關于植物原生質體培養第1頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四第一節原生質體的用途

植物原生質體(protoplast)是沒有細胞壁的裸露細胞，它在一些研究方面具有獨特的優勢。第2頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四1.原生質體是研究細胞骨架、細胞壁的形成、細胞膜的結構、大分子物質進出細胞過程與機理等問題的良好實驗體系。2.轉基因的良好受體：與外源DNA（如質粒）共培養時，原生質體可以直接吸收外源DNA，并整合到染色體上，從而實現對植物細胞的遺傳轉化，進一步通過植株再生就可得到轉基因植物。第3頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四GFP質粒濃度對煙草原生質體轉基因效率的影響GFP=綠色熒光蛋白第4頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四PEG介導的甜橙原生質體轉GFPPCR分析Sothern雜交分析第5頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四3.體細胞雜交（somatichybridization）：由于原生質體沒有細胞壁，所以不同的原生質體可以相互靠近，發生融合。2種不同植物體細胞發生融合的過程，稱為體細胞雜交。所得到的融合細胞為雜種細胞，再通過植株再生就可能創造出新的植物個體。第6頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四Tomato-potatohybrid第7頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四第二節原生質體的分離

要進行原生質體培養和操作，就必需有大量高質量的原生質體。分離原生質體主要采用酶解法。酶解法：利用酶降解植物細胞壁而獲得原生質體。酶解法分離原生質體的效率高，用少量的材料就可以得到大量完整的原生質體，已成為分離原生質體的最主要方法。第8頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四第9頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四一、

材料的選擇

用于分離原生質體的植物材料應是細胞分裂旺盛的材料，如幼嫩小苗的根、胚軸、子葉、幼葉等；處于快速生長期的愈傷組織或懸浮細胞。對于容易培養、再生能力強的葉植物（如煙草、菊花、胡蘿卜、矮牽牛等）也可用完全展開的葉片作材料。第10頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四二、酶解處理

1.酶解液準備：由于植物細胞壁的主要成分是纖維素、半纖維素和果膠質組成的，所以酶解液中一般應含有纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶，濃度為0.5-2.0%。在配酶解液時可以用原生質體培養基作溶解劑，也可用專門的溶液（CPW溶液）作溶解劑。第11頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四CPW=Cell-ProtoplastWashMedium

KH2PO427.2mg/LKNO3101.0mg/LCaCl2·2H2O148.0mg/LMgSO4·7H2O246.0mg/LKI0.16mg/LCuSO4·5H2O0.025mg/L第12頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四

為了保持釋放出來的原生質體的活力和膜穩定性，必須使原生質體處于一個等滲環境中。因此，酶解液中必須加入滲透壓調節劑。

常用的滲透壓調節劑有葡萄糖、甘露醇和山梨醇等，濃度一般為0.35-0.8mol/L。具體用什么濃度，可根據材料的水勢來確定。酶解液配制好后，要用過濾滅菌的方法進行滅菌，并且隨配隨用。第13頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四2.酶解：將植物材料放入酶解液中、釋放出原生質體的過程。葉片、幼莖和根等材料要切成小片；葉片最好撕去下表皮。懸浮細胞要離心后再酶解。材料與酶解液的比例：2-10g/100ml酶解液。一般在25±2℃、黑暗中酶解，期間輕輕搖動幾次，或放在50rpm的搖床上。酶解時間因材料而異，2小時~十幾小時。

第14頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四苜蓿葉片的酶解法分離原生質體第15頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四三、原生質體的收集與純化過濾：酶解結束后，將酶解物通過孔徑為20-80μm的不銹鋼篩網過濾，除去未被酶解的組織塊和細胞團。離心：濾液轉到離心管中在50×g下離心5min。反復洗滌：離心結束后，棄去上清液，用培養基和原生質體洗液重新懸浮沉淀的原生質體，再離心。如此反復2-4次，就可以將殘留的酶液去掉。純化：用含高濃度（21%）蔗糖的培養基進行離心、純化，完整的原生質體漂浮在上清液的上部。第16頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四苜蓿葉片原生質體的純化完整的原生質體第17頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四5.收集原生質體：第18頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四完整的原生質體第19頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四四、原生質體活力的測定

