置于5mlEppendorf管中靜置2h，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，取上層血清于1．5mlEppendorf管中備用，放入－20℃冰箱中。1．5．3游離氨基酸含量測(cè)定1．5．3．1樣品處理血清樣品:準(zhǔn)確汲取0．6ml血清樣品于1．5ml離心管中，參加0．4ml10%磺基水楊酸溶液，搖勻后，14000r/min離心20min，取上清液過(guò)0．22m濾膜后上機(jī)測(cè)定。視網(wǎng)膜樣品:準(zhǔn)確稱取樣品0．2g左右于1．5ml離心管中，參加1．00ml10%磺基水楊酸溶液，超聲破碎后，14000r/min離心20min，取上清液過(guò)0．22m濾膜后上機(jī)測(cè)定。1．5．3．2儀器參數(shù)氨基酸分析儀采用生理體液分析系統(tǒng)，主要色譜條件:色譜柱采用日立2622陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(PartNO．855－3693)，4．6mm60mm(PartNO．855－4507)，洗脫方式為四梯度洗脫，由計(jì)算機(jī)控制。檸檬酸緩沖液為洗脫液，流速0．35ml/min，茚三酮為顯色劑，顯色劑溶液流速0．3ml/min。以570nm和440nm波長(zhǎng)同時(shí)檢出，樣品分析周期148min;進(jìn)樣體積20l，數(shù)據(jù)由計(jì)算機(jī)處理。1．6統(tǒng)計(jì)方式方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x珋s表示，用SPSS1310軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間比擬用單因素方差分析，兩組間比擬采用最小顯著差異法Studentst－test檢驗(yàn)，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2．1葉黃顆粒對(duì)大鼠視網(wǎng)膜游離氨基酸含量的影響光照后7d，本實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)分析了視網(wǎng)膜包括牛磺酸在內(nèi)的20種游離氨基酸。模型對(duì)照組及各治療組大鼠視網(wǎng)膜中Glu、Asp、Gly、GABA、Tau5種神經(jīng)遞質(zhì)類游離氨基酸含量均升高，模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比擬，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01);與模型對(duì)照組比擬，葉黃素顆粒高、中、低劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組含量有不同程度降低，大部分差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05或P＜0．01)。其余Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Lys、His、Arg、Ser、Ala、Cit、Cys、Tyr及Orn15種必需和非必需氨基酸，模型對(duì)照組及各治療組大鼠視網(wǎng)膜中其含量也均升高，模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比擬，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05或P＜0．01);與模型對(duì)照組比擬，葉黃素顆粒高、中劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組中上述15種氨基酸(Orn除外)含量有不同程度降低，大部分差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05或P＜0．01)，低劑量組有降低趨勢(shì)，但大部分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);各治療組與模型對(duì)照組比擬，Orn含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)(表1，表2)。2．2葉黃顆粒對(duì)大鼠血清游離氨基酸含量的影響光照后7d，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)還檢測(cè)分析了大鼠血清中上述20種游離氨基酸。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表示清楚，各組間20種氨基酸含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)(表3，表4)。3討論氨基酸不僅僅是生物體中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，它們?cè)谏窠?jīng)系統(tǒng)中還發(fā)揮著某些重要的生理功能，氨基酸是視網(wǎng)膜中一類重要的神經(jīng)遞質(zhì)。根據(jù)其對(duì)中樞神經(jīng)元的不同可分為:興奮性氨基酸和抑制性氨基酸。Glu、Asp、GABA、Gly均為經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)，且屬氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)。Glu、Asp是主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，GABA、Gly則是主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。研究證實(shí)，Glu是包括光感受器細(xì)胞、雙極細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在內(nèi)的視信號(hào)傳導(dǎo)通路的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，Asp在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也是主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在神經(jīng)元損傷等生理病理經(jīng)過(guò)中起關(guān)鍵作用。GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，調(diào)節(jié)和控制正常的生理功能。正常情況下，視網(wǎng)膜中GABA刺激GABA受體而阻斷Glu的興奮毒性，使視網(wǎng)膜的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)保持平衡。Tau是視網(wǎng)膜中含量最高的氨基酸，幾乎占視網(wǎng)膜中游離氨基酸的50%，Tau在維護(hù)視網(wǎng)膜的構(gòu)造和功能上具有重要作用。華而不實(shí)之一就是保衛(wèi)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞免受光化學(xué)損傷，其次Tau對(duì)Glu誘發(fā)的去極化現(xiàn)象有抑制作用，并在一定程度上拮抗谷氨酸引起的鈣離子內(nèi)流。故測(cè)定這些氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量變化對(duì)于視網(wǎng)膜系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)理有極其重要的參考價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)光損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)遞質(zhì)類游離氨基酸含量升高，其余的氨基酸如蘇氨酸，絲氨酸等15種被檢測(cè)的視網(wǎng)膜游離氨基酸含量也有不同程度的升高。同時(shí)發(fā)如今急性的光損傷下，血清中的游離氨基酸含量未見(jiàn)明顯升高，各組間比擬未見(jiàn)顯著性差異。葉黃顆粒能夠降低光損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)遞質(zhì)類游離氨基酸水平，高劑量組更明顯。葉黃顆粒中葉黃素和玉米黃質(zhì)在構(gòu)造上互為同分異構(gòu)體，分子構(gòu)造中的含有40個(gè)碳原子的長(zhǎng)鏈，華而不實(shí)有多個(gè)共軛雙鍵，使其具有較強(qiáng)的復(fù)原性和去除自由基的能力，具有較強(qiáng)的抗氧化作用。Bone等的研究表示清楚，人體內(nèi)的視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜等處還存在一種玉米黃質(zhì)的同分異構(gòu)體稱為內(nèi)消旋玉米黃質(zhì)(meso－zeaxanthin)，而其淬滅單線態(tài)氧的能力比葉黃素要強(qiáng)。可能是葉黃素和玉