生物分離工程第四章-沉淀分離法第一頁，共40頁。

大部分工業(yè)生物分離的第一步往往是將不溶物質(zhì)從發(fā)酵液中除去。這些不溶性固體的濃度和顆粒大小的變化范圍很寬。濃度可高達(dá)每單位體積含60%的不溶性固體，又可低至每單位體積僅含0.1%。粒徑的變化可以從直徑約為1um的微生物，到直徑為1mm的不溶性物質(zhì)。

對于這些濃度較小，粒徑較大，硬度較強(qiáng)的不溶物，我們可以采用過濾方法分離。而有些發(fā)酵液，使用助濾劑有利于過濾分離，而還有一些發(fā)酵液則不行。第二頁，共40頁。問題固液分離：第一選擇為過濾，過濾技術(shù)難處理的發(fā)酵液如何處理？第二選擇離心分離。第三頁，共40頁。離心法與過濾法的比較比較項(xiàng)目濃縮物設(shè)備經(jīng)濟(jì)適用性處理量應(yīng)用范圍離心法懸浮液或漿體需專用設(shè)備成本高小實(shí)驗(yàn)室范圍過濾法濾餅不需專用設(shè)備成本低大實(shí)驗(yàn)室工業(yè)范圍第四頁，共40頁。

離心分離原理

離心力：

Stock’sForce(粘滯吃力)：離心沉降速度：分離因子定義Fr：離心力/重力加速度(g)的比值意義：衡量離心設(shè)備的離心程度的重要技術(shù)參數(shù)，用于離心機(jī)的分類第五頁，共40頁。 離心技術(shù)分類按分離因子Fr分類1)、常速離心機(jī)Fr<3,000g 三足沉降式:500-1000g 螺旋卸料式：1200-3000g2)、中速離心機(jī)，F(xiàn)r=3,000—5,000g 多室離心機(jī)：2000-8000g 碟片式離心機(jī)：3000-10000g3)、高速離心機(jī)，F(xiàn)r=5,000—20,000g 多室離心機(jī)：2000-8000g 碟片式離心機(jī)：3000-10000g 管式離心機(jī)：>8000-15000g4)、超速離心機(jī)，F(xiàn)r=20,000—1,000,000g第六頁，共40頁。二、沉淀分離法

（一）概述定義——利用某種沉淀劑使目標(biāo)產(chǎn)物或雜質(zhì)的溶解度降低而形成無定形固體沉淀的過程

與結(jié)晶聯(lián)系

在本質(zhì)上都是新相析出的過程，主要是物理變化，當(dāng)然也存在化學(xué)反應(yīng)的沉淀或結(jié)晶。區(qū)別

結(jié)晶為同類分子或離子以有規(guī)則排列形式析出，沉淀為同類分子或離子以無規(guī)排列形式析出。第七頁，共40頁。2、類型鹽析沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法等電點(diǎn)沉淀法高分子聚合物沉淀法金屬離子沉淀法第八頁，共40頁。沉淀法操作步驟在經(jīng)過濾或離心后的樣品中加入沉析劑；沉淀物的陳化，促進(jìn)晶體生長；離心或過濾，收集沉淀物；沉淀分離的目的：（1）通過沉淀使目標(biāo)成分濃縮和去除雜質(zhì)；（2）通過沉淀將已經(jīng)純化的產(chǎn)物由液態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)，便于保存和進(jìn)一步加工。沉淀法用于分離純化應(yīng)該是是有選擇性的，即有選擇地沉淀雜質(zhì)或有選擇地沉淀所需成分。第九頁，共40頁。沉淀法的優(yōu)點(diǎn)：

