關于新基因功能研究的策略與方法第一頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期一隨著生命科學的發展及研究領域的不斷開拓和生物醫學研究在分子水平上的不斷深入和推進，越來越多的未知新基因和基因的新功能被發現,越來越多的新基因被得以成功克隆，因此對新基因功能的研究顯得日益重要，這也是后基因組時代功能基因組學的重要研究內容和首要任務。第二頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期一一.新基因的生物信息學及體內表達規律分析;二.新基因的體內表達規律分析三.功能獲得與功能失活策略研究;四.功能失活策略五.基因編碼產物相互作用蛋白的研究基因功能的研究策略主要包括：第三頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期一

目前，生物信息學分析已成為新基因功能研究首選和必用方法，其具有方便快捷和經濟等優點。研究者往往可以從中得到與新基因功能有關的重要信息，初步推測基因的可能功能，進而制定出進一步的實驗室研究方案。（1）編碼產物預測分析（2）序列同源性分析（3）蛋白質功能域分析一.新基因的生物信息學及體內表達規律分析第四頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期一（1）mRNA水平的表達譜分析；（2）蛋白質水平的表達分析。二.新基因的體內表達規律分析要開展新基因功能的研究工作，首要的研究任務摸清新基因在體內的表達規律。包括從mRNA和蛋白質兩個水平上來對其基因表達譜進行分析，即看其在各種不同的正常或病態組織細胞中是否表達以及表達的水平高低等.新基因在某一特定的正常組織細胞中的表達水平高往往提示其在其中發揮著重要作用，而新基因在相應的病態組織中的表達異常則提示與該病理過程相關的生物學意義。第五頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期一三.功能獲得策略

新基因功能研究的功能獲得策略即通過將新基因直接導入到某一細胞或個體中，通過觀察細胞生物學行為或個體表型遺傳性狀的變化來鑒定基因的功能，常用的方法有：（1）基因轉染技術（2）轉基因技術第六頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期一四.功能失活策略

通過觀察某一細胞或個體在新基因的功能部分或全部失活后的細胞生物學行為或個體表型遺傳性狀變化來鑒定基因的功能。常用的方法主要有基于核酸的基因沉默技術和基因敲除等（1）基因沉默技術（2）基因敲除第七頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期一五.基因編碼產物相互作用蛋白的研究

細胞各種基本功能的完成離不開蛋白質之間的相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白質復合物。因此，確定能夠與新基因編碼的蛋白質表達終產物相互作用的上下游蛋白質分子，也是研究新基因功能的一個十分重要的方面。目前常用的研究蛋白質相互作用的技術包括傳統的基親和分析而建立的免疫共沉淀技術和酵母雙雜交系統.（1）免疫共沉淀技術（2）酵母雙雜交系統第八頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期一

研究者往往最開始得到有價值的EST序列，進而通過電子延伸或和相關實驗方法獲取其全長cDNA序列。這種情況下，首先要進行即是進行全長cDNA序列的開放閱讀框查找，推導其編碼蛋白質的氨基酸序列。然后，進行信號肽序列預測分析。初步判定其亞細胞定位，再進行蛋白質的基本理化性質分析，包括氨基酸組成、分子質量、等電點、親/疏水性等。最后，以已知的氨基酸序列的基礎，分析預測其高級結構。編碼產物預測分析第九頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期一規律分析Cs3亞基蛋白的計算機預測分析第十頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期一序列同源性分析

包括核苷酸序列同源性分析和氨基酸序列同源性分析，這也是目前生物信息學技術中應用最為廣泛的基本技術之一。主要采用BLAST和FASTA程序進行，即從已知的各種核酸和蛋白質序列數據庫搜索與新基因對應的功能已知的高度同源基因和蛋白質，從這些已知基因和蛋白質的功能信息中來初步推測和判斷新基因的功能。同時，因為人類全基因組測序已經完成，所以以新基因的cDNA序列來對基因組數據庫進行同源性比對，則可很方便地獲得與其完全同源基因組DNA

第十一頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期一序列及其染色體定位信息，而無需進行熒光原位雜交等基因染色體定位技術，進而還可通過分析其內含子、外顯子序列及其調節位點，推測其可能的基因表達調控方式。即通過此法確定了富含亮氨酸重復序列蛋白新基因的基因組DNA序列及其染色體定位。用expay軟件分析氨基酸序列同源性第十二頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期一

主要是通過聯網或數據庫行蛋白質是基因功能的體現者和施行者，而蛋白質的結構則是蛋白質執行生物學功能的基礎，因此對新基因所編碼蛋白質的功能域分析將對推測新基因功能提供極其有價值的信息。目前，已經有大量被發現的蘊藏于蛋白質結構中的與特定生物學活性相關的所謂保守模體。蛋白質功能域分析第十三頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期一蛋白質的結構功能域分析第十四頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期一mRNA水平的表達譜分析

