關于昆蟲病原細菌的利用第1頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四

自然界中，細菌種類繁多，數量大，分布廣泛，其中能使昆蟲感染致病的蟲生細菌相當多，昆蟲因細菌而引起的疾病稱為細菌病。細菌病有多種，但細菌病有其共同的特征，即當昆蟲感病后，不大活動，食欲減退，口腔及肛門常有排泄物，病原菌侵入體腔后引起敗血癥。死后蟲體色加深，一般都有一股臭味。由于體都軟化腐爛，所以通稱為軟化病。第2頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四一、昆蟲病原細菌的主要類群

Bucher（1960）分為專性病原細菌、產生晶體的芽孢桿菌、兼性病原細菌和潛勢病原細菌。通常分為3類：專性兼性潛勢病原細菌

第3頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四（一）專性昆蟲病原細菌（Obligateentomopathogenicbacteria）

只能在寄主細胞中生長繁殖，不能在人工培養基上正常生長，一般經口服傳染。自然界中寄主范圍較窄。日本金龜子芽孢桿菌（Bacilluspopilliae）天幕毛蟲芽孢桿菌（Clostridiummalacosomae）第4頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四Bacilluspopilliae第5頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四（二）兼性病原細菌（Facultativeentomopathogenicbacteria）

可在昆蟲體以外的生境中增殖，也能在人工培養基上正常生長發育的細菌。包括產孢和不產孢的桿菌。寄主范圍較廣。蘇云金桿菌Bt粘質沙雷氏菌等

第6頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四（三）潛勢病原菌（Potentialentomopathogenicbacteria）

普遍存在于昆蟲的消化道中，主要是一些不產生芽孢的桿菌。由于毒素和酶的產生數量少，難以侵入體腔內給宿主造成危害。

第7頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四（四）細菌殺蟲劑的特點●（1）毒力高。菌劑毒力足以壓倒害蟲的抗病力，能夠穩定可靠地使害蟲發病致死；●（2）穩定性。菌劑不致因受自然環境影響（如日光、干燥等）、人工處理、懸浮劑、載體、貯藏、不同施藥方式等而減低殺蟲效力；第8頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四●（3）殘效期長，并有在害蟲種群中自然傳播的能力；●（4）作用迅速；●（5）有選擇性。即對防治對象劇毒，而對植物、益蟲以及哺乳動物等無毒；●（6）可以大規模生產，經濟安全。第9頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四二、金龜子乳狀病芽孢桿菌

Dutky（1940）報道日本金龜子芽孢桿菌（B.popilliae）能引起日本金龜子等幼蟲的乳狀病（Milkydisease）。其后世界各國從不同金龜子幼蟲分離出乳狀病原細菌多種。

用金龜子芽孢桿菌防治日本金龜子是生物防治最典型的例子之一。第一個日本金龜子芽孢桿菌制劑于1950年在美國登記，成為美國政府批準的第一個生物防治制劑。第10頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四Grubinfectedwithmilkydisease(left)causedbyabacteriumcallBacilluspopilliae第11頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四第12頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四1、侵染過程金龜子芽孢桿菌主要通過芽孢感染和傳播，芽孢經口攝入。當幼蟲吞食芽孢后，芽孢在腸道中萌發成桿狀的營養細胞，營養細胞侵染中腸細胞，隨后穿過腸壁進入體腔，大量繁殖，形成芽孢，使幼蟲的血淋巴呈乳狀，死亡幼蟲呈乳白色，故稱為乳狀病（Milkydisease）。第13頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四2、致病機制尚不清楚，主要有兩種觀點

●由于細菌在生長過程中利用了昆蟲的大量營養物質和多種生長素，致使昆蟲不能正常發育。●破壞了昆蟲的某種酶系統，從而抑制了寄主昆蟲的生活機能。第14頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四3、培養繁殖

金龜子芽孢桿菌的芽孢能在寄主體外存活，營養體也能在人工培養基上生長繁殖，但卻不能在人工培養基上正常地形成芽孢。因此，商品制劑Doom、Japidemic和MilkySpore都是采用幼蟲活體培養的方法制備的。

