Next-generationsequencingtechnologyoverview當前1頁，總共59頁。Agenda

測序技術簡史第一代測序技術第二代測序技術第三代測序技術當前2頁，總共59頁。1測序技術簡史

1950196019701980199020002010DevelopmentofSangerSequencing(1977)InventionofAutomatedFluorescentSequencer(1985)InventionofCapillarySequencer(1996)InventionofAppliedBiosystemsSolidSystem(2007)InventionofIlluminaGenomeAnalyzerSystem(2006)Inventionof454GS20Sequencer(2005)chemicaldegradationmethodbyMaxam-Gilbertmethod(1977)ChemicaldegradationmethodbyWhitfield(1954)InventionofHeliscopesinglemolecularsequencerInventionofSinglemoleculerealtime(SMRT)DNAsequencingInventionofNanoporesinglemolecularsequencing(OxfordNanoporecorporation)InventionofpersonalgenomemachineInventionofopticalmapping

system當前3頁，總共59頁。

1977年，英國人FredSanger發現，如果在DNA復制過程中摻入ddNTP，就會產生一系列末端終止的DNA鏈，并能通過電泳按長度分辨。不同末端終止DNA鏈的長度是由摻入到新合成鏈上隨機位置的ddNTP決定的。由此誕生了以Sanger命名的測序原理即雙脫氧鏈終止法測序原理。當前4頁，總共59頁。5′磷酸3′羥基3′,5′-磷酸二酯鍵核苷酸形成3,5-磷酸二酯鍵示意圖核酸序列形成的基礎當前5頁，總共59頁?！半p脫氧末端終止”的含義當前6頁，總共59頁。TemplatePrimerdNTPPolymeraseTerminatorCGTA終止物標記方法因為顏色不同，4種終止物可以在一起進行反應。當前7頁，總共59頁。當前8頁，總共59頁。當前9頁，總共59頁。3730xlSequenceMap當前10頁，總共59頁。200520062007BirthdayPrinciplePyrosequencingSequencing-by-SynthesisSequencing-by-LigationRoche454GenomeAnalyzer/Hiseq2000ABISOLiDNext-generationsequencing/Deepsequencingtechnologymainplatforms當前11頁，總共59頁。454測序原理測序反應以磁珠上大量擴增的ssDNA為模板，在每一輪測序反應中，依照T、A、C、G的順序依次循環進入，每次只進入一個堿基。

如果這種dNTP能與待測序列配對，則會在合成后釋放焦磷酸基團。釋放的焦磷酸基團會與反應體系中的ATP硫酸化酶反應形成ATP。生成的ATP和熒光素酶共同氧化反應體系中的熒光素分子并發出熒光。通過檢測熒光信號釋放的有無和強度，確定被測分子的序列。光信號由CCD攝像機檢測并反應為峰。每個峰的高度（光信號）與反應中摻入的核苷酸數目成正比。反應結束后，ATP和未摻入的dNTP由雙磷酸酶降解，淬滅光信號，并再生反應體系。當前12頁，總共59頁。454測序流程當前13頁，總共59頁。待測DNA文庫的構建將基因組DNA/cDNA片段打斷至400-800bp，將用于后繼的擴增測序的接頭A和一段含有生物素的接頭B連接到DNA片段上，會產生含有接頭AA、AB、BB、BA四種DNA片段，然后與可結合生物素的磁珠結合，其中片段AA被洗脫掉，片段AB\BA\BB結合到磁珠上，通過變性處理回收含有接頭A和接頭B的單鏈DNA。當前14頁，總共59頁。Emulsion

PCR將這些ssDNA分別單獨與水油包被的直徑大約28μm的磁珠在一起孵育、退火，由于磁珠表面含有與接頭互補的寡聚核苷酸序列，因此ssDNA會特異地連接到磁珠上。同時孵育體系中含有PCR反應試劑，因此可以保證每一個與磁珠結合的小片段都會在各自的孵育體系內獨立擴增,擴增產物仍可以結合到磁珠上。反應完成后，破壞孵育體系并富集帶有DNA的磁珠。經過擴增反應，每一個小片段都將被擴增大約100萬倍，從而達到下一步測序反應所需的模板量。當前15頁，總共59頁。測序將攜帶DNA的磁珠與其他反應物混合物，放入PTP板中進行測序。PTP板上含有很多直徑約為44μm的小孔，每個小孔僅能容納一個磁珠，通過這種方法固定每個磁珠的位置以監測接下的測序反應。當前16頁，總共59頁。454的特點較高的測序通量，每個循環能產生總量為400-600Mb的序列。提高測序讀長，長度達到400bp，使得后繼的序列拼接工作更加高效、準確。主要缺點是無法準確測量同聚物的長度。例如當待測序列中出現Poly(A)的情況下，測序反應中會一次加上多個T，而加入T的數目只能從熒光信號的強度來推測，有可能造成結果不準確。因此454技術主要的錯誤不是來自核苷酸的替換，而是來自插入或缺失。當前17頁，總共59頁。200520062007BirthdayPrinciplePyrosequencingSequencing-by-SynthesisSequencing-by-LigationRoche454GenomeAnalyzer/Hiseq2000ABISOLiDNext-generationsequencing/Deepsequencingtechnologymainplatforms當前18頁，總共59頁。當前19頁，總共59頁。n=degeneratebasesz=universalbases當前20頁，總共59頁。當前21頁，總共59頁。當前22頁，總共59頁。當前23頁，總共59頁。當前24頁，總共59頁。當前25頁，總共59頁。當前26頁，總共59頁。當前27頁，總共59頁。當前28頁，總共59頁。當前29頁，總共59頁。SOLiD的特點通量大成本低序列短Ligase的方式雖然能一定程度避免phasing/pre-phasing，但增加的復雜度也降低了效率靈活性差，對小數據量測序不適用Two-basecoding當前30頁，總共59頁。200520062007BirthdayPrinciplePyrosequencingSequencing-by-SynthesisSequencing-by-LigationRoche454GenomeAnalyzer/Hiseq2000ABISOLiDNext-generationsequencing/Deepsequencingtechnologymainplatforms當前31頁，總共59頁。2Hiseq2000（Solexa）測序原理

