PCR反應(yīng)的模板重組質(zhì)粒DNA基因組DNARNA菌落圖

1口腔腺中提取的RNAM:DL2000marker;1:5μLRNA;2:10μLRNA;3:15μLRNA.

M12328S18S5S2023/4/75㈠PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制DNA變性與復(fù)性聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)一、PCR技術(shù)原理2023/4/76PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制DNA變性與復(fù)性聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物2023/4/77PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制DNA變性與復(fù)性聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGACCTACC3’DNA聚合酶DNA聚合酶2023/4/79PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制DNA變性與復(fù)性聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1971年，Khorana提出：經(jīng)過(guò)DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA基因。但由于測(cè)序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana設(shè)想被人們遺忘了……2023/4/710PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制DNA變性與復(fù)性聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制。最初采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過(guò)程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)。耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行2023/4/711DNApolermasesforPCR:Thermusaquaticus古細(xì)菌-水生棲熱菌最適生長(zhǎng)溫度70℃，具有5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活性2023/4/713引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段2023/4/71472℃94℃55℃PCR循環(huán)2023/4/715PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制DNA變性與復(fù)性聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀1989年美國(guó)《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。2023/4/717PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95℃)2023/4/718TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意圖①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93-95℃左右一定時(shí)間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；PCRCycle-Step2–

Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequences2023/4/719TargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；Endofthe1stPCRCycle–

Resultsintwocopiesoftargetsequence2023/4/721TargetSequenceTargetSequence每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。2023/4/722被擴(kuò)增的DNA片段模板DNA變性引物與模板退火引物延伸模板DNA變性引物與模板退火引物延伸引物延伸循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3模板DNA變性引物與模板退火21＝222＝423＝825次循環(huán)后，被擴(kuò)增的DNA片段的拷貝數(shù)為225附圖TargetAmplificationTargetAmplification2023/4/723No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon2023/4/725（1）PCR反應(yīng)緩沖液Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。1.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過(guò)低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過(guò)高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。2023/4/726（2）Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)

0.5-5U/100L

酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過(guò)少影響反應(yīng)產(chǎn)量。2023/4/729（5）引物濃度

0.1-1mol/L

濃度過(guò)高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配,反應(yīng)特異性下降。㈣PCR引物的設(shè)計(jì)一般原則①引物長(zhǎng)度一般以15～30bp為宜,過(guò)短則降低特異性，過(guò)長(zhǎng)則會(huì)引起引物間退火而影響有效擴(kuò)增。②避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免序列內(nèi)有較長(zhǎng)的回文結(jié)構(gòu)，使引物自身不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。③G/C和A/T堿基均勻分布，G/C含量在45～55%之間，引物堿基序列盡可能選擇堿基隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤或嘧啶連續(xù)排列。2023/4/730④要避免兩個(gè)引物間特別是3′末端堿基序列互補(bǔ)以及同一引物自身3′末端堿基序列互補(bǔ)的，使它們不能形成引物二聚體或發(fā)卡結(jié)構(gòu)。⑤引物3′末端堿基一般應(yīng)與模板DNA嚴(yán)格配對(duì)，并且3′末端為G、C或T時(shí)引物效率較高。⑥引物5`末端堿基可不與模板DNA匹配，可添加與模板無(wú)關(guān)的序列(如限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列、ATG起始密碼子或啟動(dòng)子序列等)，便于克隆和表達(dá)，但其保護(hù)堿基有一定的要求。⑦引物的堿基順序不能與非擴(kuò)增區(qū)有同源性。2023/4/7312023/4/732例1.引物的3’末端形成雜交

5’GGCTATACCGATTCGAATCA3’

3’ACTAAGCTTAGCCATATCGG5’例2.引物的5’末端形成雜交

5’

ATCGATCGATGGCATGGTAT3’

