沈陽藥科大學本科畢業論文 論文題目：骨疏丹方劑的大孔樹脂純化工藝研究起止時間：2011年3月2日—6月24日姓名學號：所在學院：藥學院年級班級：2007級藥學一班指導教師：實習單位：沈陽藥科大學分析化學教研室目錄TOC\o"1-4"\h\z\u摘要 1Abstracts 2第一章前言 31.1骨疏丹處方簡介及研究概況 31.1.1處方各味藥材的介紹 31.1.2骨疏丹處方的藥理學研究 31.1.3配伍機制研究 41.1.4促成骨細胞活性成分群研究 41.1.5提取工藝與質量控制方法 41.2中藥的現代除雜技術 51.2.1大孔吸附樹脂 51.2.2大孔吸附樹脂的類型 51.2.3大孔吸附樹脂分離技術操作流程 61.2.4影響大孔吸附樹脂技術的因素 61.2.5大孔吸附樹脂的優缺點 71.3本文的立題依據及研究思路 71.3.1立題依據 71.3.2研究思路 8第二章實驗部分 92.1實驗材料 92.1.1儀器 92.1.2試劑 92.1.3藥材 102.2上柱藥液的制備 102.3指標成分的含量測定 102.3.1總黃酮的含量測定 102.3.1.1對照品溶液的制備 102.3.1.2標準曲線的繪制 102.3.1.3樣品的測定 102.3.2總香豆素的含量測定 102.3.2.1對照品溶液的制備 102.3.2.2標準曲線的繪制 112.3.2.3樣品的測定 112.3.3HPLC同時測定5種活性成分 112.3.3.15種活性成分的結構式 112.3.3.2色譜條件及系統適用性試驗 112.2.3.3混合對照品溶液的制備 122.2.3.4供試品溶液的制備 122.3.3.5樣品的測定 132.4浸膏的測定 132.5大孔吸附樹脂的選擇 132.5.1大孔樹脂的靜態吸附試驗 142.5.2大孔樹脂的靜態解吸附試驗 142.5.3試驗結果 142.6D101型樹脂吸附工藝研究 152.6.1吸附工藝正交設計 152.6.2吸附工藝正交試驗結果 152.6.3正交試驗結果分析 162.6.4驗證試驗 172.7D101型樹脂洗脫工藝研究 182.7.1洗脫工藝正交設計 182.7.2洗脫工藝正交試驗結果 192.7.3洗脫工藝正交試驗結果分析 192.7.4驗證試驗 212.8大孔吸附樹脂的重復使用次數 23第三章討論 243.1討論 243.1.1正交試驗指標成分的確定 243.1.2上樣溶液溫度 243.1.3上樣濃度的選擇 243.1.4預吸附時間的確定 243.1.5吸附正交試驗中上樣體積因素下水平的選擇及確定 243.1.6洗脫正交試驗中洗脫體積因素下水平的選擇 253.1.7洗脫流速的確定 25第四章結論 26參考文獻 27致謝 28摘要本文建立了骨疏丹提取物的大孔吸附樹脂純化工藝，通過靜態和動態試驗以總黃酮、總香豆素保留率及純度為指標，對影響大孔樹脂富集純化因素進行優化，最后通過HPLC法測定的5個活性成分含量之和的保留率將最優條件加以驗證。結果表明：D101型大孔吸附樹脂對骨疏丹中總黃酮、總香豆素的吸附、解吸能力較強。骨疏丹提取物的上樣濃度為0.250g·ml-1(生藥濃度)，室溫上樣，上樣體積為2.5BV，吸附速度為2BV·h-1，上樣后立即洗脫，水洗體積為7BV，棄去水洗液后，用5BV80%乙醇洗脫，收集醇洗脫液，結果總黃酮、總香豆素純度之和提高2.99倍，樹脂可重復使用15次以上需再生。此純化工藝穩定可靠，為工業上大規模純化骨疏丹提取物提供了科學依據。關鍵詞：骨疏丹，大孔吸附樹脂，純化AbstractsThepurificationprogressforGushudanextractswasestablishedwithmacroporousadsorptionresin.ThestaticanddynamicadsorptiontestswereemployedtoinvestigateeffectsofseparationandpurificationforthetotalflavonoisdandcoumarinsfromGushudanextractswiththerecoveryrateofthetotalflavonoidsandcoumarins,degreeofpurityasindex.Atlast,therecoveryrateoffiveactivecompoundwasverifybyHPLC.TheresultshowedthatD101typeresinhadbetteradsorptionanddesorptionpropertiestototalflavonoidsandcoumarinsofGushudanextracts.Andtheoptimalpurifyingconditionwasasfollows:theGushudanextractssolutionof2.5timesvolumesoftheresin(0.250mg·ml-1oftheCrudedrugoncentration)wasloadedwithaspeedof2timesvolumeoftheresin·h-1inroomtemperate,andthediamter-heightratiooftheresinis1:3,theimpuritywaswashedawaywith7timesvolumeoftheresinwates.Andthen,thetotalflavonoidsandcoumarinswereeluatedwith80%ethanol.Andtheeluantvolumewas5timesoftheresin.Theelutingratewas5timesvolumeoftheresin·h-1.Theresultsshowedthatthedegreeofpuritytotalflavonoisdandcoumarinsishigherby2.99times,andtheresinisreuseablefor15times.Theoptimizedprocesswasstableandfeasible.ForindustrypurificationGushudanextractofferscientificbasis.Keyword:Gushudan,macroporousadsorptionresin,purificati第一章前言1.1骨疏丹處方簡介及研究概況骨疏丹處方是根據骨質疏松癥的發病機理，以中醫藥理論和多年臨床實踐為基礎，利用其“中藥小復方精選系統操作技術平臺[1]”和“《普濟方》數據庫管理系統”精心擬定而成，由淫羊藿、骨碎補、蛇床子、丹參四味中藥組成。具有補益肝腎，強壯筋骨，活血止痛的功效。用于肝腎不足證原發性骨質疏松癥。我實驗室前期已對其進行深入的研究。1.1.1處方各味藥材的介紹淫羊藿為小檗科植物淫羊藿(EpimediumbrevicornuMaxim.)、箭葉淫羊藿(Epimediumsagittatum(Sieb.etZucc.)Maxim.)、柔毛淫羊藿(EpimediumpubescensMaxim.)、或朝鮮淫羊藿(EpimediumkoreanumNakai)的干燥葉，夏、秋季莖葉茂盛時采集，曬干或陰干。味辛甘、性溫，歸肝腎經。有補腎陽、強筋骨之效，用于治療筋骨痿軟、麻木拘攣[2]。淫羊藿中主要含黃酮類化合物，包括淫羊藿苷、朝藿定B、朝藿定C等[3]。骨碎補為水龍骨科植物槲蕨Drynariafortunei(Kunze)J.Sm.的干燥根莖，呈扁平長條狀，多彎曲，有分枝，表面覆蓋深棕色的小鱗片，柔軟如毛，經火燎著呈棕褐色或暗褐色。味苦性溫，入肝腎經，可療傷止痛，補腎強骨，外用消風祛斑[4]。骨碎補中含有柚皮苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、咖啡酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、4-O-β-D-吡喃葡萄糖基香豆酸、對羥基反式肉桂酸、反式桂皮酸、3,4-二羥基苯甲酸、5-羥甲基糠醛、蔗糖等[5]。蛇床子為傘形科植物蛇床Cnidiummonnieri(L.)Cuss.的干燥成熟果實，夏秋二季果實成熟時采集，除去雜質，曬干。果實為雙懸果細小，呈橢圓形。其有溫腎壯陽，燥濕，祛風，殺蟲止癢之效[6]。蛇床子含有多種化學成分，主要含香豆素類化合物，此外還有色原酮類，苯并呋喃類，糖類，以及萜醇類等多種化合物[7]。丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，春秋二季采挖，除去泥沙干燥，其有祛瘀止痛，活血通經，清心除煩的功能[8]。[8]藥典?（70-71）。丹參的化學成分分為脂溶性和水溶性兩類。脂溶性成分主要包含丹參酮I、丹參酮Ⅱa、丹參酮Ⅱb、隱丹參酮等，水溶性成分主要為酚酸類物質，其中包含：丹參素、丹參酸乙、丹參酸丙、丹參酚酸A、丹酚酸B、咖啡酸、迷迭香酸[9]。1.1.2骨疏丹處方的藥理學研究[10]選用雙側去卵巢所致的雌性大鼠骨質疏松模型，考察了骨疏丹方劑醇提物的抗骨質疏松藥效和在動物體內的促骨形成作用。結果表明，給予骨疏丹提取物后，高、中劑量給藥組大鼠的骨密度明顯增加，堿性磷酸酶活性明顯降低，血清骨鈣素、雌二醇水平有顯著性的提高，提示骨疏丹方劑可有效抑制過高的骨轉換率，促進骨形成而發揮抗骨質疏松作用；給藥高劑量組的骨鈣、骨磷含量與模型組相比均顯著增加，骨干重、去脂干重及灰重有顯著增加的趨勢。中、高劑量給藥組的骨強度均顯著高于模型組，提示骨疏丹方劑可促進骨礦物質在骨的沉積，提高大鼠骨礦量和骨密度。骨質疏松癥臨床以疼痛為主，采用醋酸扭體法考察了骨疏丹方劑的鎮痛作用。研究表明給予高劑量骨疏丹方劑能使醋酸所致的小鼠扭體次數明顯減少，具有明顯的鎮痛作用；中、低劑量也顯示出一定的鎮痛效應。1.1.3配伍機制研究應用本實驗室建立的成骨樣細胞UMR106活性檢測技術，以促進成骨樣細胞增殖和分化的作用為活性檢測指標，確定骨疏丹方劑以75%乙醇回流提取所得提取物具有較強的促進成骨樣細胞的增殖與分化的作用；在此基礎上，利用正交實驗設計法對骨疏丹方劑進行了拆方研究，考察了16個子方對成骨樣細胞增殖和分化的作用，從細胞水平驗證了骨疏丹組方中四種單味藥材之間君臣佐使的配伍作用，確定了骨疏丹方劑各味藥用量的最佳配比[10]。