酶聯免疫檢測技術的應用真菌毒素的檢測：黃曲霉毒素B1、M1以及T-2毒素，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(嘔吐毒素DON)，二乙酰草鐮刀菌烯醇(DAS)，玉米赤霉烯酮，赫曲霉毒素A(OA)。農藥的檢測：主要有除草劑與殺蟲劑兩大類，例如殺暝松(FN)、甲氟磷酸異已酶(SOMAN)、草不綠(Alachor)、西維因(Carbaryl)、多菌靈及克菌丹(Captan)等。其他類的檢測：鹽酸克倫特羅，河豚毒素，植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素，苯并(a)芘，抗生素，激素類以及一些營養物質和食品添加劑如麩蛋白(Gliaclin)，醬油蛋白(Soyprotein)，花生蛋白(Peanutprotein)，牛乳清蛋白(BorineWheyProtein)等。隨著食品工業的發展，對分析檢測的要求越來越高，從而也使ELISA方法將更趨完善。一方面為提高ELISA方法的靈敏度和特異性，制備單克隆抗體的技術的發展，將和ELISA法互相結合，從而使食品衛生分析達到DNA分子結構水平，促使食品工業的健康發展。1放射免疫分析(RIA)放射免疫法(Radioimmunoassay,RIA)優點是特異性強、靈敏度高、精確、簡便易行。它包括以標記抗原(Antigen,Ag)為特點的放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)和以標記抗體(Antibody,Ab)為特點的免疫放射分析(Immunoradiometricassay,IRMA)o前者以液相競爭結合法居多，既測大分子抗原又測小分子抗原；后者以固相法測大分子抗原為主。最早建立的農藥免疫法中，RIA占了很大比重，建立了狄氏劑、艾氏劑、2,4-D和2,4,5-T、對硫磷和百草枯等農藥的放射免疫法。但由于進行RIA需使用昂貴的計數器，存在放射性防護和廢物處理等問題，其應用受到較大限制。1982年后發表的農藥免疫分析文章，主要是酶免疫分析法。2酶免疫法(EIA)酶免疫法(EnzymeImmunoassay,EIA)是將抗原、抗體的特異性免疫反應和酶的高效催化作用有機結合起來的一種免疫分析方法。酶免疫法的檢測原理與放射免疫法類似，通過測定結合于固相的酶的活力來測定被測定物的量。用作標記物的酶有辣根過氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)和堿性磷酸酶(AlkalinePhosphatase)。酶標試劑制備容易、穩定、價廉。酶免疫分析的靈敏度接近放射免疫技術，而可借助于簡單的儀器作定量測定，是目前農藥監測中應用最廣泛的免疫分析技術。EIA法包括酶聯免疫吸附分析法(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA)、酶免疫試驗法(Enzyme-monitoredImmunotest,EMIT)、競爭結合酶免疫分析法(CompetitiveBindingEnzymeImmunosorbentAssay,EIA)和免疫酶分析法(ImmunoenzymometricAssay,IEMA)。其中基于競爭吸附的ELISA已成為農藥監測中的首選方法。3熒光免疫分析(FIA)本世紀40年代，Coons采用熒光素標記抗體檢測可溶性肺炎球菌多糖抗原，首次創建了熒光抗體檢測技術。熒光免疫法具有專一性強、靈敏度高、標記物不易失活、價格低廉、無放射性污染等優點。至今，FIA已廣泛應用于微量、超微量物質分析測定。FIA常用的熒光素有異硫氤酸酯(Fluoresceineisothiocyanate,FITC)和羅丹明(BLissamineRhodamineB200,RB200)等。將熒光免疫與光纖傳感器結合形成的熒光免疫傳感器是近年來熒光免疫法研究十分活躍的領域。熒光免疫傳感器是將抗體(抗原)固定在適當基底上，實現生化熒光信號向光電信號的轉變，以對待測物質進行定量檢測。測定環境中農藥殘留的分子識別元件可以是AchE［10］抗體［11］和堿性磷酸酶等。Rogers等［12］將FITC標記的AchE固定在石英纖維上以檢測酶的活性。乙酰膽堿水解時產生的H+猝滅纖維表面的熒光信號，熒光強度減弱。有機磷農藥抑制AchE的活性，從而降低熒光猝滅能力，可檢測溶液中10-8mol.L-1的AChE抑制劑，其響應時間小于1min。Anis等將有機農藥對硫磷抗體和FITC標記的Anti-IgGAb蛋白固定在石英纖維上制得熒光免疫傳感器。測定對硫磷的檢測限為10-9mol.L-1。Schulman利用競爭性熒光能量轉移法原理，用FITC標記的多克隆氯乙異丙嗪(atrazine)抗體，用四甲基羅丹明標記農藥氯乙異丙嗪，研制出光纖免疫傳感器，通過增加能量轉移的量改善了靈敏度。Northrup［13］利用光纖免疫傳感器檢測農藥中擬除蟲菊酯(pyrethroide)。Bier等［14］以熒光和損耗波作用為基礎，研究了光纖傳感器對三嗪衍生物terbutryn的靈敏度和再生性，檢測限0.1ng/mL，可穩定使用8周以上并可循環測定500次。