熒光分析法詳解演示文稿目前一頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/81（優選）熒光分析法目前二頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/82§3-1概述分子發光

某些物質的分子吸收一定能量躍遷到較高的電子激發態后，在返回電子基態的過程中伴隨有光輻射的現象。光致發光

物質因吸收光能而激發發光的現象。熒光

當紫外光照射到某些物質的時候，這些物質會發射出各種顏色和不同強度的可見光，而當紫外線停止照射時，所發射的光線也隨之很快地消失，這種光線——熒光。目前三頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/83發展史理論：第一次記錄熒光現象：1575年，西班牙內科醫生、植物學家莫納德斯(N.Monardes)提到：一種木頭切片的水溶液呈“可愛的天藍色”。17世紀，波義爾(Boyle)和牛頓(Newton)等再次觀察到熒光現象并給予了更詳細的描述。1852年，斯托克斯(G.G.Stokes)用分光光度計考察奎寧和葉綠素時發現：λ吸<λ熒（斯托克斯定則），所以判斷熒光是先吸光再發光，即熒光是發射光。并且根據發熒光的礦物“螢石”→熒光。此外他還研究了熒光強度與濃度之間的關系；描述了高濃度時及有外來物質存在時的熒光猝滅現象。他也是第一個提出應用熒光作分析手段的人。目前四頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/841867年，瑞士，高貝爾斯萊德(F.Goppelsr?der)進行了首次的熒光分析工作，應用鋁-桑色素配合物的熒光進行鋁的測定。1880年，萊伯曼(Liebeman)提出了最早關于熒光與化學結構關系的經驗法則。19世紀末，人們已經知道了600種以上的熒光化合物。20世紀以來，熒光現象的研究就更多了：1905年，伍德(Wood)發現共振熒光。1914年，弗蘭克(Frank)和赫茲(Hertz)利用電子沖擊發光進行定量研究。1922年，Wawillous進行熒光產率的絕對測定。1926年，蓋維奧拉(Gaviola)進行了熒光壽命的直接測定。……目前五頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/85儀器：19世紀前，熒光觀察靠肉眼。1928年，哲蒂(Jette)和維斯特(West)研制出第一臺光電熒光計。如今，已有各式各樣新型的熒光分析儀問世。熒光分析已成為一種十分重要且有效的光譜分析手段目前六頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/86§3-2熒光分析基本原理一、熒光和磷光的產生發光

室溫下，大多數分子處在基態的最低振動能層。處于基態的分子吸收能量(電能、熱能、化學能或光能等)后被激發，躍遷到激發態，激發態不穩定，分子將很快衰變到基態。若返回到基態時伴隨著光子的輻射，這種現象稱為“發光”。目前七頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/87

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原理：1.分子能級每個分子具有一系列嚴格分立的能級，稱為電子能級，而每個電子能級中又包含一系列的振動能層和轉動能層。So：基態S1:第一電子激發單重態S2:第二電子激發單重態T1:第一電子激發三重態T2:第二電子激發三重態

ν=0,1,2,3…振動能層圖3.1熒光和磷光體系能級圖目前八頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/882.電子激發多重度M

s:電子自旋量子數代數和，數值為0或1。單重態分子軌道中的電子都是自旋配對的,自旋方向相反.s=0，M=1用符號S表示三重態電子躍遷過程中伴有自旋方向的改變s=1，M=3用符號T表示目前九頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/893.分子去活化處在激發態的分子是不穩定的，它可能通過輻射躍遷和非輻射躍遷等去活化過程返回基態，其中以速度最快、激發態壽命最短的途徑占優勢。有以下幾種基本的去活化過程。振動馳豫內轉換熒光發射系間跨越磷光發射外轉換目前十頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/810振動馳豫當分子吸收光輻射后可能從基態的最低振動能層S0(ν=0)躍遷到激發態Sn(ν=i)的較高的振動能層上去。然而在液相或壓力足夠高的氣相中，分子間碰撞的幾率很大，激發態分子可能將過剩的振動能量以熱的形式傳遞給周圍的分子，而自身從Sn或Tn的高振動能層(ν=i)失活到該電子能級的最低振動能層(ν=0)上，這一過程稱為振動弛豫（振動松弛）。時間10-12sSn或Tn的νi→