本同時實驗室將HPLC數據與促成骨樣細胞UMR106增殖活性進行相關性分析，驗證了淫羊藿在方中促成骨樣細胞增殖的主導地位，且藥物配伍后各處方的促細胞增殖作用均強于淫羊藿的單獨作用，三味藥的協同作用強于兩味藥，四味藥配伍后使細胞增殖活性達到最大[11]。1.1.4促成骨細胞活性成分群研究[10]采用薄層色譜、硅膠柱色譜、ODS柱色譜等現代分離技術，以成骨樣細胞UMR106的增殖與分化為活性追蹤指標，對骨疏丹方劑中的活性成分(群)進行了追蹤分離。從淫羊藿的主要活性部位正丁醇層中分離純化得到了金絲桃苷、淫羊藿苷、朝藿定B、朝藿定C和肌醇。從蛇床子的主要活性部位氯仿層分離純化得到了蛇床子素、β-谷甾醇、佛手苷內酯和歐前胡素。從骨碎補的主要活性部位正丁醇層分離純化得到了新北美圣草苷和柚皮苷。丹參的主要活性部位為氯仿層。結果發現黃酮類化合物淫羊藿苷、朝藿定B和朝藿定C能顯著地促進成骨樣細胞增殖和分化作用。香豆素類化合物蛇床子素、佛手苷內酯和歐前胡素具有促成骨樣細胞增殖和分化的作用。骨碎補中新北美圣草苷和柚皮苷具有較強的促成骨樣細胞增殖作用。丹參酮ⅡA具有顯著的促成骨樣細胞分化作用。1.1.5提取工藝與質量控制方法利用正交試驗設計,以活性指標成分淫羊藿苷、蛇床子素、柚皮苷和丹參酮ⅡA的含量以及浸膏重量為評價指標，對骨疏丹方劑的醇提工藝進行了優化。經過綜合評價確立了骨疏丹方劑的最優醇提工藝為12倍量的75%乙醇為提取溶劑，提取3次，每次90min[10]。劉曼建立了紫外分光光度法測定了骨疏丹方劑中總黃酮和總香豆素的含量，并以總黃酮與總香豆素含量為評價指標，再次優化提取條件，結果驗證最佳提取條件與原工藝一致[11]。在此基礎上，又以活性指標成分柚皮苷、朝藿定B、淫羊藿苷、蛇床子素、和丹參酮ⅡA的含量，以及總黃酮、總香豆素及浸膏重量為評價指標，又將最佳提取工藝優化為2次，其他提取條件不變(待發表)。李超將骨疏丹方劑制成顆粒劑[12]，并根據藥效學試驗，得出人體口服骨疏丹顆粒劑的日服劑量，但因日服劑量過大，根據申報新藥的要求，需對骨疏丹方劑除雜，減少浸膏率，提高單位浸膏中有效成分的含量。1.2中藥的現代除雜技術由于醇沉的沉淀面廣，除雜專屬性差，且具有成分高，工藝周期長，不便于連續化生產，成品穩定性差等特點，逐漸被一些現代除雜技術所取代，如膜分離技術，大孔吸附樹脂技術和高速離心技術等。查閱相關文獻可知，方中君藥淫羊藿總黃酮及淫羊藿苷的富集多采用大孔樹脂吸附法，而劉健偉等采用D101大孔吸附樹脂純化骨碎補總黃酮提取物，使純化后提取物中總黃酮含量高達66.0%，而上柱純化前總黃酮的含量只有24.5%[13]。而史萬忠等采用DM301大孔吸附樹脂純化補腎方(何首烏、淫羊藿苷、骨碎補等），使有效成分總黃酮得到較好富集[14]。而香豆素類化合物也多采用大孔吸附樹脂法進行分離純化，湯春妮采用HPD300樹脂使香豆素含量約50%的樣品純度提高到97%以上[15]。張霄翔等采用D101樹脂純化丹參總酚酸，使純化后樣品中總酚酸含量達到77.74%，比粗提物中總酚酸含量提高了3.6倍[16]。綜上所述，我室決定采用大孔吸附樹脂對骨疏丹提取物進行純化。1.2.1大孔吸附樹脂大孔吸附樹脂是二十世紀六十年代發展起來的一類具有良好吸附性能的不含離子交換基團的有機高聚物吸附劑[17]，具有很好的大孔網狀結構和較大的比表面積，可以通過物理吸附從水溶液中有選擇性的吸附有機物。其吸附性能與活性炭相似，從相互作用力的角度觀察，它所具有的吸附性與范德華力或氫鍵有關，篩選性能與具有網狀結構和很高的比表面積有關。從顯微結構上看，大孔吸附樹脂包含有許多具有微觀小球組成的網狀空穴結構，因此顆粒的比表面積很大，加上合成時引入一定的極性基團，使大孔樹脂具有較大的吸附能力；另一方面，這些網狀空穴在合成樹脂時具有一定的孔徑，使得它們對通過孔徑的化合物根據其分子量的不同具有一定的選擇性。通過以上吸附性和篩選原理，有機化合物根據吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附樹脂上經過一定的溶劑洗脫而達到分離的目的[18]。1.2.2大孔吸附樹脂的類型大孔吸附樹脂按其極性大小和所選用的單體分子結構不同，可分為非極性、中極性和極性三類[19]。(1)非極性大孔吸附樹脂是由偶極矩很小的單體聚合制得的不帶任何功能基，孔表的疏水性較強，可通過與小分子內的疏水部分的作用吸附溶液中的有機物，最適于由極性溶劑中吸附非極性物質，也稱為芳香族吸附劑，例如苯乙烯、二乙烯苯聚合物；(2)中等極性大孔吸附樹脂是含酯基的吸附樹脂,以多功能團的甲基丙烯酯作為交聯劑。其表面兼有疏水和親水兩部分。既可由極性溶劑中吸附非極性物質，又可作為非極性溶劑中吸附極性物質，也稱為脂肪族吸附劑，例如聚丙烯酸酯型聚合物；(3)極性大孔吸附樹脂是指含酰胺基、氰基、酚羥基等含氮、氧、硫極性功能基團的吸附樹脂，它們通過靜電相互作用吸附極性物質，如丙烯酰胺。