動物基因組DNA、總RNA的提取及含量測定呂紹武2009-10-15目的要求

學習和掌握從動物組織中提取核酸的原理和操作技術；了解提取DNA/RNA的幾種方法，原理和優缺點；學習測定DNA/RNA含量的基本原理及具體方法。理論基礎核酸是遺傳信息的攜帶者，是生命的最基本物質，它和蛋白質是構成生物體的主要成分；按化學組成可以將核酸分成兩大類：

①含脫氧核糖核酸（DNA），主要存在于細胞核中；

②含核糖核酸（RNA），主要存在于細胞質內；在生物體中核酸以結合成核蛋白的形式存在，但核酸極不穩定，在較劇烈的物理、化學因素和酶的作用下都很易降解。注意：在低溫下進行操作；減少物理因素對核酸的機械剪切力；防止過酸、過堿引起核酸降解，控制pH值范圍（pH值5-9），并要保持一定離子強度；防止核酸的生物降解；細胞內或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級結構。因此，所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。進行核酸分離時最好新鮮生物組織或細胞樣品，若不能馬上進行提取，應將材料貯存于液氮中或-70℃冰箱中。1、RNA的提取與測定RNA廣泛存在啤酒酵母，面包酵母，酒精酵母和各種動物組織中。常見方法（依據RNA的種類和來源）：①苯酚法（實驗室最常用的方法）

②去污劑法、③鹽酸胍法，苯酚法：組織勻漿后用苯酚處理離心，RNA即溶于上層被苯酚飽和的水相中，DNA和蛋白質則留在苯酚層中，向水相加冷乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出。優點：較好除去DNA和蛋白質，且獲得生物活性的RNA。工業提取RNA的方法酵母細胞富含RNA，是工業上提取RNA的主要原料。工業上制備RNA多選用低成本、適于大規模操作的濃鹽法或稀堿法。這兩種方法所提取的核酸均為變性的RNA，主要用作制備單核苷酸的原料，其工藝較簡單。濃鹽法：使用10％氯化鈉的溶液，同時在90攝氏度熱提取3-4小時，以改變細胞壁的通透性，使核酸從細胞內釋放出來。經冷卻，離心后上清液由乙醇沉淀RNA。稀堿法：使用0.2％氫氧化鈉裂解酵母，然后用酸中和，除去蛋白和菌體，上清液由乙醇沉淀RNA，或調等電點PI2.5沉淀。工業提取RNA的方法RNA提取勻漿：稱取3克牛肝剪碎，加20mL0.14mol/L氯化鈉溶液10000r/min左右勻漿1分鐘左右；離心：勻漿后溶液離心8000r/min離心7分鐘，量取上清液毫升數，沉淀物留做提取DNA；除雜質：于上清液中加入等體積80％苯酚溶液，攪拌充分混合10-15分鐘，置冰箱冷卻靜止10-15分鐘，離心取含有RNA上層水相，棄下層酚相；沉淀RNA：取上層水相含RNA溶液，加入2倍體積95％冷乙醇，攪拌，充分混合，置冰箱中冷卻(約10-15分鐘)，至出現白色絮狀物—RNA，離心8000r/min離心7分鐘，取沉淀物；溶解：用少量去離子水（約20毫升）溶解沉淀物，用以測定其含量。RNA含量測定方法測定RNA含量的方法：紫外吸收法、定磷法、地衣酚；本實驗用地衣酚測定

原理：當RNA與濃鹽酸共熱時，即可發生降解，形成核糖繼而轉變成糠醛，后者與3.5-二羥基甲苯（地衣酚）反應，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鮮綠色復合物，反應在670nm處有最大吸收峰，RNA濃度在10~100μg/mL范圍內，光吸收與RNA濃度成正比。在酸性環境中，定磷試劑中的鉬酸銨以鉬酸形式與樣品中的磷酸反應生成磷鉬酸，當有還原劑存在時磷鉬酸立即轉變藍色的還原產物―鉬藍。H3PO4+12H2MoO4→H3P(Mo3O10)4+12H2O↓還原劑

鉬藍鉬藍最大的光吸收在650-660nm波長處。當使用抗壞血酸為還原劑時，測定的最適范圍為1-10微克磷。定磷法RNA含量測定取8支試管，6支試管按上表所添加各種試劑繪制標準曲線。另2管各加入0.1mL、0.2mL、0.3mL待測液，再加2.9mL、2.8mL和2.7mL水和3.0mL地衣酚試劑試劑，加畢，搖勻，8支試管統一沸水加熱25min，取出后冷水冷卻，測定各管OD670為縱坐標，RNA濃度為橫坐標作圖，并計算提出的RNA的量。(控制RNA濃度在10~