3’TATGGTACGGTAGCTAGCTA

5’例3.引物的中間部分形成雜交

5’AACGAGCTTCGAAGGCTAA3’3’AACGAGCTTCGATGGCTAA5’例4.5’CCAGAGGGAGAACTCCCTCGC3’引物設(shè)計(jì)軟件：Primer5,Oligo6目的基因上游引物設(shè)計(jì)目的基因下游引物設(shè)計(jì)2023/4/741㈤PCR一般循環(huán)參數(shù)變性

使雙鏈DNA解鏈為單鏈,95℃3～5分鐘(2)退火

溫度由引物長(zhǎng)度和GC含量決定,適宜的退火溫度大約低于引物Tm值45-55℃

，介于45-55℃

。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。Tm值就是DNA熔解溫度，指把DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半時(shí)的溫度。

Tm＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）2023/4/742（3）延伸

72℃，延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定（4）循環(huán)次數(shù)

主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過(guò)多：擴(kuò)增效率降低錯(cuò)誤摻入率增加㈥標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)條件：10×緩沖液10μL4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5UMg2+

1.5mmol/L2023/4/7432023/4/744PCR儀2023/4/745模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)2023/4/74650℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)2023/4/747引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)2023/4/74872℃第1輪結(jié)束第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)2023/4/74995℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)2023/4/75072℃第2輪結(jié)束PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)2023/4/751重復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

附圖㈦PCR反應(yīng)注意的事項(xiàng)（一）防止污染試劑小量分裝吸頭及EP管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開，無(wú)菌操作（二）設(shè)立對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性模板陰性對(duì)照：陰性模板試劑對(duì)照：除模板外的所有組分2023/4/752㈧PCR反應(yīng)的特點(diǎn)靈敏度高皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU（空斑形成單位）細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌簡(jiǎn)便、快速一次性加好反應(yīng)液，2～4h完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對(duì)標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA2023/4/753空斑形成單位又稱蝕斑形成單位，是計(jì)量病毒（或噬菌體）的一種單位，但只限于用在有產(chǎn)生空斑能力的病毒。其原理是：用少量有破壞宿主細(xì)胞能力的病毒去感染已形成致密單層狀態(tài)的宿主細(xì)胞群體時(shí)，經(jīng)過(guò)一定培養(yǎng)時(shí)間使每個(gè)感染細(xì)胞周圍的細(xì)胞逐漸感染崩潰，形成肉眼可見的空斑（噬菌體時(shí)可直接觀察，病毒時(shí)則需借助于活體染色的方法）。在理論上，一個(gè)病毒體就可以形成一個(gè)空斑，但實(shí)際上有不同程度誤差，因此不能準(zhǔn)確的與其他計(jì)量單位互換。用PFU計(jì)量病毒的方法叫作PFU法。

1、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)

2、反向PCR

3、復(fù)合PCR

4、不對(duì)稱PCR

5、嵌套PCR6、3’FullRACE7、5’FullRACE8、實(shí)時(shí)定量PCR2023/4/755二、PCR技術(shù)的主要類型

1、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)

是指以mRNA在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA第一鏈為模板進(jìn)行的PCR。用于測(cè)定基因表達(dá)的強(qiáng)度和鑒定已轉(zhuǎn)錄序列是否發(fā)生突變,呈現(xiàn)mRNA多態(tài)性,克隆mRNA的5’和3’末端序列,以及從非常少量的mRNA樣品構(gòu)建大容量的cDNA文庫(kù)。2023/4/7562023/4/757反轉(zhuǎn)錄酶具有依賴于RNA的DNA聚合酶活性和RNA酶H活性，AMV(42℃)和MMLV（37℃）。雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈2023/4/7582023/4/7595’3’AAAAA5’3’5’3’3’5’5'3’3'5’5’3’RT-PCR原理mRNA1stcDNA反轉(zhuǎn)錄酶、下游引物、dNTPsTaqDNA聚合酶、上游及下游引物、dNTPs5’5’3’3’特異PCR產(chǎn)物5’5’3’3’經(jīng)30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)生230個(gè)分子拷貝5’5’3’3’2023/4/760MLVRT催化的

cDNA合成RT-PCR引物選擇2023/4/7632、反向PCR(reversePCR)