1.2.3大孔吸附樹脂分離技術操作流程[20]在運用大孔吸附樹脂進行分離精制工藝時，其大致操作步驟為：大孔吸附樹脂預處理→樹脂上柱→藥液上柱→大孔吸附樹脂的解吸→大孔吸附樹脂的清洗、再生。由于每一個操作單元都會影響到大孔樹脂的分離效果，因此對大孔吸附樹脂的精制工藝和分離技術的要求就相對較高。1.2.4影響大孔吸附樹脂技術的因素(1)大孔吸附樹脂規格的影響[21]：大孔吸附樹脂的理化性質對吸附分離的影響很大，一般要求吸附容量大，吸附速度快和機械強度好。由于樹脂極性、孔度、孔徑和比表面積不同，故性質不同，使用時必須根據情況加以選擇。(2)上樣溶劑性質的影響[18]：通常一種成分在某種溶劑中溶解度大，則在該溶劑中，大孔吸附樹脂對該成分的吸附力就小，反之亦然。吸附量與藥液濃度符合Frendich和Aanmur經典吸附公式，即藥液濃度增加吸附量增加，但藥液濃度增加有一定限度，即不能超過大孔吸附樹脂的飽和吸附容量。一般樹脂吸附量與藥液濃度成反比，通常以較低濃度進行吸附較為有利，如果藥液濃度偏高，則吸附容量會顯著減少。(3)吸附流速的影響：對于同一濃度的上樣溶液，吸附流速過大，樹脂的吸附量就會降低，但吸附流速過小，吸附時間就會增加，在實際應用中，應綜合考慮來確定最佳吸附流速，既要使大孔吸附樹脂的吸附效果好，又要保證較高的工作效率。(4)大孔樹脂柱內徑與其柱高比例也影響大孔吸附樹脂吸附效果。合適的徑高比可為分離提供較高的柱效，從而更有利于大孔吸附樹脂的吸附和分離。(5)洗脫溶劑性質的影響[22]：常用低級醇溶液洗脫，所選用的溶劑應符合兩種要求：一種要求溶劑應能使大孔網狀吸附劑溶脹，這樣可減弱溶質與吸附劑之間的吸附力；另一種則要求所選用的溶劑應容易溶解吸附物。因為解吸時不僅需克服吸附力，而且當溶劑分子擴散到吸附中心后，應能使溶質很快溶解。(6)洗脫流速的影響：一般情況下，洗脫流速過大，洗脫溶劑還沒來得及交換和溶解在大孔吸附樹脂上被吸附的有效成分，就從柱中流出，從而沒有達到分離純化的目的，而且耗費溶劑，但洗脫流速過小，洗脫時間就會增加。在實際應用中，應綜合考慮來確定最佳洗脫流速。1.2.5大孔吸附樹脂的優缺點[21]優點：(1)應用范圍，表現為許多生物活性物質對pH較為敏感，易受酸堿作用而失去活性，這限制了離子交換法的應用，而采用大孔吸附樹脂吸附過程中整個pH不變；(2)理化性質穩定、分離性能優良、使用方便，大孔樹脂對有機物的選擇性良好，且脫水能力強，效果不亞于火星炭；(3)較少產品的吸潮性，傳統工藝制備的中成要大部分具有較強的吸潮性，是中藥生產及貯藏中長期存在的難題。而經大孔樹脂吸附技術處理后，可有效去除大量的糖類、無機鹽、粘液質等吸潮成分，有利于多種中藥劑型的生產，增強產品的穩定性；(4)溶劑用量少，大孔樹脂可同時完成除雜和濃縮兩道工序，僅用少量的溶劑洗脫即達到分離的目的，而且避免了嚴重的乳化現象，提高了；(5)可重復使用，降低成本、縮短生產周期。不足與改進：(1)大孔吸附樹脂價格較貴，吸附效果易受流速和溶劑濃度的影響；品種有限，不能滿足中藥多成分、多結構的需求；操作較復雜，對樹脂的技術要求較高；(2)致孔劑和降解物的毒性問題，但在長期試驗中，已經摸索出了樹脂使用前對致孔劑、降解物的處理方法，并形成了一整套完整的檢測方法，制定了苯、甲苯等的質量控制標準，并通過了國家藥品監督管理局的審評；(3)吸附量問題，該問題也曾引起廣泛的關注，但只要經常進行上柱前后藥液中指標成分含量的檢測，及時處理或更換樹脂即可解決。近年來，大孔樹脂廣泛用于抗生素的分離提純，維生素的分離提純，富集中藥制劑中的有效成分，克服中藥“粗、黑、大”及服用劑量大等缺點，為實現中藥復方制劑工藝改革的產業化、現代化提供了新的思路和方法。1.3本文的立題依據及研究思路1.3.1立題依據目前骨質疏松病日益嚴重，西醫治療骨質疏松的藥物雖然很多，但均有不同程度的副作用，不能滿足臨床治療的需要。中醫藥治療骨質疏松具有副作用小的特點，并且在修復骨質，提高骨量的同時，還能調節內分泌、免疫等多個系統的功能狀態，可起到標本兼治、綜合治療的目的。中藥小復方骨疏丹正是基于這一思想建立起來的，具有較強的抗骨質疏松作用，但因浸膏服用量大，浸膏中含有大量的吸濕性成分，不利于制成現代制劑，因此考慮在不降低藥效的基礎上，擬采用大孔吸附樹脂法對骨疏丹方劑進行純化，以有效降低浸膏率，減少浸膏的吸濕性。1.3.2研究思路本文通過指標成分總黃酮與總香豆素的靜態比吸附量、解吸率從4種大孔吸附樹脂中優選出對總黃酮和總香豆素吸附、解吸能力均較強的D101大孔吸附樹脂；采用L9(34)正交設計試驗分別優選了D101大孔吸附樹脂純化骨疏丹的最佳吸附、解吸工藝；通過HPLC圖譜驗證了最佳純化工藝中活性成分柚皮苷、朝藿定B、淫羊藿苷、蛇床子素、丹參酮ⅡA的含量保留率；最后采用確定工藝考察了D101大孔吸附樹脂純化骨疏丹方劑的重復使用次數，為工業上大規模純化骨疏丹提取物提供了指導意義。