實驗一生化實驗認(rèn)知一、實驗室簡介二、實驗室常用儀器使用三、實驗室安全防護(hù)四、生化實驗考核辦法五、清點器材

一、實驗室簡介生化實驗室為上海交大生農(nóng)醫(yī)藥大平臺生物化學(xué)實驗室，目前承擔(dān)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院、醫(yī)學(xué)院、藥學(xué)院、農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院等學(xué)院本科生生物化學(xué)實驗教學(xué)任務(wù)，實驗教學(xué)時數(shù)達(dá)3.5萬人學(xué)時數(shù)。生化本實驗室擁有凝膠成像分析系統(tǒng)、蛋白質(zhì)表達(dá)、純化和鑒定系統(tǒng)、紫外分析儀、PCR儀、恒溫培養(yǎng)箱、超聲波細(xì)胞粉碎機、高速臺式離心機、低溫冰箱、超凈工作臺、超純水機等，可同時容納90名學(xué)生參加實驗。實驗室現(xiàn)有人員4人、其中教授1人、副教授2人、實驗室專職人員1人。1.務(wù)必于規(guī)定時間內(nèi)到達(dá)實驗室。2.務(wù)必穿實驗衣。3.嚴(yán)禁在實驗室吃東西4.離開實驗室時，務(wù)必將所有物品歸位，桌面保持干凈。5.廢液請倒入收集桶內(nèi)。本實驗室需要提醒學(xué)生的實驗室規(guī)則：

1、離心機在實驗過程中，欲使沉淀與母液分開，有過濾和離心兩種方法。在下述情況下，使用離心方法較為合適。

a.沉淀有粘性；b.沉淀顆粒小，容易透過濾紙；c.沉淀量多而疏散；d.沉淀量少，需要定量測定；e.母液量很少，分離時應(yīng)減少損失；f.沉淀和母液必須迅速分離開；g.母液粘稠；h.一般膠體溶液；使用方法1）使用前應(yīng)先檢查變速旋鈕是否在“O”處。2）離心時先將待離心的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到大小合適的離心管內(nèi)，盛量占管的2/3體積，以免溢出。將此離心管放入外套管內(nèi)。3）將一對外套管（連同離心管）放在臺秤上平衡，如不平衡，可用小吸管調(diào)整離心管內(nèi)容物的量或向離心管與外套間加入平衡用水。每次離心操作，都必須嚴(yán)格遵守平衡要求，否則將會損壞離心機部件，甚至造成嚴(yán)重事故，應(yīng)十分警惕。4）將以上兩個平衡好的套管，按對稱位置放到離心機中，蓋嚴(yán)離心機蓋，并把不用的離心套管取出。5）開動時，先開電門，然后慢慢撥動變速旋鈕，使速度逐漸加快。停止時，先將旋鈕撥到“O”，不繼續(xù)使用時，拔下插頭。待離心機自動停止后，才能打開離心機蓋并取出樣品，絕對不能用手阻止離心機轉(zhuǎn)動。6）用完后，將套管中的橡皮墊洗凈，保管好。沖洗外套管，倒立放置使其干燥。

2、分光光度計分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量。

分光光度計的簡單原理

分光光度計采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長的光源，光源透過測試的樣品后，部分光源被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。

核酸的定量

核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)。光度計測量的轉(zhuǎn)換:雙鏈DNA(dsDNA)：A260=OD260=1相當(dāng)于50μg/ml溶液單鏈DNA(ssDNA)：A260=OD260=1相當(dāng)于33μg/ml溶液RNA：A260=OD260=1相當(dāng)于40μg/ml溶液測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。

除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。

蛋白質(zhì)的直接定量（UV法）

這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。

細(xì)菌細(xì)胞密度（OD600）

實驗室確定細(xì)菌生長密度和生長期，多根據(jù)經(jīng)驗和目測推斷細(xì)菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗，需要采用分光光度計準(zhǔn)確測定細(xì)菌細(xì)胞密度。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標(biāo)準(zhǔn)方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作，必須針對每種微生物和每臺儀器用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，做出校正曲線。

3、水浴的使用4、濾紙的使用6、計量儀器計量儀器的選擇的原則：應(yīng)根據(jù)量取液體的體積大小而定，同時要考慮量取的準(zhǔn)確度。

計量儀器最佳量程準(zhǔn)確度滴管30μl~2mL低量筒5~2000mL中等容量瓶5~2000mL高滴定管1~25mL高移液管/移液槍5μl~10mL高微量注射器0.5~50ul高稱量任何量度（取決于天平的準(zhǔn)確度）極高錐形瓶/燒杯25~5000mL極低移液管的使用移液槍由聯(lián)系可調(diào)的機械裝置和可替換的吸頭組成，不同型號的移液槍吸頭有所不同，實驗室常用的移液槍根據(jù)最大吸用量有2ul,10ul,20ul,200ul,1mL等規(guī)格。移液槍的使用注意事項1.吸頭的更換：性能優(yōu)良的移液器具有卸載吸頭的機械裝置，輕輕按卸載按鈕，吸頭就會自動脫落。2.在移液器吸頭中含有液體時禁止將移液器水平放置，平時不用時置移液器于架上；3.吸取液體時，動作應(yīng)輕緩，防止液體隨氣流進(jìn)入移液器的上部；

傾倒液體樣品傾倒固體樣品幾種有代表性的危險化學(xué)藥品的防護(hù)措施化學(xué)藥品潛在危險防護(hù)措施十二烷基磺酸鈉（SDS）刺激性、有毒戴手套氫氧化鈉高腐蝕性、強刺激性戴手套苯酚劇毒、灼傷、可致癌使用通風(fēng)櫥、戴手套氯仿?lián)]發(fā)性、有毒、刺激性、腐蝕性、可致癌使用通風(fēng)櫥、戴手套巰基乙醇揮發(fā)性、有毒、強刺激性、腐蝕性使用通風(fēng)櫥、戴手套如酚觸及皮膚引起灼傷，可用酒精洗滌。酸、堿等化學(xué)試劑濺入眼內(nèi)，先用自來水或蒸餾水沖洗眼