設(shè)備簡單、成本低、原材料易得、便于小批量生產(chǎn)，在產(chǎn)物濃度愈高的溶液中沉淀越有利，收率越高；沉淀法的缺點(diǎn)：所得沉淀物可能聚集有多種物質(zhì)，或含有大量的鹽類，或包裹著溶劑，所以沉淀法所得的產(chǎn)品純度通常都比結(jié)晶法低，過濾也較困難。應(yīng)用沉淀技術(shù)分離生化產(chǎn)物的典型例子是蛋白質(zhì)(酶)的分離提取，無論是實(shí)驗(yàn)室規(guī)模還是工業(yè)生產(chǎn)，沉淀法都得到了普遍應(yīng)用,工業(yè)上利用蛋白質(zhì)溶解度之間的差異從天然原料如血漿、微生物抽提液、植物浸出液和基因重組菌中分離蛋白質(zhì)混合物已有50多年的歷史了。第十頁，共40頁。沉淀法分離蛋白質(zhì)的特點(diǎn)有：1在生產(chǎn)的前期就可使原料液體積很快地減小10～50倍，,從而簡化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)費(fèi)用；2使中間產(chǎn)物保持在一個中性溫和的環(huán)境；3可及早地將目標(biāo)蛋白從其與蛋白水解酶混合的溶液中分離出來、避免蛋白質(zhì)的降解，提高產(chǎn)物穩(wěn)定性；4用蛋白質(zhì)沉淀法作為色譜分離的前處理技術(shù)，可使色譜分離使用的限制因素降到最低。第十一頁，共40頁。（二）鹽析沉淀法

定義——在高濃度中性鹽存在下，使目標(biāo)產(chǎn)物的溶解度降低而產(chǎn)生沉淀的過程第十二頁，共40頁。2.鹽析原理首先需要了解蛋白質(zhì)的特性：是高分子兩性電解質(zhì)，主要由疏水性不同的氨基酸組成，蛋白質(zhì)表面由不均勻分布的荷電基團(tuán)形成荷電區(qū)、親水區(qū)和疏水區(qū)構(gòu)成。大部分蛋白質(zhì)溶于水，是以親水膠體的形式或大分子溶液存在的。第十三頁，共40頁。蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性電荷穩(wěn)定性：兩性電解質(zhì)，由于靜電斥力的作用，分子間相互排斥，形成穩(wěn)定的分散系空間穩(wěn)定性：蛋白質(zhì)周圍形成水化膜，保護(hù)了蛋白質(zhì)粒子，避免了相互碰撞，形成穩(wěn)定的膠體溶液。

可以通過降低蛋白質(zhì)周圍的水電層和雙電層厚度降低蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性而使蛋白質(zhì)沉淀。第十四頁，共40頁。鹽析示意圖破壞水化層中和電荷第十五頁，共40頁。3.鹽析過程當(dāng)中性鹽加入蛋白質(zhì)分散體系時(shí)可能出現(xiàn)以下兩種情況：（1）“鹽溶”現(xiàn)象—低鹽濃度下，蛋白質(zhì)溶解度增大（2）“鹽析”現(xiàn)象—高鹽濃度下，蛋白質(zhì)溶解度隨之下降，原因如下：A.無機(jī)離子與蛋白質(zhì)表面電荷中和，形成離子對，部分中和了蛋白質(zhì)的電性，使蛋白質(zhì)分子之間的排斥力減弱，從而能夠相互靠攏；B.中性鹽的親水性大，使蛋白質(zhì)脫去水化膜，疏水區(qū)暴露，由于疏水區(qū)的相互作用導(dǎo)致沉淀；第十六頁，共40頁。離子強(qiáng)度對鹽析過程的影響鹽析沉淀平衡式（Cohn經(jīng)驗(yàn)公式）S—蛋白質(zhì)溶解度，mol/L;I—離子強(qiáng)度c:離子濃度；Z：離子化合價(jià)β，Ks—常數(shù)第十七頁，共40頁。β和Ks的物理意義β—截距常數(shù),與鹽的種類無關(guān)，但與蛋白質(zhì)的種類、溫度和pH值有關(guān)。(β=logS0)Ks—鹽析常數(shù)，與溫度、pH值無關(guān)，與蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽的種類有關(guān)。第十八頁，共40頁。經(jīng)驗(yàn)方程的圖示第十九頁，共40頁。在一定的pH值及溫度條件下，改變鹽的濃度(即離子強(qiáng)度)達(dá)到沉淀的目的，稱為“Ks”分級鹽析法。（Ks鹽析：固定pH，溫度，改變鹽濃度）2.在一定的離子強(qiáng)度下，改變?nèi)芤旱膒H值及溫度，達(dá)到沉淀的目的，稱為“β”分級鹽折法。（β鹽析：固定離子濃度，改變pH，溫度）由于蛋白質(zhì)對離子強(qiáng)度的變化非常敏感，易產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，因此常用于提取液的前處理。一般粗提蛋白時(shí)常用第1種方法，進(jìn)一步分離純化時(shí)常用第2種方法。鹽析法分為兩種類型第二十頁，共40頁。4、鹽析劑的選擇鹽析劑的條件鹽析作用要強(qiáng)：鹽析能力—陰離子＞陽離子；高價(jià)陰離子＞低價(jià)陰離子有較大的溶解度，且溶解度受溫度的影響盡可能小。鹽析用鹽必須是惰性的，不致影響蛋白質(zhì)等生物分子的活性，最好不要引入不易分離的雜質(zhì)。來源豐富、經(jīng)濟(jì)常用鹽析劑—(NH4)2SO4、Na2SO4、磷酸鹽、檸檬酸鹽等。最常用(NH4)2SO4