3齡幼蟲

飼育缸微量注射，3ml/頭100萬芽孢/ml研碎，稀釋，晾干、包裝

1-3周1億芽孢/g菌劑第15頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四4、應用研究由于芽孢在土壤中能長期存活，感病死亡后的蠐螬又會不斷增加土壤中的芽孢數量，因此疾病一旦形成，芽孢便能在土壤中逐漸累積和傳播，從而達到長期控制的效果。利用金龜子芽孢桿菌防治蠐螬是一種有效的生物防治法。美國在13個州和哥倫比亞地區利用金龜子芽孢桿菌防治蠐螬面積達10余萬英畝，防治效果為60—80％。第16頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四5、注意事項土壤中含菌量與乳狀病感病率成正相關。如每千克土壤含芽孢4×109個，乳狀病發病率為82％,每千克土壤含0.25×109個芽孢時，則發病率僅為44％。溫度條件。乳狀病發病適溫為28-30℃，如溫度低于16℃，幾乎不發病。第17頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四三、球性芽孢桿菌

球形芽孢桿菌(Bacillussphaericus)在自然界分布廣泛，大多數菌株對昆蟲沒有毒性，但有一些對蚊幼蟲有高毒力，它的毒效成分在細胞內，不分泌到細胞外的培養液中。因此，只有昆蟲吞食細胞后才顯示毒性。第18頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四1、球形芽孢桿菌的毒素（1）二元毒素（BinaryToxin,Btx）分子量為42kDa和51kDa的蛋白質，只有當兩種蛋白質在一起時才產生毒性，兩種蛋白等量時達到最大殺蚊毒效。它的伴孢晶體被部分地包在芽孢外壁之中，使得芽孢和伴孢晶體在離體的條件下仍是一個整體。目前已對多個菌株的二元毒蛋白基因進行了測序。第19頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四（2）蛋白毒素（Mtx）在營養生長期產生的蛋白質，同芽孢的合成無關。Mtx毒素不穩定，熱處理、反復凍熔都會嚴重影響其殺蚊活性。這種蛋白的基因已被克隆和作序列分析。第20頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四2、球形芽孢桿菌的殺蟲范圍球形芽孢桿菌的殺蟲范圍僅限于蚊蟲的幼蟲，它通過取食過程進行感染，蚊子的幼蟲在取食8-12h后，即可發生死亡，幼蟲吞入球狀芽孢桿菌后，菌體在腸道中被消化，細胞壁破裂，菌體內的毒素釋放出來，從而殺死蚊蟲的幼蟲。第21頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四3、球形芽孢桿菌的利用

球形芽孢桿菌在昆蟲死后，可以在蟲尸中重新增殖，芽孢的數目增加。球形芽孢桿菌的芽孢和伴孢晶體在環境中持效期較長，并有可能在環境中再循環。因此，從20世紀80年代中后期開始，球形芽孢桿菌高毒菌株的篩選工作開始受到重視。迄今為止，美國、法國及我國等10個國家研制了不同劑型的產品10余種，主要用于殺蚊幼蟲的效果評價。第22頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四目前使用最多的球形芽孢桿菌制劑主要是乳劑和粉劑。第23頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四四、蘇云金桿菌

蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis，Bt）最早發現于1902年，1938年世界上第一個Bt制劑Sporeine在法國問世，從而掀開了蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑生產的序幕。近10年來，Bt已成為加拿大控制樅色卷蛾（Sprucebudworm）的主要手段。在其它國家，Bt運用于控制毛蟲、吉卜賽毒蛾（gypsymoths）等。目前全世界約有Bt殺蟲劑100多個品種，年銷售額近1億美元。第24頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四ThisleafrollercaterpillardiedafteringestingBacillusthuringiensis.Discolourationofthegut,asseenhere,istypicalofmortalityfromBacillusthuringiensis第25頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四（一）基本特征1、形態特征（1）營養期