第二章實驗部分2.1實驗材料2.1.1儀器Jasco-PU-980型高效液相色譜儀日本分光公司Jasco-UV-975型紫外-可見檢測器日本分光公司ANASTARCHROMATOGPAPHY色譜工作站ScientificSystemInc.752型紫外可見分光光度計上海光譜儀器有限公司HY-2調速多用振蕩器國華儀器有限公司AL104分析天平德國梅特勒公司YP電子天平上海光正醫療儀器有限公司KQ-300DE型超聲波清洗機昆山市超聲儀器有限公司SZ-93自動雙重純水蒸餾器上海亞榮生化儀器廠旋轉蒸發器上海亞榮生化儀器廠TGL-16C型離心機上海手術器械廠2.1.2試劑甲醇(色譜純)天津康科德科技有限公司乙腈(色譜純)天津康科德科技有限公司95%乙醇(分析純)沈陽市富康消毒藥劑廠柚皮苷(純度99%以上)自制朝藿定B(批號A0229)成都曼斯特生物科技有限公司淫羊藿苷(批號110822-200305)中國藥品生物制品檢定所蛇床子素(批號110826-201013)中國藥品生物制品檢定所丹參酮ⅡA(批號110826-200513)中國藥品生物制品檢定所雙蒸水自制D101型大孔吸附樹脂滄州寶恩化工有限公司AB-8型大孔吸附樹脂滄州寶恩化工有限公司DM130型大孔吸附樹脂滄州寶恩化工有限公司DA201型大孔吸附樹脂滄州寶恩化工有限公司2.1.3藥材淫羊藿、骨碎補、蛇床子、丹參4味藥材均經過我校中藥學院路金才教授鑒定。淫羊藿為小檗科植物淫羊藿EpimediumbrevicornumMaxim.的干燥葉，產地甘肅，購自亳州千草藥業有限公司。骨碎補為水龍骨科植物槲蕨Drynariafortuner(Kunze)J.Sm.的干燥根莖，產地湖北，購自河北祁新中藥顆粒飲片廠。蛇床子為傘形科植物蛇床Cnidiummonnieri(L.)Cuss.的干燥成熟果實，產地江蘇，購自--。丹參為為雙子葉植物唇形科植物丹參SalbiamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，產地山東，購自--。將上述各單味藥材粉碎成粗粉，備用。2.2上柱藥液的制備按處方比例取藥材適量，加12倍量75%的乙醇回流提取1.5h，提取2次，制得提取液后減壓濃縮至無醇味后，加水定容至生藥濃度0.250g·ml-1，于4℃冰箱保存備用。上柱前超聲處理10分鐘使其溶解。2.3指標成分的含量測定2.3.1總黃酮的含量測定2.3.1.1對照品溶液的制備精密稱取淫羊藿苷對照品適量，配制成淫羊藿苷濃度為0.238mg/ml的對照品儲備液。2.3.1.2標準曲線的繪制分別精密吸取0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml、2.0ml淫羊藿苷對照品儲備液(濃度0.238mg/ml)于10ml量瓶中，各加入1%AlCl3(甲醇)1.0ml，搖勻，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置15min，按照紫外-可見分光光度法，于414nm處測定吸光度。以對照品的濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(Y)，繪制標準曲線。回歸方程為：y=0.1508x，r=0.9999。結果表明：淫羊藿苷在0.00952mg/ml～0.0476mg/ml范圍內與吸光度呈良好的線性關系。2.3.1.3樣品的測定精密量取上柱藥液、以及吸附-解吸后藥液以甲醇定容，搖勻后測定。2.3.2總香豆素的含量測定2.3.2.1對照品溶液的制備精密稱取蛇床子素對照品適量，配制成蛇床子素濃度為0.109mg/ml的對照品儲備液。2.3.2.2標準曲線的繪制分別精密吸取0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml蛇床子素對照品儲備液(濃度0.109mg/ml)于10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置15min，于320nm處測定吸光度。以對照品的濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(Y)，繪制標準曲線。回歸方程為：y=0.1525x，r=0.9999。結果表明：蛇床子素在0.00218mg/ml～0.01308mg/ml范圍內與吸光度呈良好的線性關系。2.3.2.3樣品的測定精密量取上柱藥液、以及吸附-解吸后藥液以甲醇定容，搖勻后測定。2.3.3HPLC同時測定5種活性成分[23]2.3.3.15種活性成分的結構式本課題組在骨疏丹促成骨細胞增殖試驗中發現以下5種成分都具有較好的促成骨細胞增殖活性，其結構式如圖2-1所示，因此將以下5種成分的保留率作為驗證試驗的指標。把柚皮苷、朝藿定B、淫羊藿苷、蛇床子素、丹參酮ⅡA的結構式畫上。