對新基因在mRNA水平上的表達分析涉及到的技術有半定量RT-PCR、實時定量RT-PCR和NorthernBlot等。半定量RT-PCR方法具有簡便、快捷和經濟的特點，但其存在著精確度不高和不能進行絕對定量等缺點，多用于基因表達水平的快速初步分析。實時定量RT-PCR是近年來新發展起來的一種mRNA定量分析技術，因具有特異性更強、有效解決PCR污染和自動化程度高等的特點而被廣泛應用，但其成本相對較高。NorthernBlot歷來是在mRNA水平上對基因表達進行分析的經典技術，被各實驗室廣泛采用其不僅可以進行定量分析，而且還能夠檢測基因轉錄本的大小及種類，這也是RT-PCR技術所不具備的優勢但NorthernBlot操作較為繁瑣，采用放射性標記時也存在放射性污染的問題。在實際工作中，需結合這兩類方法同時進行，互為補充。另外，必要時也應考慮使用原位雜交技術來對新基因的mRNA在特定組織細胞內的分布進行定位觀察。第十五頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期一蛋白質的水平表達分析確定新基因在哪些組織細胞被轉錄后，進一步的工作則是制備相應的抗體來檢測其蛋白質終產物的表達情況，如該蛋白質表達的亞細胞定位、分子質量大小、聚體形式等。這種在蛋白質水平上的表達分析涉及到的常用技術主要是WesternBlot和免疫組化等。

其中，WesternBlot與NorthernBlot類似，不僅可以進行定量分析，而且還能夠檢測蛋白質的分子質量大小及其聚體形式。而免疫組化技術的優勢則在于其能夠確定蛋白質是在特定組織中的哪些細胞以及在特定細胞的哪個部位中表達。Westernblot第十六頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期一另外，對于病態組織細胞而言，在mRNA和蛋白質兩個水平上的新基因的表達分析，還可以提供其基因表達調控的大致規律，譬如是主要在轉錄水平還是在翻譯水平上被調控的。不少研究表明，細胞內特定基因的mRNA水平變化和蛋白質水平變化的一致性很差。第十七頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期一基因轉染技術通過基因轉染，即將目的基因轉入某一細胞中通過觀察細胞生物學行為的變化來認識基因的功能，是目前應用最多、技術最成熟的基因功能研究方法。第十八頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期一如經典的RAS癌基因的功能即通過轉染NIH-3T3細胞而得以鑒定目前常用的基轉染系統分為非病毒性表達系統和病毒性表達兩種，非病毒性表達載體目前主要采用質粒，通過脂質體介導、電穿孔等方法使目的基因被宿主細胞攝取，然而，盡管這類表達系統具有操作簡便、經濟等優勢，其也有不少局限性，主要問題是，不同細胞類型對外源DNA的攝取能力有所不同，尤其在初級未轉化的細胞中幾乎是無效的，而初級細胞對于觀察基因的細胞轉化活性等行為恰恰非常有用。然而，病毒性載體，尤其是逆轉錄病毒載體的使用卻能夠很好的解決此問題，這類以病毒為載體介導的基因轉移因其具有轉染效率高、目的基因可穩定表達等優勢而被廣泛應用。第十九頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期一轉基因技術

利用轉基因技術，則可將外源基因引入動物體內，建立攜帶并且能夠遺傳給子代的轉基因動物模型，通過對轉基因動物的表型分析研究外源基因的功能，目前已經運用轉基因技術建立了數千種轉基因動物，并且還可以通過在攜帶外源基因的載體上加上組織特異性啟動子等手段，從而控制外源基因在特定的時間或特定的組織器官表達。利用轉基因動物來研究基因功能的優勢在于它是一個在活體水平上的多維的研究體系，可以從分子到個體水平進行多層次、多方位的研究。

第二十頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期一第二十一頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期一基因沉默技術

這類技術中最常用的主要為反義寡核苷酸（ASON）、核酶和RNA干擾（RNAi）技術。然而，包括這3種技術在內的該類技術均具有誘導干擾素和其它細胞因子表達等非特異性效應，另外，它們也會因為作用與和靶分子序列相近的分子而產生脫靶效應，其中，ASON因使用劑量大，其非特異性效應最大；而RNAi的這兩種副效應最小。第二十二頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期一基因敲除

或稱基因打靶，是建立在胚胎干細胞技術和同源重組技術基礎上的一種方法。既可以在細胞水平上進行，從而建立新的細胞系，也可以在整體水平進行以建立基因敲除動物，通過觀察個體的表型變化而推測基因在體內的可能功能。利用基因敲除技術獲得的基因敲除動物已成為目前研究基因功能最直接和最有效的方法之一。但因技術條件和費用較高、僅限于小鼠等缺點，且在胚胎期消除了目的基因的功能，可能只反映一部分基因功能；或者某些重要基因被剔除后可導致小鼠在胚胎期凋亡，無法檢測對各發育階段的影響，使基因剔除技術的應用受到限制。同時很多情況下，其結果也是不明朗的。第二十三頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期一基因敲除小鼠技術第二十四頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期一免疫共沉淀技術第二十五頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期一免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。該方法的優點是：相互作用的蛋白質都是經翻譯后修飾的，所處的環境條件也是接近天然狀態的，能夠反映體內的