原生質體活力的高低對后來的原生質體培養和融合影響極大。原生質體分離過程中的任何一個步驟都會影響到原生質體的活力，因此，必須十分小心。測定原生質體活力的方法常用熒光素雙醋酸酯（FDA）染色法。原生質體活力（%）=發熒光的原生質體數/原生質體總數×100第20頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四FDAFDA熒光素酶水解紫外光熒光素完整、有活力的原生質體細胞核熒光素雙醋酸酯第21頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四第三節原生質體培養原生質體制備好后，用培養基將原生質體調至一定的密度（最低起始細胞密度以上），及時地進行培養。第22頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四

在適宜的培養條件下，原生質體數小時后開始形成新的細胞壁，在顯微鏡下可見原生質體由圓球形逐漸變為方形、多邊形等。約24-36h后，原生質體開始發生第一次分裂；以后隨著細胞分裂，原生質體就形成細胞團，進一步誘導出植株。第23頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四苜蓿原生質體分裂第24頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四6weeks8weeks苜蓿原生質體形成細胞團第25頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四苜蓿原生質體再生植株第26頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四轉GFP基因的苜蓿原生質體再生植株第27頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四夜來香原生質體植株再生1天5天7天10天第28頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四4周5周7周第29頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四單倍體煙草原生質體培養與植株再生第30頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四楊樹原生質體培養植株再生7000,000cells/gfreshleaves25000cells/ml;NH4NO3-freeMS+5M2,4-D+0.05TDZM.PE:34.7%atday14第31頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四楊樹原生質體培養植株再生LiquidMS+5M2,4-D;MS+10MKTor1MTDZ.第32頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四楊樹原生質體培養植株再生1/2MS第33頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四

將含原生質體的培養液倒入培養皿底部，使其成一薄層，封口后進行培養。1.

液體淺層培養原生質體的培養方法含原生質體的液體培養基第34頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四特點：操作簡單，對原生質體的損傷小；容易添加新鮮培養基和轉移培養物；原生質體分布不均勻，易發生原生質體之間粘連；原生質體的位置不能固定，所以不能跟蹤觀察單個原生質體的生長過程。第35頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四2.固體培養（平板培養）35℃左右的瓊脂或瓊脂糖培養基與原生質體溶液混合，搖勻，倒入培養皿中，瓊脂或瓊脂糖凝固后，就成一薄層。進行平板培養時，要注意混合時培養基的溫度。溫度高對原生質體的傷害大；溫度低，培養基凝固，原生質體與培養基不能混勻。特點：原生質體被固定，易觀察、統計原生質體的分裂情況；添加新鮮培養基和轉移培養物比較麻煩。含原生質體的固體培養基第36頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四（1）液體淺層—固體平板培養雙層培養法：培養皿底部鋪一層瓊脂或瓊脂糖培養基，再將原生質體懸浮液倒入或滴入固體培養基表面。優點是固體培養基中的營養可以緩慢釋放倒液體培養基中。如果在固體培養基中加入活性炭，還可以吸附培養物分泌的有毒物質，促進原生質體的生長和分裂。3.液體—固體結合培養固體培養基含原生質體的液體培養基第37頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四

（2）瓊脂糖珠培養：用移液管吸取含原生質體的瓊脂糖培養基，滴在培養皿或三角瓶中，待其凝固后，再加入適量的液體培養基，進行旋轉培養。也可以等含原生質體的瓊脂糖培養基凝固后，用刀將其切成小塊，再放入液體培養基中培養。改進了培養物的通氣和營養環境，從而促進可以促進原生質體的分裂及細胞團的形成。含原生質體的瓊脂糖珠液體培養基第38頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四

在培養過程中，原生質體分裂開始以后，培養基中的甘露醇或山梨醇的濃度要逐漸降低，否則會影響細胞的繼續生長、分裂。待原生質體形成的細胞團（愈傷組織）達到1mm時，應將細胞團轉移到新鮮的培養基上繼續培養。所形成的愈傷組織就可以按照普通的愈傷組織進行培養和植株再生。

第39頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四第40頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四三、影響原生質體培養效果的因素

原生質體培養效果的好壞，也可以用植板率來衡量。1.植物材料：用于分離原生質體的植物材料對原生質體后來培養的效果影響極大。不同的植物、同一植物不同的品種，其遺傳組成存在差異，原生質體的培養效果也就必然有差異。如Yamada曾用26個水稻品種的種子誘導出愈傷組織，再建立懸浮細胞培養，以懸浮細胞分離原生質體，結果只有1個品種的原生質體再生了植株。一般來說，容易培養的植物、外植體，其原生質體也容易培養，反之，亦然。草本比木本容易，幼嫩的材料比成熟的材料容易。

第41頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四2.