Solexa是一種基于邊合成邊測序技術(Sequencing-By-Synthesis，SBS)的新型測序方法。通過利用單分子陣列實現在小型芯片(FlowCell)上進行橋式PCR反應。由于新的可逆阻斷技術可以實現每次只合成一個堿基，并標記熒光基團，再利用相應的激光激發熒光基團，捕獲激發光，從而讀取堿基信息。當前32頁，總共59頁。

可逆阻斷技術當前33頁，總共59頁。CTAGCTA5’-3’-…-5’GT

合成第一個堿基Cycle1:按順序加入反應試劑

清除未反應的堿基和試劑

激發堿基熒光并收集熒光信號

去除阻斷基團和熒光基團Cycle2-n: 重復前面的步驟GTCTAGTCTGCTAGA基于SBS的Solexa測序技術當前34頁，總共59頁。3Hiseq2000測序技術流程制備芯片模板雜交橋式PCR擴增測序引物準備測序2測序測序

生成basecalls3數據分析拍照圖片IntensitiesReadsAlignments4DNA打斷末端修復加A加接頭純化文庫制備1當前35頁，總共59頁。3.1文庫制備

Solexa有三種不同的測序種類：Single-ReadSequencing

單向測序Paired-EndSequencing

雙向測序IndexedSequencing

混合樣品測序這三種測序類型的文庫構建大體一致，主要區別在于接頭。當前36頁，總共59頁。Single-ReadSequencingFragmentDNA5’3’5’+3’5’5’+5’3’3’5’1.Endrepair

T4polymerase,DNAPol1(Klenowfragment)3’5’po4po45’3’PhosphorylationT4polynucleaotidekinase,ATP3.Ligationofadaptors3’Apo45’A3’5’po42.Add3’AdenosinewithKlenow(3’exo-)anddATP+DNAinsert5’5’3’3’SBSoligoP7反向互補序列3’T5’po43’5’SBSoligoP7反向互補序列當前37頁，總共59頁。PCRenrichment5’5’3’3’5’5’5’5’3’3’3’3’1stroundPCRP7P5SBSoligoP7反向互補序列P73’當前38頁，總共59頁。PCRenrichment(cont.)5’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’2ndroundPCRInsertP7P5SBSoligoP7反向互補序列P5ClustertemplateSBSoligoP7當前39頁，總共59頁。Paired-EndSequencing

雙向測序IndexedSequencing

混合樣品測序當前40頁，總共59頁。當前41頁，總共59頁。3.2芯片制備和測序Cluster生成步驟:固定擴增線性化

阻斷引物雜交Cluster生成化學步驟cBOT當前42頁，總共59頁。FlowCell想像圖進樣孔出樣孔當前43頁，總共59頁。Single-ReadSequencing(SR,單向測序)OHFlowCell接頭diol

P7

P5

dioldiol模板雜交dioldiol

延長dioldiol

變性堿基片段雜交固定當前44頁，總共59頁。

dioldiol1stcycle

變性1stcycle

退火dioldiol1stcycle

延長dioldioldioldiol2ndcycle

變性2ndcycle

退火dioldioldioldioldioldiol2ndcycle

延長n=35總數堿基片段擴增成簇當前45頁，總共59頁。線性化OH用ddNTP()阻斷Cluster擴增完成OHdioldiolOHClusterStation結束Primer加測序引物OHNaIO4當前46頁，總共59頁。每一個基因簇就是信號收集照片上一個亮點當前47頁，總共59頁。YX通過熒光信號讀取序列信息當前48頁，總共59頁。123789456TTTTTTT

G

T…T

G

C

T

A

C

G

A

T…通過熒光信號讀取序列信息當前49頁，總共59頁。3.3測序Paired-EndSequencing(PE,雙向測序)和IndexedSequencingSR與PE的FlowCell接頭對比SingleReadPairedEnd當前50頁，總共59頁。TemplateHybridization模板雜交UUOHOHGraftedflowcell芯片上的接頭U

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P5

DNA片段雜交和固定Initialextension第一鏈的延長UUDenaturation變性UU當前51頁，總共59頁。 1stcycledenaturation變性n=25total堿基片段擴增成簇UU1stcycleannealing退火UU1stcycleextension延長UU2ndcycledenaturation再變性UU2ndcycleannealing退火UUU2ndcycle