基因重組技術(shù)概述第1頁/共64頁DNA重組技術(shù)前言第2頁/共64頁

一、重組DNA技術(shù)的誕生

（一）重組DNA技術(shù)誕生的理論基礎(chǔ)

1.40年代明確了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA

肺炎鏈球菌

第3頁/共64頁第4頁/共64頁2、50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制第5頁/共64頁3、50年代末和60年代提出了“中心法則”和操縱子學說，并成功地破譯了遺傳密碼。

中心法則

第6頁/共64頁遺傳密碼

64個密碼子

61個代表各種氨基酸（AUG起始密碼）

3個密碼子為終止子（UAA、UAG、UGA）第7頁/共64頁操縱子

用基因表達調(diào)控的原理解釋了酶誘導(dǎo)的本質(zhì)。第8頁/共64頁

（二）關(guān)鍵性實驗技術(shù)問世為重組DNA技術(shù)奠定基礎(chǔ)

1.DNA分子的切割與連接技術(shù)

2.載體構(gòu)建和大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立

3.Southern雜交、DNA序列分析和聚合酶鏈式反應(yīng)第9頁/共64頁二.重組DNA技術(shù)的定義及步驟

（一）重組DNA技術(shù)

1、重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechnology):

按照人的意愿，在體外對DNA分子進行重組，再將重組分子導(dǎo)入受體細胞，使其在細胞中擴增和繁殖，以獲得該DNA分子的大量拷貝，表達相關(guān)基因的產(chǎn)物，是進行基因功能研究的基本方法。第10頁/共64頁2.克隆（clone):

指由一個細胞通過無性繁殖以后形成的與親代完全相同的子代群體。分子克隆（molecularcloning）：

構(gòu)建DNA重組體并導(dǎo)入宿主細胞建立無性繁殖體系。第11頁/共64頁（二）重組DNA技術(shù)的重大意義

1.填平了生物種屬間不可逾越的鴻溝。

2.縮短了進化時間。

3.使人能對生物體進行定向構(gòu)造。第12頁/共64頁三、工具酶

（一）限制性核酸內(nèi)切酶

是一類能識別和切割雙鏈DNA分子中特定堿基順序的核酸水解酶。第13頁/共64頁2.命名

※第一個字母（大寫、斜體）

該酶的微生物屬名

※第二、三個字母（小寫、斜體）

代表微生物種名

※第四個字母（斜體）

代表寄主菌的株或型

※用羅馬數(shù)碼I、II、III等區(qū)分同一株具

有不同特異性的酶第14頁/共64頁例流感嗜血桿菌中三個酶的命名：

Haemophilusinfluenzaed

屬名種名株系

Hind

I

II

III

HindIHindIIHindIII

第15頁/共64頁2.分類

根據(jù)限制酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性可分為：

I型

II型

III型

第16頁/共64頁（1）I型限制酶

屬于復(fù)合功能酶，兼有修飾和切割DNA兩種特性。

功能核酸內(nèi)切酶

甲基化酶

ATP酶

DNA解旋酶特點：識別和切割位點不一致沒有固定的切割位點隨機切割不產(chǎn)生特異片段

第17頁/共64頁（2）III型酶

與I型酶特性類似，也有甲基化功能，但無ATP酶和DNA解旋酶活力。

在DNA鏈上有特異位點切割，其切割位點在識別位點以外。

（3）II型酶

第18頁/共64頁3.II型酶

（1）II型酶的識別

識別序列一般為4-6個堿基對，通常是反轉(zhuǎn)重復(fù)順序，具有180o的旋轉(zhuǎn)對稱性。

（2）II型酶的切割功能

★平末端（bluntend)

在識別順序的對稱軸上，對雙鏈DNA同時切割。第19頁/共64頁★5’端粘性末端（cohesiveend)

在識別順序的雙側(cè)末端切割DNA雙鏈，于對稱軸的5’末端切割。第20頁/共64頁★

3’端粘性末端

在識別順序的雙側(cè)末端切割DNA雙鏈，于對稱軸的3’末端切割。第21頁/共64頁（3）少數(shù)有特殊性質(zhì)的II型酶

<1>異源同工酶（isoschizomer）

定義：

來源不同但能識別和切割同一位點的酶。

5’CCGG3’3’GGCC5’