培養基（1）基本培養基：不同植物原生質體要求有不同的基本培養基。使用什么基本培養基，可以參照相應培養愈傷組織或細胞的培養基。一般認為，原生質體培養基種的大量元素應比愈傷組織培養基中的大量元素濃度低。由于Ca2+影響到膜的穩定性，因此較高Ca2+濃度的對原生質體分裂有利。第42頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四（2）有機成分：同培養細胞、愈傷組織相比，培養原生質體時要求培養基有更豐富的有機成分，如氨基酸、維生素、CW，YE，LH，CH、小牛血清等。大量的結果表明，培養基中添加谷氨酰胺有利于原生質體的分裂。（3）激素：培養基中要加入一定濃度的細胞分裂素和生長素。由于2,4-D促進細胞分裂能力很強，所以培養基中大都要加2,4-D。（4）條件化培養基：使用條件化培養基可以大大促進原生質體的分裂和細胞團的形成。

第43頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四（5）培養基中的滲透壓：原生質體無細胞壁，所以培養基中必須使用滲透壓調節劑（甘露醇、山梨醇等），以維持原生質體的穩定。但滲透壓調節劑濃度較高往往會抑制細胞分裂和后來的細胞生長。因此，培養基中滲透壓調節劑的濃度不能太高，并且在后來的培養過程中要逐漸降低甘露醇或山梨醇的濃度，以利于細胞的持續分裂和生長。

第44頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四第三節

體細胞雜交(somatichybridization)由于沒有細胞壁的限制，原生質體可以彼此靠近，通過膜的融合而融為一體。如果兩個相同的原生質體發生融合，則可以實現染色體加倍。Protoplastfusion第45頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四期盼的馬鈴薯與番茄雜種植株

如果兩個不同植物的原生質體融合，則就可以形成一個新的雜種細胞，此雜種細胞通過植株再生，則可以得到雜種植株。兩個不同植物體細胞發生融合的過程，稱為體細胞雜交。第46頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四

體細胞雜交克服了有性雜交時生殖隔離的限制，為創造種間雜種、屬間雜種，甚至科間雜種創造了條件。體細胞雜交包括4個過程：

原生質體的分離；

原生質體的融合；雜種細胞的選擇和植株再生；雜種植株的鑒定。

第47頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四一、原生質體的分離二、原生質體的融合原生質體融合的過程完全是一個機械過程，所有植物的原生質體都可以發生融合。有些植物的原生質體可以自發融合，但大多數植物的原生質體需要在誘導劑的誘導下才能發生。誘導原生質體的方法有化學法和物理法2種。第48頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四（一）化學誘導法化學誘導法是利用一些化學物質，如NaNO3、聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG）、高鈣高pH等。原理：消除原生質體表面的電荷，促進原生質體彼此靠近、接觸，并能促進接觸處的細胞膜發生融解，從而實現原生質體融合的。最常用的是聚乙二醇法和高鈣高pH法。

第49頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四(1)

聚乙二醇法（PEG）聚乙二醇（PEG）是高分子的有機化合物。用于誘導原生質體融合PEG的分子量為6000。PEG誘導融合劑一般用0.01mol·L-1CaCl2·2H2O溶液配制，PEG濃度為30%-50%，蔗糖濃度為4%，可以用高溫高壓法滅菌，可以在4℃下保存。第50頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四(２)高鈣高pH法高鈣高pH法的誘導劑為：

0.05M甘氨酸-NaOH緩沖液

1.1%CaCl2·6H2O9%甘露醇

pH10.4（過濾消毒，隨用隨配）

第51頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四主要步驟：（1）在離心管中分別將2種植物的原生質體密度調至5-8×105