Robert等［15］應用損耗波光纖為基礎的免疫傳感器還可直接檢測地面水中ng/mL水平的蓖麻毒素。這類傳感器有很高的特異性，然而對分子量小的有機磷農藥，特別是有機磷神經性毒劑，較難誘導出高質量的抗體，加之生物材料在固定化過程中的可能失活等原因使其應用尚不及EIA普遍。目前國內尚無此類工作報道。熒光免疫分析中的其它發展還有時間分辨熒光多組份免疫分析法的建立及時間分辨熒光免疫分析中熒光效應的研究。一、檢測的原理借助抗原和抗體在體外特異結合后出現的各種現象，對樣品中的抗原或抗體進行定性、定量、定位的檢測。抗原與抗體的親和力（affinity）抗原抗體的結合就像酶與底物的結合，激素與其受體的結合一樣不是化學的反應，而是非共價鍵的可逆的結合。抗原決定簇和抗體分子可變區互補構型，造成兩分子間有較強的親和力。空間構型互補程度不同，抗原和抗體分子之間結合力強弱也不同。互補程度高，則親和力強。此外，反應溫度、酸堿度和離子濃度對抗原和抗體分子上各基因的解離性和電荷特性也有重要的影響，抗體與抗原決定簇之間的結合力大小可用親合力來表示。高親合力的抗體與抗原的結合力強，即使抗原濃度很低時也有較多的抗體結合抗原形成免疫復合物。抗原或抗體外檢測原理根據抗原抗體結合形成免疫復合物的性狀與活性特點，對標本中的抗原或抗體進行定性、定位或定量的檢測。定性和定位檢測比較簡單，即用已知的抗體和待檢樣品混合，經過一段時間，若有免疫復合物形成的現象發生，就說明待檢樣品中有相應的抗原存在。若無預期的現象發生，則說明樣品中無相應的抗原存在。同理也可用已知的抗原檢測樣品中是否有相應抗體。對抗原或抗體進行定量檢測時，以反應中加入抗原和抗體的濃度與形成免疫復物的濃度呈函數關系。（1）根據免疫復合物產生的多少來推算樣品中抗原（或抗體）的含量：在一定的反應條件下，加入的已知抗體（或抗原）的濃度一定，反應產生的免疫復合物多少與待檢樣品中含有相應抗原（或抗體）量成正比。也就是抗體濃度一定時，免疫復合物越多則樣品中的抗原量也越多。可用實驗性標準曲線推算出樣品中抗原（或抗體）的含量。如免疫單向擴散試驗、免疫比濁試驗和酶聯免疫檢測等都屬于這類萬法。（2）抗原或抗體效價滴定的原理：當抗原抗體復合物形成多少不能反應抗原抗體反應強弱時，就不能以檢測反應強度來對抗原或抗體進行定量。在實際工作中，把濃度低的反應成分（抗原或抗體）的濃度固定，把濃度高的另一種反應成分作一系列稀釋。例如用人血清作抗原免疫3只家兔，比較3只家兔產生抗體的多少，即滴定3只兔血清抗體效價，可用雙向瓊脂擴散法來滴定，例如將抗體濃度固定，將抗原作不同的稀釋度，分別將抗原或抗體滴入瓊脂的相應小孔中，觀察免疫兔血清與不同稀釋度的抗原出現明顯沉淀淺的抗原稀釋度（如甲兔的抗體效價為1/2000，而丙免的是1/8000則可比較出后者比前者產生抗體的效價要高）。也就是表示效價的稀釋度越高，樣品中所含待檢成分越多。因人血清（抗原）和抗體（免疫兔血清）相比，濃度高，故應稀釋抗原。二、抗原或抗體檢測的實用意義抗體檢測的意義檢測抗體可用于評價人和動物免疫功能的指標。抗體用于臨床治療或實驗研究時也需做純度分析和定量測定。臨床上檢測病人的抗病原生物的抗體、抗過敏原的抗體、抗HLA抗原的抗體、血型抗體及各種自身抗體，對有關疾病的診斷有重要意義。抗原檢測的意義可做為抗原進行檢測的物質可分為以下四類：各種微生物及其大分子產物：用于傳染病診斷、微生物的分類及鑒定以及對菌苗、疫苗的研究。生物體內各種大分子物質：包括各種血清蛋白(如各類免疫球蛋白、補體的各種成分)、可溶性血型物質、多肽類激素、細胞因子及癌胚抗原等均可做為抗原進行檢測。在對這些成分的生物學作用的研究以及各種疾病的診斷有重要意義。人和動物細胞的表面分子：包括細胞表面各種分化抗原(如CD抗原)、同種異型抗原(血型抗原或MHC抗原)、病毒相關抗原和腫瘤相關性情抗原等。檢測這些抗原對各種細胞的分類、分化過程及功能研究、對各種與免疫有關的疾病的診斷及發病機制的研究，均有重要意義。各種半抗原物質：某些藥物、激素和炎癥介質等屬于小分子的半抗原，可以分別將它們偶聯到大分子的載體上，組成人工結合的完全抗原。用其免疫動物，制備出各種半抗原的抗體，應用于各種半抗原物質的檢測，例如對某些病人在服用藥物后進行血中藥物濃度的監測。對運動員進行服用違禁藥品的檢測，都是應用半抗原檢測的方法。三、抗原或抗體檢測的方法由于各種檢測方法中所用的抗原性狀不同，出現結果的現象也不同。最廣泛應用方法有下述幾種：(一)沉淀反應可溶性抗原與抗體結合，在兩者比例合適時，可形成較大的不溶性免疫復合物。在反應體系中出現不透明的沉淀物，這種抗原抗體反應稱為沉淀反應(precipitationneaction)o1.環狀沉淀試驗先將含抗體的未稀釋的免疫血清加到直徑小于0.5cm的小試管底部。將稀釋的含有可溶性抗原的材料重疊于上，讓抗原與抗體在兩液體的界面相遇，形成白色免疫復合物沉淀環，故名為環狀沉淀試驗(ringprecipitationtest),此法簡便易行，需用材料較多是其缺點。2.單向免疫擴散試驗單向免疫擴散試驗(singleimmunodiffusion)是在凝膠中進行的沉淀反應。將抗體