G+的好氣性芽孢桿菌，兩端鈍圓，周生鞭毛，能運動，少數無鞭毛，營養體單個存在或2-5個成鏈狀。內生芽孢橢圓形或圓形。第26頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四營養體為繁殖階段，橫裂生殖，對數生殖期往往2、4、8個或更多的營養體連在一起成串狀。此時繁殖快、代謝旺盛，適于用作接種材料。營養體在芽孢出現前先停止繁殖，細胞質濃縮，出現液泡和微粒，并逐漸形成芽孢和伴孢晶體。第27頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四（2）孢子囊期

當菌體成長老熟時，其一端斜生一個橢圓形的芽孢，另一端同時出現菱形(或其他形狀)的晶體即伴孢晶體(Parasporalcrystal)，是其主要的活性成分，伴孢晶體由不同分子量的多肽—原毒素（protoxin）組成，此時為孢子囊期。孢子囊呈長卵圓形，比營養體粗壯。用石炭酸復紅染色時，營養體為紅色，晶體深紅色，而芽孢不著色僅見具有輪廓的折光體。第28頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四Bacillusthuringiensissporeandproteincrystals第29頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四（3）芽孢和伴孢晶體的釋放孢子囊到一定時間后破裂，釋放出游離的芽孢和殺蟲晶體蛋白。

芽孢是細菌的休眠體，對高溫、干燥等不良環境條件有較強的抵抗力，菌劑即以芽孢粉狀態可以長期貯存。芽孢遇適宜條件可萌發成新的營養體。

伴孢晶體內含蛋白質毒素，是殺蟲的主要有效物質。

第30頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四2、培養特征蘇云金桿菌能在多種培養基上生長，在不同的培養基上形成的茵落形態有所不同。蘇云金桿菌的不同變種在相同的固體培養基上，培養性狀基本上頗為近似，但也表現有一定程度的差異。第31頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四3、生理特性Bt.對營養條件要求不高。

碳源：淀粉、糊精、麥芽糖、葡萄糖等。氮源：牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、花生餅粉、豆餅粉、魚粉，玉米漿等。無機鹽：磷酸氫二鉀、硫酸鎂、碳酸鈣等。Bt.在12-40℃間的溫度條件下都能生長，以27-32℃較為適宜，35-40℃生長很快，但易衰老，溫度低則生長緩慢。該菌適于微堿性條件，最適pH是7.5，當pH達8.5時還能正常形成芽孢，如pH降至5以下則不能形成芽孢。

第32頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四4、蘇云金芽孢桿菌的類群

根據營養細胞鞭毛抗原的血清學反應及其它特性，蘇云金芽孢桿菌可劃分為71個血清型和88個血清型亞種。到目前為止，已發現蘇云金芽胞桿菌的伴孢晶體蛋白至少對脊椎動物中4個門和節肢動物門中9個目的有害生物有活性。少數蘇云金桿菌產生外毒素（exotoxin）血清，對家蠅亦有毒性。第33頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四5、蘇云金桿菌不同亞種或菌株對昆蟲的致病性和毒力的差異

蘇云金桿菌的不同亞種對昆蟲的毒力差異很大。即使是同一個亞種，不同菌株對昆蟲的毒力差異也可以很大。毒力的大小與產生的毒素有關，也與細菌的致病機制和寄主昆蟲的特異性有關。第34頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四（二）蘇云金桿菌的毒素和致病機理1、蘇云金桿菌的毒素蘇云金桿菌能產生對多種昆蟲或其他無脊椎動物有害的活性成分，這些活性成分是其殺蟲的核心。目前，已從Bt中發現了10幾種有不同功能的生物活性成分。第35頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四（1）殺蟲晶體蛋白（Insecticidalcrystalprotein，ICP）

伴孢晶體（Parasporalcrystal）、伴孢晶體包含體（Parasporalcrystalinclusionbody）、晶體蛋白（Crystalprotein）、晶體毒素（Crystaltoxin），又稱δ-內毒素，是蘇云金桿菌具有殺蟲性能的主要毒素。