個/ml，然后等體積混合。（2）向原生質體混合液中加入等體積的誘導融合劑，輕輕搖勻后，放置10min。高鈣高pH法誘導融合時要保溫（30-37℃）。（3）離心（100×g，10min），棄去上清液，用培養基懸浮原生質體。（４）重復（３）２－４次，最后用培養基調至適當的密度。（５）培養（液體淺層培養、平板培養等）第52頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四對稱體細胞雜交:2個原生質體的細胞質和細胞核完全融合形成一個雜種細胞。不對稱雜交：一個原生質體的細胞質完全丟失，另外一個原生質體的細胞核完全丟失，再融合形成一個雜種細胞。

用X射線、γ射線、碘乙酸、碘乙酰胺處理一個原生質體，使其核失活；用羅丹明（R-6-G，一種親脂染料，能夠抑制線粒體的氧化磷酸化過程）使另外一個原生質體的細胞質失活。第53頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四原生質體A原生質體B混合誘導劑混合，10min反復洗滌調節密度，培養，植株再生雜種植株選擇與鑒定射線、化學物質處理射線、化學物質處理第54頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四

化學誘導原生質體融合方法試劑便宜，成本低。但操作煩瑣，而且化學物質的處理往往會影響原生質體的活力，特別是不純凈的PEG。對原生質體活力的影響與化學物質濃度、時間有關。第55頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四（二）物理方法（電融合，electrofusion）電融合誘導原生質體融合是在電融合儀上進行的。通過高頻（500KHz-2MHz）電場脈沖處理原生質體，可以使接觸處的原生質體發生膜穿孔，最終導致原生質體融合。這種方法操作比較簡單，無復雜的原生質體洗滌過程，對原生質體的副作用比較小。但電融合儀非常昂貴。

第56頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四電融合儀下的薄荷原生質體第57頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四Exampleofprotoplastfusion-left:applicationofACfield,right:applicationofDCpulse第58頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四

原生質體融合是隨機過程。在大群體誘導融合時，A、B兩種原生質體可以發生多種融合，如A-A，B-B，A-B。其中只有A-B是所希望的。挑選雜種細胞是比較困難的，主要方法有：

三、雜種細胞的鑒定第59頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四1.

表觀差異：根據2種植物顯著的表觀差異，找出中間類型的細胞團。如正常綠色葉和白化葉的原生質體融合后，其細胞的綠色程度就會介于2者之間。2.

選擇標記：抗性（抗生素、除草劑）標記、營養互補標記、顏色等。第60頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四PEG法誘導紅白菜與榨菜原生質體融合與植株再生第61頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四融合過程第62頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四雜種體細胞,中間顏色(黃綠色與紅色)第63頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四雜種體細胞分裂、形成愈傷組織分化芽第64頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四四、再生植株的鑒定原生質體融合后的雜種細胞以后生長情況：1、2個細胞的細胞質和細胞核，保持完整、不丟失,同步分裂。對稱體細胞雜交（完全融合）2、一個細胞的細胞質和核完全丟失，變為普通細胞3、一個細胞質完全丟失，另外一個細胞核完全丟失，質-核雜種細胞。不對稱雜交4、一個或者兩個細胞的細胞質和染色體不同程度丟失，質-核雜種細胞（常常其中1個細胞的絕大部分染色體丟失，部分基因整合到另外一個細胞的基因組中）。不對稱雜交。第65頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四體細胞雜種再生植株的鑒定：1.形態觀測：2.

細胞學分析：3.分子鑒定：4.同功酶鑒定第66頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四再生植株的形態比較

紅白菜雜種植株榨菜第67頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四擬南芥與油菜原生質體融合再生植株葉片形態擬南芥油菜雜種第68頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四薄荷原生質體融合再生植株葉片比較第69頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四擬南芥蘿卜雜種擬南芥和蘿卜原生質體融合再生植株比較形態比較第70頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四擬南芥蘿卜DNA差異第71頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四葉綠體基因trnL/TrnF線粒體基因orf138線粒體基因orfB蘿卜蘿卜蘿卜擬南芥DNA差異第72頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四玉米-小麥原生質體融合再生植株玉米小麥原生質體融合第73頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四玉米-小麥原生質體融合再生植株第74頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四玉米-小麥原生質體融合再生植株的染色體分析第75頁，共89頁，2023年，2月20日，星期四分子方法(RAPD)鑒定小米-玉米雜種M=玉米W=小麥第76頁，共89