柚皮苷朝藿定B淫羊藿苷蛇床子素丹參酮ⅡA2.3.3.2色譜條件及系統適用性試驗色譜柱：Diamonsil(2)柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈(A)-1.5%冰醋酸水溶液(B)；梯度洗脫順序如下：Time(min)A(%)B(%)0 1882191940202872352872375070507030547030558020658020檢測波長：270nm 柱溫：25℃ 流速：1.0mL/min進樣量：20μl2.2.3.3混合對照品溶液的制備精密稱取柚皮苷、朝藿定B、淫羊藿苷、蛇床子素、丹參酮ⅡA對照品適量，加甲醇定容，配制成質量濃度分別為0.160、0.306、0.228、0.114、0.102mg/ml的混合對照品儲備液，將上述混合對照品儲備液制成一系列不同質量濃度的對照品溶液，以峰面積對質量濃度進行線性回歸，得各組分的線性范圍和回歸方程見表2-1所示。表2-1活性成分的線性范圍和回歸方程線性范圍回歸方程γ柚皮苷0.00320～0.0480Y=2×107X-204240.9994朝藿定B0.00612～0.00918Y=2×107X-397400.9994淫羊藿苷0.00468～0.0702Y=3×107X-350060.9994蛇床子素0.00456～0.0684Y=1×107X-143470.9992丹參酮ⅡA0.00204～0.0306Y=6×107X-261670.99952.2.3.4供試品溶液的制備精密量取上柱藥液、以及吸附-解吸后藥液以甲醇定容，搖勻后過0.45μm。2.3.3.5樣品的測定分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液20μl，注入液相色譜儀中，對照品溶液，上柱藥液色譜圖如圖2-2(a)，2-2(b)所示，測定5個色譜峰的峰面積，通過外標一點法計算含量。圖2-2(a):對照品色譜圖圖2-2(a):上柱藥液色譜圖2.4浸膏的測定精密吸取上柱藥液及吸附-洗脫后溶液適量至已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴揮干水分后，將其放入105℃烘箱中，3小時后取出放入干燥器冷卻0.5h，立即稱重。2.5大孔吸附樹脂的選擇2.5.1大孔樹脂的靜態吸附試驗： 取預處理好的4種型號D101(非極性)、AB-8(弱極性)、DM130(中極性)、DA201(極性)干樹脂各1g，精密稱定，分別置100ml具塞錐形瓶中，精密加入上柱藥液(0.250g/ml)25ml后放于振蕩器上，頻率100次·min-1，每隔20min振搖20s，間隔振搖4h，室溫靜置24h，使其達到飽和吸附，傾出吸附后的上清液，測定總黃酮、總香豆素的含量，計算樹脂的飽和吸附量。飽和吸附量(mg·g-1)干樹脂={上樣液中總黃酮(總香豆素)的含量(mg)-上清液中總黃酮(總香豆素)的含量(mg)}/樹脂質量(g)。2.5.2大孔樹脂的靜態解吸附試驗 將2.5.1中4種靜態飽和吸附后的樹脂過濾，吸干表面水分，精密加入25ml75%乙醇，頻率100次·min-1，每隔20min振搖20s，間隔振搖4h，室溫靜置24h，取解吸后溶液，測定總黃酮、總香豆素的含量，計算樹脂的解吸率。解吸率(%)=解吸溶液中總黃酮(總香豆素)的含量(mg)/{上樣液中總黃酮(總香豆素)的的含量(mg)-上清液中總黃酮(總香豆素)的的含量(mg)}2.5.3試驗結果4種大孔吸附樹脂的總黃酮、總香豆素的吸附與解吸試驗結果如下表2-1所示，從表中可以看出：D101大孔吸附樹脂對總黃酮、總香豆素的靜態飽和吸附量均優于其他3種樹脂，且解吸率也較高，因此綜合選擇D101大孔吸附樹脂作為以下純化工藝用樹脂。表2-2.4種大孔吸附樹脂對總黃酮、總香豆素的吸附與解吸試驗結果樹脂型號D101AB-8DM130DA201吸附量（mg/g)解吸率吸附量（mg/g)解吸率吸附量（mg/g)解吸率吸附量（mg/g)解吸率指標成分總黃酮66.079.6%47.567.8%39.074.3%36.682.1%總香豆素41.785.6%39.292.5%37.077.4%33.981.5%2.6D101型樹脂吸附工藝研究2.6.1吸附工藝正交設計精密量取經過預處理的D101大孔吸附樹脂50ml，選取上柱藥液體積、吸附速度、大孔樹脂的徑高比作為考察因素，每個因素各取3個水平進行L9(34)正交試驗，正交因素水平見表2-3。吸附完成后用7BV的蒸餾水洗脫，棄去水洗液，采用6BV90%的乙醇以5BV/h的速度洗脫，收集醇洗脫液，定容至500ml。測定醇洗脫液中總黃酮與總香豆素的含量，以及洗脫液的浸膏含量。計算總黃酮、總香豆素的保留率、浸膏率及純度(單位浸膏中有效成分的含量g·g-1)。保留率=洗脫液中總黃酮(總香豆素)的含量(mg)/上柱液中總黃酮(總香豆素)的含量(mg)×100%浸膏率=浸膏重量(g)/原藥材重量(g)×100%純度=單位浸膏中總黃酮(總香豆素)的含量(g/g)×100%表2-3吸附工藝正交設計因素水平表水平因素上樣體積（BV）流速（BV/h）徑高比誤差11.511:32221：532.531:72.6.2吸附工藝正交試驗結果吸附工藝正交試驗結果如表2-4所示。