5’CCGG3’3’GGCC5’HpaII、MspI第22頁/共64頁<2>同尾酶（isocaudarner)

為識別與切割順序相互有關(guān)的酶。

有些限制酶的識別序列包含在另一些限制酶的識別順序之中

酶來源不同，但它們作用后能產(chǎn)生相同的粘性末端。5’

GGATCC3’3’CCTAGG5’5’

AGATCC3’3’CCTAGA5’BamHIBagII5’

G

GATC

C3’3’C

CTAG

G5’第23頁/共64頁特點：

兩個同尾酶消化的DNA片段，可以相互連接，連接后的重組DNA分子，可以被其中一種酶識別，也可能原來的任何一個同尾酶均不能識別。

第24頁/共64頁5.限制性內(nèi)切酶的星號活力

（1）定義：

限制性內(nèi)切酶在非標準反應(yīng)條件下，能夠切割一些與其特異識別順序類似的序列，這種現(xiàn)象稱星號活力。

（2）表示：

在相應(yīng)限制酶的名稱，右上角加一個星號（*）。

第25頁/共64頁（3）特點：

星號活力的識別形式常對標準識別順序中兩側(cè)的堿基沒有特異性。GACTAGCNAATTNTACGCAATTTCTGATCGNTTAANATGCGTTAAA

EcoRI*第26頁/共64頁EcoRI*第27頁/共64頁（4）產(chǎn)生的原因

a.高甘油含量（>5%V/V)

b.內(nèi)切酶用量過大，一般為>

100U/gDNA

c.低離子強度<25mmol/L

d.高pH值pH8.0

e.含有機溶劑：DMSO、乙醇、乙烯二乙醇

Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的離子存在

第28頁/共64頁（5）常見容量發(fā)生星號活力的酶有：

EcoRI、HindIII、KpnI、PstI、ScaI、SalI、XmnI、HinfI、BssHII、EcoRV

第29頁/共64頁7.II型限制酶的用途

（1）DNA重組克隆及亞克隆

（2）DNA雜交與序列分析

（3）改建質(zhì)粒

（4）構(gòu)建基因組DNA物理圖譜和文庫等

第30頁/共64頁（二）DNA聚合酶

1、大腸桿菌DNA聚合酶I及其大片段（Klenow片段）

（1）大腸桿菌DNA聚合酶I

特性：具有3種酶活性第31頁/共64頁5’3’外切功能3’5’外切功能聚合酶功能第32頁/共64頁5’CCG3’GGCTATCGA5’聚合酶dATPdTTPdGTPdCTP5’CCGATAGCT3’3’GGCTATCGA5’a.5’3’DNA聚合酶活性

底物：單鏈DNA模板及帶3’羥基的DNA引物第33頁/共64頁5’CCG3’3’GGC5’聚合酶5’CCGATAGCT3’3’GGC5’ATAGCT

b.3’5’外切酶活性

底物：

帶3’羥基的雙鏈DNA或單鏈DNA、從3’羥基端降解DNA。對雙鏈DNA鏈的外切核酸酶活性可被5’3’DNA聚合酶活性所封閉。第34頁/共64頁c.5’3’外切酶活性：

能從游離的5’末端降解DNA成為單核苷酸。5’CCGATAGCT3’3’GGCTATCGAAT5’聚合酶5’CCGATAGCT3’3’GGCTATCGA5’TATA第35頁/共64頁（2）Klenow片段

從大腸桿菌DNA聚合酶I中去除5’3’外切酶活性，即得Klenow片段。

其只具有5’3’聚合酶活性

3’5’外切酶活性

第36頁/共64頁

35kD76kD苦草桿菌蛋白酶裂解全酶5’3’外切酶5’3’聚合酶3’5’外切酶5’3’聚合酶3’5’外切酶Klenow片段DNA聚合酶I全酶第37頁/共64頁應(yīng)用

1.催化DNA切口平移反應(yīng)，置備高比活DNA探針。(大腸桿菌DNA聚合酶I）DNaseIDNA聚合酶IdNTP32P-dNTP第38頁/共64頁2.對DNA分子進行末端標記（Klenow）第39頁/共64頁2.TaqDNA聚合酶