ICP由cry基因和cyt基因編碼，這些基因大多位于染色體外的質粒上。ICP的分子量27-140kDa,形狀各異。Bt的殺蟲活性與ICP的形狀、結構、大小密切相關。第36頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四①ICP基因的命名1981年Schnepf從HD-1中克隆到了第1個ICP基因。1998年Crickmore依據ICP基因的核苷酸序列及其演化關系，將ICP基因分為4級。2009年8月，ICP基因按照核苷酸序列的同源性已被分為cry1-cry59,cyt1和cyt2共61類，487個，其中cry基因460個，cyt基因27個。第37頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四②ICP的三維結構及功能ICP中最先獲得三維結構的是鞘翅目昆蟲特異性毒素蛋白Cry3A，接著又獲得鱗翅目昆蟲特異性毒素蛋白Cry1Aa的三維結構。結構域Ⅰ：由8個α螺旋組成，與細胞膜插入及孔隙形成有關；結構域Ⅱ：由3個β折疊片和2個短的α螺旋組成，與昆蟲上皮細胞表面毒素受體的結合有關；結構域Ⅲ：由2個β折疊片形成一個面對面的β夾層結構，具有毒素的穩定性、特異性與結合有關。第38頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四（2）營養期殺蟲蛋白（Vegetativeinsecticidalprotein，VIP）是專指營養期表達的殺蟲蛋白。具有熱不穩定性的可溶蛋白，95℃處理20min便失去活性。2009年8月，有65個vip基因被鑒定分離。VIP由vip1、vip2、vip3三種基因編碼，殺蟲活性各不相同，且在氨基酸序列的進化上與ICP沒有任何同源性。第39頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四Vip3A以可溶性蛋白的形式存在于害蟲中腸，與中腸上皮細胞上的受體結合，形成穩定的離子通道，破壞中腸形成孔洞，造成昆蟲死亡。對夜蛾科害蟲具有廣譜的殺蟲活性。一些對Bt殺蟲晶體蛋白有很強抗性的昆蟲對Vip3A都較為敏感，如Vip3A對小地老虎的毒性要比Cry1Ac高260多倍。第40頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四（3）β-外毒素（蘇云金素thuringiensin）

是Bt在生產階段產生的一種熱穩定（121℃處理15min，殺蟲毒力不降低）、低分子量（701kDa）腺嘌呤核苷酸衍生物，主要存在于Bt血清型H1菌株中。它是一種胞外因子，對蠅類毒力高，稱為“蠅因子”或“蠅毒素”；對紫外線穩定。殺蟲譜較殺蟲晶體蛋白廣，對線蟲、螨類均有毒殺作用。主要通過抑制RNA聚合酶的活性阻斷RNA合成導致昆蟲死亡，因而對人類和動物有一定毒性。第41頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四（4）雙效菌素（zwittermiciaA）即ZwA因子，是在Bt和蠟質芽孢桿菌Bacilluscereus(Bc)中發現的一種線形氨基多元醇類化合物。可溶于水，堿性條件下易水解，對熱敏感。可抑制子囊菌、擔子菌的生長。雖然其殺蟲活性低，但對Bt的其他殺蟲活性物質具增效作用，特別是與許多ICP混用時，不但具高的增效作用，還可減緩害蟲的抗性。雙效菌素化學結構簡單，可以人工合成，具有很好的開發利用前景。第42頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四2、蘇云金桿菌致病機理蘇云金桿菌對昆蟲的致病作用主要是通過昆蟲食入菌劑而引起的。菌劑包括芽孢和細菌所產生的毒素。菌體本身的繁殖可導致害蟲的死亡，而昆蟲能在短時間內死亡往往是蘇云金桿菌產生的毒素所致。蘇云金桿菌對多種昆蟲能引起發病而致死，但對另一些昆蟲則致病力很差，甚至沒有作用。第43頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四ICP的致病機理首先溶解在昆蟲的中腸中，ICP被昆蟲的中腸蛋白酶加工成有活性的毒素；隨后被激活的ICP結合到中腸上皮細胞的刷狀緣膜上的特異受體上；最后ICP與受體結合從而引起毒素構象變化，并使之能夠融合到中腸膜上，使膜形成孔隙和離子通道，導致昆蟲死亡。昆蟲對ICP抗性的產生往往就是因為受體結構的改變。第44頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四WhalonandWinge,2003第45頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四（三）Bt內毒素的利用1、含Bt內毒素新菌株的利用