優(yōu)點(diǎn)：符合上述要求；缺點(diǎn)：水解后溶液pH降低，在高pH下產(chǎn)氨，腐蝕性強(qiáng)，有異味，有毒，終產(chǎn)物必須除盡。次常用Na2SO4。缺點(diǎn)：在40度以下溶解度較低，因此主要用于熱穩(wěn)定蛋白。第二十一頁，共40頁。陰陽離子鹽析效果陰離子鹽析效果：檸檬酸＞PO43-＞SO42-＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-陽離子鹽析效果：NH4+＞K+＞Na+＞高價(jià)陽離子第二十二頁，共40頁。5、影響鹽析的因素溶質(zhì)分子種類的影響：Ks和β值溶質(zhì)濃度的影響：蛋白質(zhì)濃度大，鹽的用量小，但共沉作用明顯，分辨率低； 蛋白質(zhì)濃度小，鹽的用量大，分辨率高；pH值：影響蛋白質(zhì)表面凈電荷的數(shù)量，通常調(diào)整體系pH值，使其在pI附近；鹽析溫度：大多數(shù)情況下，高鹽濃度下，溫度升高，其溶解度反而下降；第二十三頁，共40頁。6、鹽析沉淀法的特點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：成本低、無需專門的設(shè)備、易于操作、安全性高、不會引起生物物質(zhì)變性失活、適用范圍廣；缺點(diǎn)：通常選擇性不好（非蛋白的雜質(zhì)夾帶沉淀很少），往往有共沉淀產(chǎn)物，一般作為粗提純操作，還需要與其它分離方法聯(lián)合使用。鹽份含量高。第二十四頁，共40頁。（三）有機(jī)溶劑沉淀法