是用反向引物對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)未知序列進(jìn)行的PCR。可對(duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長(zhǎng)cDNA的克隆,擴(kuò)增基因文庫(kù)的插入DNA。已知序列未知序列未知序列2023/4/764已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶2023/4/7653、復(fù)合PCR(或稱多重PCR)在一個(gè)反應(yīng)體系加入多對(duì)不同的PCR引物同時(shí)擴(kuò)增，獲得多個(gè)PCR產(chǎn)物，這種PCR稱為復(fù)合PCR。用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。電泳引物2023/4/7664、不對(duì)稱PCR

是指用不等量的一對(duì)引物產(chǎn)生大量單鏈DNA的PCR。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關(guān)鍵是限制性引物的絕對(duì)量。用途：制備核酸序列測(cè)定的模板制備雜交探針基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究2023/4/767

高濃度引物低濃度引物5、嵌套PCR(或稱巢式PCR)是指先后用兩套引物進(jìn)行擴(kuò)增的PCR。用第一套引物擴(kuò)增15～30個(gè)循環(huán)；再用擴(kuò)增DNA片段內(nèi)設(shè)定的第二套引物擴(kuò)增15～30個(gè)循環(huán)，這樣可使待擴(kuò)增序列得到高效擴(kuò)增。2023/4/7686、3’FullRACE7、5’FullRACE5’-flankingregionofchickenovalbumingene8、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timePCR):美國(guó)PE（PerkinElmer）公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù)。通過(guò)特定設(shè)計(jì)的PCR儀器檢測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程每一輪循環(huán)產(chǎn)物標(biāo)記的熒光信號(hào)累積數(shù)量，從而進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析,稱為實(shí)時(shí)熒光定量PCR。以參照物為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)PCR終產(chǎn)物進(jìn)行分析或?qū)CR過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從而達(dá)到評(píng)估樣本中靶基因的拷貝數(shù)，稱為定量PCR。

2023/4/776（1）SYBRGreenI檢測(cè)模式通過(guò)PCR反應(yīng)生成雙鏈DNA，SYBR?GreenI與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出熒光，通過(guò)檢測(cè)PCR反應(yīng)液中的熒光信號(hào)強(qiáng)度，可以對(duì)目的基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量，同時(shí)還可以測(cè)定擴(kuò)增的目的DNA片段的融解溫度。SYBRGreenI的優(yōu)點(diǎn)：SYBRGreenI的優(yōu)點(diǎn)是因?yàn)槠淙秉c(diǎn)產(chǎn)生，由于它能所有的雙鏈DNA相結(jié)合，所以對(duì)不同模板不需特別定制不同的特異性探針，通用性較好，并且價(jià)格相對(duì)較低。這對(duì)科研是很有利的，因此國(guó)內(nèi)外在科研中使用比較普遍。2023/4/779（2）水解探針模式（Taqman探針）