100μg/mL之內）管號試劑(mL)

123456RNA標準液(100μg·mL-1)00.61.21.82.43.0蒸餾水3.02.41.81.20.60地衣酚試劑3.03.03.03.03.03.0試劑和器材材料：牛肝試劑：0.14mol/L氯化鈉標準RNA溶液：100μg/mL地衣酚（3,5-二羥基甲苯）試劑（現用現配）80％苯酚溶液95％乙醇器材：組織搗碎機、離心機、分光光度計、燒杯、量筒等DNA的提取及含量測定在動植物中，小牛胸腺、動物肝臟、魚類精子，植物種子的胚中都含有豐富的DNA；微生物中，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大腸肝菌含9%~10%。本實驗：將沉淀物溶解于生理鹽水，加入去污劑十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液，使DNA與蛋白質分離開。加入固體氯化鈉使其濃度達到1mol/L，使DNA溶解。加氯仿-異戊醇去除蛋白質，也可重復該步操作得較純DNA。最后用95%乙醇沉淀DNA。去除蛋白的常用方法變性劑法：用SDS等去污劑使蛋白質變性，可以直接從生物材料中提取DNA；苯酚法：用含水的酚溶液沉淀蛋白質和DNA，分層、離心。因蛋白變性，抑制了核酸酶活性，并且操作過程比較緩和，可以得到較好的DNA制品；氯仿法：用含辛醇或異戊醇的氯仿振蕩核蛋白，使乳化，離心除蛋白，DNA在上層水相，用乙醇沉淀上層，可將DNA沉淀出來。DNA的提取溶解：將離心后除去RNA的沉淀，用30ml生理鹽水溶解，充分攪拌后，勻漿一次。加4毫升10％SDS溶液，使溶液的SDS濃度達到1％左右，邊加邊攪拌，放置60℃水浴保溫10分鐘（不停攪拌），冷卻。加固體氯化鈉，使溶液氯化鈉濃度達到1mol/L，充分攪拌10分鐘；除雜質：加等體積氯仿-異戊醇混合液，充分震蕩10分鐘，8000r/min離心7分鐘，取上層液量好體積，倒入燒杯中（離心管），加同體積的氯仿-異戊醇混合液，重復上次操作。直至界面不出現蛋白凝膠為止；沉淀：準確量取上清液體積，加2倍體積95％冷乙醇，攪拌后，置冰箱靜止冷卻，待有白色絲狀物出現，約10-15分鐘，離心8000r/min離心7分鐘，得白色沉淀；溶解：將沉淀物用0.1mol/LNaOH約10毫升溶解。DNA含量測定1、DNA標準曲線的制定

6支試管，依次加入0、0.4、0.8、1.0、1.2、1.6和2.0mLDNA標準溶液。添加蒸餾水，使之都成為2mL。然后各加入4mL二苯胺試劑，混勻。于60℃恒溫水浴中保溫1h，冷卻后于595nm處進行比色測定。以DNA濃度為橫坐標，光吸收值為縱坐標，繪制標準曲線。2、制品的測定

取2支試管，各加0.2，0.8mL待測液，加水至2mL（內含DNA應在標準曲線的可范圍之內）和4mL二苯胺試劑，搖勻。其余操作同標準曲線的制作。

3、

根據測得的光吸收值，從標準曲線待測上查出相應該光吸收值DNA的含量.

管號試劑(mL)

012345678DNA標準液(200μg·ml-1)00.40.81.01.21.62.000蒸餾水2.01.61.21.00.80.401.81.2二苯胺試劑4.04.04.04.04.04.04.04.04.0DNA待測液00000000.20.8搖勻，60℃水浴保溫1h，在595nm處測吸光度（OD值或A值）OD595DNA含量(μg)080160200240320400試劑和器材試劑：生理鹽水10％SDS氯化鈉95％乙醇氯仿-異戊醇混合液DNA標準溶液：用0.01mol/LNaOH配成200μg/mL溶液二苯胺試劑（現用現配）器材：恒溫水浴、分光光度計、移液管等工藝圖3g肝臟+20mL0.14mol/L氯化鈉

勻漿,1min

離心8000r/min,7min

等