ν0

，即各振動能級間的小箭頭。目前十一頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/811圖3.1熒光和磷光體系能級圖目前十二頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/812內轉換相同多重度等能態間的一種無輻射躍遷過程稱為內轉換。當兩個相同多重度電子能級的振動能層間有重疊時，則可能發生電子由高能層電子激發態以無輻射躍遷方式躍遷到低能層的電子激發態。如由S2→S1

，T2→T1。時間10-13-10-11s分子最初無論在哪一個激發單重態，都能通過振動弛豫和內轉換到達最低激發單重態(或三重態)的最低振動能層上。目前十三頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/813圖3.1熒光和磷光體系能級圖目前十四頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/814熒光發射當分子處于單重激發態的最低振動能級S1(ν=0)時，發射一個光子返回基態S0(ν=i)，這一過程稱為熒光發射。由于溶液中振動弛豫效率很高，它在熒光發射之前和發射之后都可能發生。因此發射熒光的能量比分子所吸收的能量要小，即熒光的特征波長比它所吸收的特征波長要長。時間10-9-10-7s熒光多為S1→

S0

躍遷。目前十五頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/815圖3.1熒光和磷光體系能級圖目前十六頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/816系間跨越不同多重度狀態間的一種無輻射躍遷過程稱為系間跨越。它涉及受激電子自旋狀態的改變。如S1→T1，使原來兩個自旋配對的電子不再配對，這種躍遷一般是禁阻的。但如果兩個不同多重度電子能態的振動能層有較大的重疊時則可能通過自旋—軌道耦合等作用使其實現。目前十七頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/817圖3.1熒光和磷光體系能級圖目前十八頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/818磷光發射當從單重態到三重態的分子系間跨越躍遷發生后，接著發生快速的振動弛豫而到達三重態的最低振動能層上，當沒有其他過程同它競爭時，分子將發生磷光躍遷回基態，這一過程稱為磷光發射。熒光與磷光的根本區別是：熒光：由激發單重態最低振動能層至基態各振動能層的躍遷產生。磷光：由激發三重態最低振動能層至基態各振動能層的躍遷產生的。E熒>E磷，λ熒<λ磷時間10-4-10s目前十九頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/819圖3.1熒光和磷光體系能級圖目前二十頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/820外轉換激發分子通過與溶劑或其他溶質分子間的相互作用和能量轉換，使熒光或磷光強度減弱甚至消失的過程稱外轉換。這一現象稱為“熄滅”或“猝滅”。由較低的激發單重態及較低的三重態的非輻射躍遷可包含外轉換，也可包含內轉換。目前二十一頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/821圖3.1熒光和磷光體系能級圖目前二十二頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/822二、激發光譜和發射光譜

任何熒光(磷光)化合物都具有兩個特征光譜：激發光譜和發射光譜。它們是熒光(磷光)定性和定量分析的基本參數和依據。激發光譜選擇：熒光和磷光都是光致發光，因此必須選擇合適的激發光波長，這可從它們的激發光譜曲線來確定。繪制：固定測量波長（選熒光/磷光的最大發射波長），改變激發光的波長，測量熒光強度的變化，以激發光波長為橫坐標、熒光強度為縱坐標作圖，即得到熒光(磷光)化合物的激發光譜。目前二十三頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/823激發光譜的形狀與吸收光譜的形狀極為相似，經校正后的真實激發光譜與吸收光譜不僅形狀相同，而且波長位置也一樣。這是因為物質分子吸收能量的過程就是激發過程。發射光譜：熒(磷)光光譜繪制：將激發光波長固定在最大激發波長處，然后掃描發射波長，測定不同發射波長處的熒(磷)光強度，即得到熒(磷)光發射光譜。例：圖3.2為萘的激發光譜、熒光發射光譜和磷光發射光譜。熒光發射光譜顯示了若干普遍的特性：目前二十四頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/824Stokes位移在溶液中，分子熒光的發射相對于吸收位移到較長的波長，稱為Stokes位移。這是由于受激分子通過振動弛豫而失去振動能，也由于溶液中溶劑分子與受激分子的碰撞，也會有能量的損失。因此在激發和發射之間產生了能量損失。圖3.2萘的激發光譜I、熒光II和磷光光譜III激發/吸收光譜磷光光譜熒光光譜目前二十五頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/825熒光發射光譜的形狀與激發波長無關。這是因為分子吸收了不同能量的光子可以由基態激發到幾個不同的電子激發態，而具有幾個吸收帶。由于較高激發態通過內轉換及振動弛豫回到第一電子激發態的速率是很高的，遠大于由高能激發態直接發射光子的速率。故在熒光發射時，不論用哪一個波長的光激發，電子都是從第一電子激發態的最低振動能層返回到基態的各個振動能層，所以熒光發射光譜與激發波長無關。目前二十六頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/826鏡像規則