發(fā)射基團(tuán)熒光淬滅基團(tuán)5’3’該探針可與擴(kuò)增序列內(nèi)的DNA模板發(fā)生特異性雜交,探針的5’端標(biāo)以熒光發(fā)射基團(tuán),靠近3’端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán),探針3’端被磷酸化以防止探針在PCR擴(kuò)增過(guò)程中被延伸。2023/4/7802023/4/781工作原理是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性。在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入一個(gè)熒光標(biāo)記探針，它與引物包含序列內(nèi)的DNA模板發(fā)生特異性雜交。探針的5’端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)(熒光發(fā)射峰值在518nm處)，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)(熒光發(fā)射峰值在582nm處)且被磷酸化，以防止探針3’端在PCR擴(kuò)增過(guò)程中被延伸。2023/4/782當(dāng)探針保持完整時(shí)，淬滅基團(tuán)抑制發(fā)射基團(tuán)的熒光發(fā)射。發(fā)射基團(tuán)一旦與淬滅基團(tuán)發(fā)生分離，抑制作用被解除，518nm處的光密度增加而被熒光探測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)到。復(fù)性期探針與模板DNA發(fā)生雜交，延伸期Taq酶隨引物延伸沿DNA模板移動(dòng)，當(dāng)Taq酶移動(dòng)到探針切斷,淬滅作用被解除，熒光信號(hào)釋放出來(lái)。模板每復(fù)制一次，就有一個(gè)探針被切斷，伴隨一個(gè)熒光信號(hào)的釋放。由于被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目和PCR產(chǎn)物數(shù)量是一對(duì)一的關(guān)系,因此用該技術(shù)可對(duì)模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。2023/4/783實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)Lj-HMGB2基因在各組織中含量2023/4/785三、PCR技術(shù)應(yīng)用1.基礎(chǔ)研究⑴基因或cDNA克隆：從基因數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得某一基因或cDNA核苷酸序列,用PCR方法擴(kuò)增并克隆該基因或cDNA。⑵基因表達(dá)：用RT-PCR檢測(cè)某一特定基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。2.醫(yī)學(xué)⑴感染性疾病病原體的診斷：HIV、結(jié)核桿菌、乙肝病毒等。⑵遺傳病相關(guān)基因檢測(cè)：鐮刀型細(xì)胞貧血、血友病。⑶惡性腫瘤的診斷。2023/4/7863.法醫(yī)學(xué)中的基因和親子鑒定DNA指紋圖譜

1984年英國(guó)萊斯特大學(xué)的遺傳學(xué)家Jefferys及其合作者首次將分離的人源小衛(wèi)星DNA用作基因探針，同人體核DNA的酶切片段雜交，獲得了由多個(gè)位點(diǎn)上的等位基因組成的長(zhǎng)度不等的雜交帶圖紋，這種圖紋極少有兩個(gè)人完全相同，故稱為"DNA指紋"，意思是它同人的指紋一樣是每個(gè)人所特有的。AATG7repeats8repeatsAATGAATG引物引物引物引物簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)實(shí)驗(yàn)方法現(xiàn)場(chǎng)嫌疑人1嫌疑人2嫌疑人3法醫(yī)鑒定案例一母親兒子男性1男性2男性3親子鑒定案例二4.考古學(xué)中生物種類間的親緣關(guān)系、進(jìn)化途徑判定5.基因動(dòng)、植物的檢測(cè)⑴轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的檢測(cè)：檢測(cè)某一基因的遺傳穩(wěn)定性。⑵轉(zhuǎn)基因植物的檢測(cè)：玉米、大豆等。物種進(jìn)化圖2023/4/7941、要求將下面基因片段克隆至表達(dá)載體pET-28a相應(yīng)位點(diǎn)上，并獲得此基因的表達(dá)。

ATGGGTCGGCATGCTGATACAGATAATAATTTCTCAAAGGACCATGGTTGGTATTTAGCTTATTCTATACCTGACACAGGGGAATCACAAATAAGAAAATTTTCAGCATTAGCTAGATATGAATGGCAAAGAGGAAACTATAAACAAGCTACATTCTATCTTGGAGAGGCTATGCACTATTTTGGAGATATAGATACTCCATATCATCAAGCTTATGTTACTGCCGTTGATAGCGCAGGACATGTTAAGTTTGAGACTTTTGCAGAGGAAAGAAAAGAACAGTATAAAATAAACACAGCAGGTTGCAAAACTAATGAGGCTTTTTATACTGATATCTTAAAAAACAAAGATTTTAATGCATGGTCAAAAGAATATGCAAGAGGTTTTGCTAAAACAGGAAAATCAATATACTATAGTTAA

2、限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基序列如下：

BamHI:GGATCC,EcoRI:GAA