表2-4吸附工藝正交設計結果試驗總黃酮保留率（X）香豆素保留率(Y)總黃酮純度總香豆素純度浸膏率170.8%87.1%31.6%21.6%7.17%263.9%79.5%31.0%21.4%6.60%358.5%71.7%30.9%21.1%6.05%462.1%79.3%31.5%22.4%6.31%559.0%72.1%31.5%2.14%5.99%6762.6%77.8%33.2%22.9%6.04%57.5%71.4%32.8%22.7%5.61%863.1%78.6%32.7%22.6%6.18%958.6%72.0%33.8%23.1%5.55%2.6.3正交試驗結果分析以總黃酮純度與總香豆素純度權重系數各占50%評分時發現各因素均無顯著性影響，以總黃酮保留率、總香豆素保留率權重系數各50%綜合評分，直觀分析及方差分析結果如表2-5(a)，2-5(b)所示。表2-5(a)吸附工藝正交設計直觀分析結果上樣量吸附速度柱徑比誤差保留率評分111111002122290.73133382.54212389.45223183.16231288.97313281.68321389.79332182.7均值191.06790.33392.86788.600均值287.13387.83387.60087.067均值384.66784.70082.40087.200極差6.4005.63310.4671.533表2-5(b)吸附工藝正交設計方差分析結果因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性上樣量62.516214.44119.000吸附速度47.802211.04219.000柱徑比164.329237.96019.000*(<0.05)誤差4.332*注：綜合評分=X**50%/70.8%+Y**50%/87.1%從方差分析結果可知：柱徑比具有顯著性差異，因此柱徑比選擇最佳試驗條件1:3。上樣量與吸附速度均無顯著性差異，從提高效率和降低生產成本的角度選擇上樣量2.5BV，吸附速度2BV/h。2.6.4驗證試驗為考察最佳吸附條件的穩定性，按照最佳吸附條件進行驗證(n=3)，取預處理好的50ml樹脂，使其柱徑比為1:3，加入骨疏丹上柱藥液125ml(生藥濃度0.250g/ml)，以2BV·h-1的速率吸附，吸附完成后用7BV的蒸餾水洗脫，棄去水洗液，采用6BV90%的乙醇以5BV/h的速度洗脫，收集醇洗脫液，90%的乙醇定容至500ml。純化前后5種活性成分的色譜圖如圖所示,與圖2-2(a)比較發現主要色譜峰峰形未發生變化純化結果如下表所示，表明該工藝穩定可靠。2-3洗脫液色譜圖表2-6純化前后結果總黃酮保留率（X）香豆素保留率(Y)5個成分之和總黃酮純度（g/g）總香豆素純度（g/g）浸膏率純度之和平均值純度之和提高倍數上柱藥液100%100%100%13.1%7.21%24.2%20.31%1洗脫液163.6%79.3%95%32.5%22.3%6.20%54.6%（RSD=0.1%）2.69洗脫液263.9%79.5%93%32.2%22.1%6.29%洗脫液362.1%78.7%94%32.2%22.5%6.11%2.7D101型樹脂洗脫工藝研究2.7.1洗脫工藝正交設計精密量取經過預處理的D101大孔吸附樹脂50ml，選取水洗體積（BV）、洗脫乙醇濃度、乙醇洗脫體積(BV)作為考察因素，每個因素各取3個水平進行L9(34)正交試驗，正交因素水平見表2-6。吸附完成后用7BV的蒸餾水洗脫，棄去水洗液，采用6BV90%的乙醇以5BV/h的速度洗脫，收集醇洗脫液，以相應濃度乙醇定容至500ml。測定醇洗脫液中總黃酮與總香豆素的含量，以及洗脫液的浸膏含量。計算總黃酮、總香豆素的保留率、浸膏率及純度。表2-7洗脫工藝正交設計因素水平表水平因素水洗體積（BV）乙醇濃度乙醇洗脫體積（BV）誤差1570%42780%53990%62.7.2洗脫工藝正交試驗結果洗脫工藝正交試驗結果如表2-8所示。表2-8洗脫工藝正交試驗結果試驗總黃酮保留率（X）香豆素保留率(Y)總黃酮純度（X1）總香豆素（Y1）浸膏率162.2%83.1%33.5%24.9%5.94%262.5%83.9%30.8%23.0%6.49%358.4%64.9%36.5%22.6%5.11%458.9%79.2%35.2%26.3%5.35%557.1%72.3%30.5%21.5%5.99%655.6%70.1%36.1%25.4%4.92%757.4%71.7%34.5%24.0%5.32%861.8%79.2%32.1%22.9%6.16%955.4%67.1%36.2%24.4%4.89%2.7.3洗脫工藝正交試驗結果分析以總黃酮純度與總香豆素純度權重系數各占50%評分的直觀分析表及方差分析表如表2-9(a)、2-9(b)所示，以總黃酮回收率、及總香豆素回收率各50%綜合評分的直觀分析表和方差分析表如表2-10(a)、2-10(b)所示。