定義——在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出。沉淀機(jī)理（1）降低了水溶液的介電常數(shù)，使溶質(zhì)之間的靜電引力增加，從而出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，導(dǎo)致沉淀。（2）由于有機(jī)溶劑的水合作用，降低了自由水的濃度，降低了親水溶質(zhì)表面水化層的厚度，降低了親水性，導(dǎo)致脫水凝聚。（3）有機(jī)溶劑的加入會破壞蛋白質(zhì)的某種鍵如氫鍵，使其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某種程度的變化，疏水基團(tuán)暴露并與有機(jī)溶劑疏水基團(tuán)結(jié)合形成疏水層第二十五頁，共40頁。有機(jī)溶劑中的蛋白質(zhì)沉淀有機(jī)溶劑沉淀分離的原理示意圖第二十六頁，共40頁。3、有機(jī)溶劑的選擇介電常數(shù)小，沉淀作用強(qiáng)對生物分子的變性作用小與水互溶安全、無毒、價(jià)廉、易回收等#常用有機(jī)溶劑為：甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇第二十七頁，共40頁。常用的有機(jī)溶劑沉析劑乙醇（濃度>60%）：沉析作用強(qiáng)，揮發(fā)性適中，無毒常用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮（濃度40-50%）：沉析作用更強(qiáng)，用量省，但毒性大，應(yīng)用范圍不廣；特點(diǎn)：介電常數(shù)小，60%乙醇的介電常數(shù)是48 40-50%丙酮的介電常數(shù)是22容易獲取第二十八頁，共40頁。4.有機(jī)溶劑沉淀的特點(diǎn)分辨率高；溶劑容易分離，并可回收使用；產(chǎn)品潔凈（有機(jī)溶劑易祛除）；容易使蛋白質(zhì)等生物大分子變性失活；應(yīng)注意在低溫下操作；成本高第二十九頁，共40頁。溫度：低溫有利于防止溶質(zhì)變性；有利于提高收率（溶解度下降）；一般在0℃以下，操作時(shí)在冰鹽浴中進(jìn)行。攪拌速度：散熱溶液pH值：通常選在等電點(diǎn)附近離子強(qiáng)度:離子強(qiáng)度低有利于沉析，鹽濃度一般在0.01~0.05mol/L生物樣品濃度:蛋白質(zhì)溶液的起始濃度0.5~2%，粘多糖起始濃度1~2%為宜。 稀：溶劑用量大，回收率低，但共沉淀作用小 濃：節(jié)省溶劑用量，共沉作用強(qiáng)，分辨率低金屬離子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+5、有機(jī)溶劑沉淀過程的影響因素第三十頁，共40頁。（四）等電點(diǎn)沉淀法定義—調(diào)節(jié)體系pH值，使兩性電解質(zhì)的溶解度下降，析出的操作稱為等電點(diǎn)沉淀。沉淀機(jī)理—蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，當(dāng)溶液pH值處于等電點(diǎn)時(shí)，分子表面凈電荷為0，雙電層和水化膜結(jié)構(gòu)被破壞，由于分子間引力，形成蛋白質(zhì)聚集體，進(jìn)而產(chǎn)生沉淀。鹽離子的影響—使蛋白質(zhì)的實(shí)際等電點(diǎn)發(fā)生“漂移”，pI偏離（±0.5）與陽離子結(jié)合，pI升高與陰離子結(jié)合，pI降低第三十一頁，共40頁。4、特點(diǎn)沉淀?xiàng)l件溫和；不引入新的物質(zhì)；沉淀效果差。由于在等電點(diǎn)附近，溶質(zhì)仍然有一定的溶解度，等電點(diǎn)沉淀法往往不能獲得高的回收率，因此等電點(diǎn)沉淀法通常與鹽析、有機(jī)溶劑沉淀法聯(lián)合使用。第三十二頁，共40頁。（五）高分子聚合物沉淀法定義—利用一些水溶性高分子聚合物使目的物溶解度降低而析出固相物的過程沉淀機(jī)理非離子型如聚乙二醇（PEG）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和葡聚糖等，機(jī)理：類似于有機(jī)溶劑沉淀離子型（海藻酸鹽、聚丙烯酰胺鹽、聚乙烯亞胺）：有機(jī)溶劑沉淀+架橋第三十三頁，共40頁。PEG沉淀法機(jī)理：PEG分子親水性強(qiáng)，優(yōu)先水合，使得蛋白質(zhì)等從溶劑中析出.優(yōu)點(diǎn)1體系的溫度只需控制在室溫條件下；2沉淀的顆粒往往比較大，同其他方法相比，產(chǎn)物比較容易收集；3PEG非但不會使蛋白質(zhì)變性而且可以提高它的穩(wěn)定性，缺點(diǎn)PEG比其他沉淀劑更難從蛋白質(zhì)溶液中除去，為此需用超濾和液－液萃取來解決。廣泛應(yīng)用于核酸、酶的分離非離子型聚合物沉淀法第三十四頁，共40頁。3、特點(diǎn)沉淀效果較好，條件溫和高聚物的殘留有一定的毒性（陽離子）第三十五頁，共40頁。（六）金屬離子沉淀法定義—利用一些金屬離子與目的物復(fù)合，降低其復(fù)合物的溶解度而析出固相物的過程沉淀機(jī)理由于金屬離子能與蛋白質(zhì)分子中的特殊部位起反應(yīng)，從而降低蛋白質(zhì)的溶解度。例如鋅組胺酸殘基中的咪唑基結(jié)合，使蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)轉(zhuǎn)移，沉淀析出。3.分類與羧基、胺及雜環(huán)等含氮化合物結(jié)合；如Mn2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+等與羧基結(jié)合，不與胺及雜環(huán)等含氮化合物結(jié)合；如Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+等與巰基結(jié)合；如Hg+、Ag+、Pb2+等第三十六頁，共40頁。3、特點(diǎn)沉淀效果很好；選擇性好容易使生物分子變性復(fù)合物難分解第三十七頁，共40頁。（七）選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜質(zhì)蛋白變性沉淀下來，而與目的物分開，這種分離方法就稱為選擇性變性沉淀法