(1)特性：

①耐熱的DNA聚合酶

來自于嗜熱的棲熱水生菌Thermusaquaticus

中純化而來的。

②5’3’聚合酶活性

③5’3’外切酶活性

④最佳作用溫度為75-80C

（2）用途

①通過PCR對DNA分子的特定序列進行體外擴增

②對DNA進行測序

第40頁/共64頁3.反轉(zhuǎn)錄酶（依賴于RNA的DNA聚合酶，RDDP）

（1）特性

①催化從RNA為模板的DNA聚合反應(yīng)

②具3’5’RNA外切酶活性，能特異性降解RNA—DNA雜交分子中的RNA部分

③具DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶（DDDP）的功能

④能以mRNA為模板催化合成出互補的DNA（cDNA）

第41頁/共64頁（2）分類

①禽源反轉(zhuǎn)錄酶

來自禽或骨髓細胞瘤病毒（AMV）

具有聚合酶活性及強的RNA酶H活性

無3’5’外切酶活性。

溫度42C

pH8.6時活性較高

第42頁/共64頁②鼠源反轉(zhuǎn)錄酶

來自Moloney鼠白血病病毒（M-MLV）

具有聚合酶活性及相對較弱的RNA酶H活性無3’5’外切酶活性

溫度37C

pH7.6時活性較高

第43頁/共64頁第44頁/共64頁第45頁/共64頁4.末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（末端轉(zhuǎn)移酶）

催化dNTP加到DNA分子的3’羥基端第46頁/共64頁3’末端標記添加多聚體尾第47頁/共64頁（三）DNA連接酶

1.定義：DNALigasesareprimarilyresponsibleforjoiningthegapsthatforminDNAduringreplication

(i.e.,thejoiningofOkazakifragmentsformedbydiscontinuousorlaggingstrandreplication),DNArepair,andrecombination.

催化雙鏈DNA一端的3’OH與另一雙鏈DNA5’的磷酸根形成3’，5’-磷酸二酯鍵，使具有相同粘性末端或平末端的DNA末端連接起來。第48頁/共64頁3.特點：

催化DNA5’磷酸基與3’羥基之間（切口）形成磷酸二酯鍵。

切口(nick)：DNA分子糖-磷酸主鍵的破壞。

缺口(gap)：DNA分子中核苷酸缺失。2.分類：

T4噬菌體DNA連接酶

大腸桿菌DNA連接酶

第49頁/共64頁

4.用途：

①連接帶匹配粘端的DNA分子。

②使平端的雙鏈DNA分子互相連接或與合成

接頭相連接。

第50頁/共64頁5.反應(yīng)例解：

（1）互補粘端DNA

(或切口間的連接)

5’

ACGOH

pAATTCGT3’

3’TGCTTAAp

HOGCA5’

ATP、Mg2+

T4連接酶

5’

ACGAATTCGT3’

3’

TGCTTAAGCA

5’

第51頁/共64頁（2）平端連接

5’

CGAOG

pCGTA3’

3’GCTp

OHGCAT5’

ATP、Mg2+T4連接酶

5’

CGACGTA

3’

3’

GCTGCAT

5’

第52頁/共64頁第53頁/共64頁（四）T4多核苷酸激酶T4polynucleotidekinase(T4PNK)

催化將ATP的-磷酸轉(zhuǎn)移到DNA鏈的5’末端1.反應(yīng)分類

（1）前向反應(yīng)

將ATP的-磷酸轉(zhuǎn)移到脫磷酸的DNA鏈的5’末端第54頁/共64頁（2）交換反應(yīng)

過量的ADP使T4多核苷酸激酶將5’-末端磷酸從磷酸化的DNA鏈中轉(zhuǎn)移到ADP上生成ATP，然后再從[-32P]dATP上將標記的磷酸轉(zhuǎn)移到DNA鏈上，使其重新磷酸化。第55頁/共64頁用途

①標記DNA鏈的5’末端

②連接反應(yīng)第56頁/共64頁（五）堿性磷酸酶alkalinephosphatase(CIAP)

1.特性：

催化去除DNA、RNA和dNTP的5’磷酸的反應(yīng)。

2.