熒光發射光譜和它的吸收光譜呈鏡像對稱關系。吸收光譜是物質分子由基態激發至第一電子激發態的各振動能層所致。其形狀決定于第一電子激發態中各振動能層的分布情況。熒光光譜是激發分子從第一電子激發態的最低振動能層回到基態中各不同能層所致。所以熒光光譜的形狀決定于基態中各振動能層的分布情況?；鶓B中振動能層的分布和第一電子激發態中振動能層的分布的情況是類似的，因此熒光光譜的形狀和吸收光譜極為相似。目前二十七頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/827圖3.3蒽的乙醇溶液的熒光光譜（右）和吸收光譜（左）ν=014321432ν=0S1S0目前二十八頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/828三、熒光和分子結構的關系

分子產生熒光必須具備兩個條件：

(i)分子必須具有與所照射的輻射頻率相適應的結構，才能吸收激發光。

(ii)吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，必須具有一定的熒光量子產率。思考：什么樣結構的物質會發生熒光？化學結構上的改變對物質熒光強度和熒光光譜有什么樣的影響？目前二十九頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/829熒光量子產率:它表示物質發熒光的能力許多吸光物質并不能發熒光，因為在激發態分子釋放激發能的過程中除熒光發射外，還有許多上面提到的輻射和非輻射的躍遷過程與之競爭。熒光的量子產率與上述的每個過程的速率常數有關。表達式如下熒光發射過程的速率常數其他有關的過程速率常數總和凡是可以使升高，降低的因素都可以增強熒光主要決定于化學結構，主要決定于化學環境，也與化學結構有關。目前三十頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/830躍遷類型實驗表明，大多數熒光化合物都是由π→π＊或ｎ→π＊躍遷激發，然后經過振動弛豫或其他無輻射躍遷，再發生π＊→π或π＊→ｎ躍遷而產生熒光，其中π＊→π的躍遷的量子效率較高。此外，在π＊→π躍遷過程中，通過系間跨越躍遷至三重態的速率常數也較小，也有利于熒光的發射。共軛效應含有π→π＊躍遷能級的芳香族化合物的熒光最強。這種體系中的π電子共軛度越大，則π電子非定域性越大，越易被激發，熒光也就越易發生，而且熒光光譜將隨共軛程度的增加向長波移動。目前三十一頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/831絕大多數能發生熒光的物質含有芳香環或雜環。任何有利于提高π電子共軛度的結構改變都將提高熒光效率，并使熒光波長向長波方向移動。剛性平面結構實驗發現多數具有剛性平面結構的有機分子具有強烈的熒光。因為這種結構可以減少分子的振動，使分子與溶劑或其他溶質分子的相互作用減小，減少了碰撞去活的可能性。酚酞熒光素無熒光強熒光氧橋目前三十二頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/832取代基效應芳香族化合物苯環上的不同取代基對該化合的熒光強度和熒光光譜有很大的影響。給電子基團，如-0H、-OR、-NH2、-CN、-NR2等，使熒光增強。吸電子基團，如-COOH、-C=O、-NO2、-NO、鹵素離子等，會減弱甚至猝滅熒光。如果將一個高原子序數的原子引入到π電子體系中，往往會增強磷光而減弱熒光?！爸卦有薄黾酉甸g跨越速率所致。目前三十三頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/833如，鹵代苯中雙取代和多取代物對非定域π電子激發的影響較難預測。但若能增加分子的平面性，例如取代基之間能形成氫鍵，則熒光增強；反之，則熒光減弱。溴苯無熒光氟苯氯苯碘苯目前三十四頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/834四、溶液的熒(磷)光強度熒光強度與溶液濃度的關系熒光量子產率熒光強度If與溶液濃度c的關系：根據Beer定律，經推導可得：當I0和