2-9(a)洗脫工藝正交試驗結果方差分析(以純度評分)所在列1234因素水洗體積醇洗濃度醇洗體積純度評分實驗1111194.8實驗2122287.4實驗3133396實驗42123100實驗5223184.4實驗6231299.8實驗7313295實驗8321389.3實驗9332198.5均值192.73396.60094.63392.567均值294.73387.03395.30094.067均值394.26798.10091.80095.100極差2.00011.0673.5002.5332-9(b)洗脫工藝正交試驗結果方差分析(以純度評分)因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性水洗體積6.56920.67519.000醇洗濃度216.242222.21119.000*醇洗體積20.72222.12819.000誤差9.742*注：綜合評分=X*1*50%/0.365+Y*1*50%/0.263表2-10(a)洗脫工藝正交試驗結果直觀分析(以保留率評分)所在列1234因素水洗體積醇洗濃度醇洗體積保留率評分實驗1111199.3實驗21222100實驗3133385.4實驗4212394.3實驗5223188.8實驗6231286.2實驗7313288.7實驗8321396.6實驗9332184.3均值194.90094.10094.03390.800均值289.76795.13392.86791.633均值389.86785.30087.63392.100極差5.1339.8336.4001.3002-8(b)洗脫工藝正交試驗結果方差分析(以保留率評分)因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性水洗體積51.696219.86819.000*醇洗濃度175.202267.33419.000*醇洗體積69.709226.79119.000*誤差2.602*注：綜合評分=X**50%/62.5%+Y**50%/83.9%根據表2-9(b)可以發現：僅乙醇濃度對純度有顯著性影響，乙醇濃度越低，純度越高，即70%乙醇可使純度達到最高。根據表2-10(b)可以發現：3個因素對保留率均有顯著性影響，5BV水洗脫，90%乙醇6BV洗脫可使回收率達到最高。從節約成本的角度，同時兼顧回收率和浸膏，選擇最佳因素水平為7BV水洗脫，80%乙醇5BV洗脫.2.7.4驗證試驗為考察最佳解吸條件的穩定性，按照最佳解吸條件進行驗證(n=3)，50ml樹脂上樣125ml藥液(0.250g/ml)，柱徑比1:3，以2BV·h-1的速率吸附后，用7BV水洗脫，然后用80%醇洗脫5BV，洗脫速度5BV/h，純化后色譜圖如圖2-4所示,與2-2(b)比較發現主要色譜峰峰形未發生變化,純化結果如下表所示，表明該工藝穩定可靠。圖2-4洗脫液色譜圖表2-11純化前后結果總黃酮保留率（X）香豆素保留率(Y)5個成分之和總黃酮純度（g/g）總香豆素純度（g/g）浸膏率純度之和平均值純度之和提高倍數上柱藥液100%100%100%13.5%7.31%24.4%20.8%1洗脫液158.9%78.2%85%36.3%26.1%5.35%62.3%（RSD=0.2%）2.99洗脫液257.9%77.3%83%36.1%26.1%5.29%洗脫液359.1%79.7%86%36.0%26.3%5.41%2.8大孔吸附樹脂的重復使用次數為縮短生產周期提高生產效率，考察了大孔樹脂每次上樣洗脫后不經酸堿再生，只用水洗至無醇味簡單再生后反復上樣洗脫，測定了每次洗脫后總黃酮、總香豆素含量及浸膏率，通過計算保留率及純度發現，大孔樹脂重復使用15次后保留率及純度之和的RSD小于3%，因此暫定樹脂柱使用15次后用95%乙醇及氫氧化鈉再生。第三章討論3.1討論3.1.1正交試驗指標成分的確定現代中藥復方制劑骨疏丹成分復雜，根據課題組前期藥效學研究，將HPLC測定柚皮苷、朝藿定B、淫羊藿苷、蛇床子素、丹參酮ⅡA的五個活性成分含量之和、浸膏率以及總黃酮、總香豆素含量作為提取的考察指標，本試驗單因素考察時發現黃酮類成分柚皮苷、朝藿定B、淫羊藿苷的含量與總黃酮含量具有相關性，蛇床子素、丹參酮ⅡA含量與總香豆素具有相關性(丹參酮ⅡA極性與蛇床子素極性相近)，但以5個成分之和作為考察指標時，各因素的水平均無顯著性差異，因淫羊藿苷的保留率超過100%，可能有其他成分向其轉化，這與多篇文獻報道相一致(寫上參考文獻)，而丹參酮ⅡA含量又比較低，所以導致5個成分之和變化不大。因此本試驗將總黃酮、總香豆素含量作為正交試驗的考察指標，并通過HPLC同時測定了最佳工藝洗脫下來的上述5種成分，計算保留率驗證了最佳工藝的可信性。3.1.2上樣溶液溫度因樹脂吸附過程是一個放熱過程，因此溫度不宜過高，但本方劑中柚皮苷等物質在冷水中溶解度減小，因此未對溫度進行考察，直接定為室溫上樣。3.1.3上樣濃度的選擇上樣藥液稀則藥液的黏度較小，在一定上樣流速下溶液通過柱床流速較快，當流速大于傳質速度時，因傳質未進行徹底可能會造成泄漏；若