ICS65.020.30天津DB12市地方標準DBT956—2020測定酶底物法DeterminationoftotalcoliformsfecalcoliformsandEscherichiaColiindairyfarmmanureEnzymesubstratemethod天津市市場監督管理委員會發布前言GBT。。4糞污樣品采集奶牛場糞污中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定酶底物法標準適用于規模化奶牛場糞污中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的同時測定。范性引用文件凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GBT6682—2008分析實驗室用水規格和試驗方法GBT27522—2011畜禽養殖污水采樣技術規范定義8中的某些術語和定義。群totalcoliformsandfecalcoliforms分解選擇性培養基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成黃色鄰硝基苯酚。氏菌EscherichiaColi生成鄰硝基苯酚，同時可以分解4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)釋放4-甲基傘形酮，在365nmmostprobablenumberMPN)算一定體積樣品中目標微生物存在數量。4.1采樣物品GBT中第4.1款規定執行。4.2采樣方法GBT款的規定執行。4.3樣品保存采樣后應在低溫(4℃)條件下保存并在6h內完成測定。酶底物測定.1方法原理在選擇性培養基中培養18h~24h，總大腸菌群和糞大腸菌群能夠產生β-半乳糖苷酶并分解培養底物中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成鄰硝基苯酚(ONP)，該物質在白光或日光照射下顯黃色。大腸埃希氏菌可以分解4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)釋放4-甲基傘形酮，在365nm出現數量，查MPN表，分別計算樣品中總大腸菌群、菌群和大腸埃希氏菌的濃度值。5.2試劑材料分表O硫酸錳(MnSO4)硫酸鋅(ZnSO4)硫酸鎂(MgSO4)氯化鈉(NaCl)氯化鈣(CaCl2)5亞硫酸鈉(Na2SO3)4鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)茄屬植物萃取物(Solanium萃取物)N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸鈉鹽(HEPES鈉鹽)N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES).2.4標準陽性比色盤。5.3儀器設備.3.2小型熨斗：用于97孔定量盤(5.2.3)的封口。5.4樣品前處理n5.5接種定容制備100mL樣品或稀釋樣品于現場采樣袋或采樣瓶中，加入2.7g培養基(5.2.2)粉末，震蕩均勻并靜置5min，待培養基混勻溶解后，將樣品均勻倒入97孔定量盤(5.2.3)內(保證每個孔內充滿完全密封。未培養前觀察孔內顏色，若出現類似或深于標準陽性比色盤(5.2.4)的顏色時，應觀察樣品。5.6培養測定總大腸菌群和大腸埃希氏菌時，將接種后的97孔定量盤樣品放入恒溫培養箱(5.3.1)中37℃±0.5℃下培養18h后進行判讀，當97孔定量盤中孔格顏色弱于標準陽性比色盤(5.2.4)時，應進一步延長培養時間至24h再進行判讀。測定糞大腸菌群時，將接種后的97孔定量盤放入的恒溫培養箱 (5.3.1)中44.5℃±0.5℃下培養18h后進行判讀，當97孔定量盤中孔格顏色弱于標準陽性比色盤 5.7結果分析.7.1結果判讀與計數外燈(5.3.5)照射下呈藍色即為大腸埃希氏菌陽性。量。.7.2結果計算公式(1)換算樣品中總大腸菌群、糞大腸菌群數或大腸埃希氏菌濃度(MPN/L)：CMPN000)/f……………(1)C度，MPN/L；1000——單位轉換因子(由MPN/mL轉換為MPN/L)；測定結果保留兩位有效數字，結果大于等于