一定時：吸收的光量線性關系成立條件目前三十五頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/835影響熒光強度的因素溶劑：溶劑效應和特殊溶劑效應。溶劑效應：溶劑的折射率和介電常數的影響。普遍存在。溶劑對光的散射和折射。溶劑極性增大，對激發態的穩定作用增強，使熒光強度增加，光譜紅移。特殊溶劑效應：熒光體和溶劑分子間的特殊化學作用。如氫鍵的生成和化合作用。對熒光光譜的強度和形狀影響大。溫度：敏感，影響大。下降：碰撞失活幾率減小，有利于熒光產生。分析時要控制好溫度。目前三十六頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/836溶液pH值：帶有酸性或堿性官能團的大多數芳香族化合物的熒光一般都與溶液的pH有關。影響分子的存在形式。如，苯胺：pH7-12，分子形式，藍色熒光

pH<2或pH>13，離子形式，無熒光金屬離子與有機試劑形成的發光螯合物也受到溶液pH的影響。影響螯合物的形成和組成。如，鎵與2,2’-二羥基偶氮苯的螯合物：

pH3-4，1:1螯合物，有熒光

pH6-7，1:2螯合物，無熒光目前三十七頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/837內濾光作用和自吸收現象：內濾光作用：溶液中若存在著能吸收激發或熒光物質所發射光能的物質，就會使熒光減弱，這種現象稱為內濾光作用。如，1μg·cm-3的色氨酸溶液中，如有K2Cr2O7存在，由于色氨酸的激發和發射峰附近正好是K2Cr2O7的兩個吸收峰，K2Cr2O7吸收了色氨酸的激發能和發射的熒光，使測得的色氨酸熒光大大減弱。自吸收現象：內濾光作用的另一種情況是熒光物質的熒光發射光譜的短波長一端與該物質的吸收光譜的長波長一端有重疊，在溶液濃度較大時一部分熒光發射被自身吸收，這種現象稱為自吸收。目前三十八頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/838溶液的熒光猝滅熒光物質分子與溶劑分子或其他溶質分子的相互作用引起熒光強度降低的現象稱為熒光猝滅。能引起熒光強度降低的物質稱為熒光猝滅劑。猝滅形式：碰撞猝滅靜態猝滅（組成化合物的猝滅）轉入三重態的猝滅發生電子轉移反應的猝滅熒光物質的自猝滅目前三十九頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/839§3-3熒光分析儀結構圖3.4熒光分析儀基本部件示意圖目前四十頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/840由光源發出的光經第一單色器得到所需要的激發光波長。激發光通過樣品池后，由于一部分光能被熒光物質吸收，其透射光強度將減弱。熒光物質被激發后，將發射熒光。為了消除入射光（透射光）和散射光的影響，熒光的測量通常在與激發光成直角的方向上進行。為消除可能共存的其他光線的干擾，如由激發光所產生的反射光、Rayleight(瑞利)散射光和Raman(拉曼)光，以及為將溶液中雜質所發生的熒光濾去，以獲得所需要的熒光，在樣品池和檢測器之間設置了第二單色器。得到的熒光作用于檢測器上，得到相應的電信號，經放大后再記錄下來。目前四十一頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/841組成激發光源：在紫外—可見區范圍，常用的光源是氙燈和高壓汞燈。樣品池：熒光用的樣品池須用低熒光的材料制成，通常用石英，形狀以方形和長方形為宜。單色器：較精密的熒光分光光度計均采用光柵，有兩個：第一單色器用于選擇激發波長；第二單色器用于分離出熒光發射波長。檢測器：熒光的強度通常比較弱，因此要求檢測器具有較高的靈敏度。一般由光電管或光電倍增管作檢測器，并與激發光成直角。目前四十二頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/842§3-4熒光分析方法及應用熒光分析方法的特點靈敏度高與紫外—可見分光光度法比較，熒光是從入射光的直角方向檢測。即，在黑背景下檢測熒光的發射。所以靈敏度要比紫外—可見分光光度法高2～4個數量級。它的測定下限在0.1～0.001μg·cm-3之間。目前四十三頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/843實際工作中用相對靈敏度表示。(i)以喹寧在0.05mol·dm-3H2SO4溶液中的熒光強度為標準，定為1。然后與相同濃度熒光物質的熒光強度進行比較，即可求得該物質的相對靈敏度。(ii)水的拉曼光信噪比表示。選擇性強熒光法既能依據特征發射，又能依據特征吸收來鑒定物質。假如某幾個物質的發射光譜相似，可以從激發光譜的差異把它們區分開來；而如果它們的吸收光譜相同，則可用發射光譜將其區分。目前四十四頁\總數五十一頁\編于二十三點2023/5/844試樣量少和方法簡便提供比較多的物理參數提供：激發光譜和發射光譜以及熒光強度、熒光效率、熒光壽命等許多物理參數。這些參數反映了分子的各種特性，能從不同角度提供被研究分子的信息。熒光分析方法的