從20世紀80年代中后期開始，利用DNA重組技術對毒素基因進行改造，構建綜合性能優良的重組菌株已成為國外各大生物農藥公司的目標，目前已有10余種遺傳重組殺蟲劑被批準進行后期田間試驗。通過構建重組菌株可以實現以下目標：●（1）擴大殺蟲譜；●（2）延長殺蟲毒素的持效期及改進釋放性能；●（3）提高毒力和殺蟲晶體蛋白的產量。第46頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四2、含Bt內毒素的轉基因作物的利用

1981年，Schnepf等人首次成功地克隆了第一個編碼Bt殺蟲晶體蛋白基因，揭開了利用基因工程培育抗蟲植物的序幕。目前全世界總共已獲得了50多種轉Bt殺蟲晶體蛋白基因植物，其中以雙子葉植物居多，而單子葉植物由于其遺傳轉化較困難，所以獲得的轉Bt基因的植物就相對較少。在已獲得的轉Bt殺蟲晶體蛋白基因植物中，絕大多數植物對靶標昆蟲產生了強烈的毒殺作用，有效地減少了害蟲損失。第47頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四第48頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四第49頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四2004年全球轉基因玉米、大豆、棉花和其它作物播種面積達到了2億英畝，比2003年的1.67億英畝增長了20%。

第50頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四第51頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四Unsprayed,non-transgeniccotton(left)andunsprayedBt(Cry1Ac)cotton(right)priortoharvest第52頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四轉基因作物的優點：●（1）己發現的高水平的Bt抗性基因都是隱性基因，在植物體內可穩定地遺傳與表達；●（2）殺蟲蛋白對昆蟲的幼蟲特別有效，可實現蟲害的早期防治；●（3）可實現植物的整株保護，尤其是化學藥劑噴施不到的部位的防治（如鉆心蟲）●（4）對人、畜及非靶標動物群休無害，不會破壞生態平衡。由于毒蛋白存留在植物組織中，不會污染環境；●（5）抗性持久，不易被環境因素所破壞。第53頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四3、害蟲對Bt的抗性

自20世紀90年代以來，在美國、泰國、馬來西亞、日本、中國等先后發現小菜蛾田間種群對Bt產生抗性以來，至少已有10種蛾類、2種甲蟲、4種蚊蠅類經50次以上反復Bt處理而表現有選擇抗性。在16種蟲種中經3~120代后增高10倍。

大多數對Cry毒素抗性產生的機理都和受體結合區域的突變有關。第54頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四SomeinsectspeciesandnematodesresistanttoCrytoxinsBravoandSoberon,2008.第55頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四延緩害蟲產生抗性的方法：（1）在轉基因作物中加入新的殺蟲基因，如Bin-like-Cry、Mtx-like-Cry和Vip毒素等。（2）在轉基因作物或工程菌中加入多種作用機理不同的cry基因，如將能夠與不同受體結合的cry基因在一株植物中表達。這樣，害蟲世代間同時產生對多種毒素抗性的可能性就呈指數級下降了。第56頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四（3）對Cry毒素進行分子改造，使其繞過與主要受體的作用，而直接產生活性。（4）利用鈣粘蛋白碎片來抑制害蟲的抗性。鈣粘蛋白的CR12區域能夠提高Cry1A對鱗翅目害蟲的活性。第57頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四五、蘇云金桿菌在害蟲防治上的應用1、殺蟲范圍蘇云金芽孢桿菌類的各變種對鱗翅目、膜翅目、直翅目、雙翅目、鞘翅目等350余種昆蟲有不同程度的防治效果，但主要應用于防治下列害蟲：●（1）經濟作物類：棉鈴蟲、紅鈴蟲、造橋蟲、煙青蟲；●（2）蔬菜類：菜青蟲、小菜蛾、菜螟；●（3）糧食作物類：二化螟、三化螟、稻苞蟲、稻縱卷葉螟，玉米螟等，●（4）果樹類：松毛蟲、桃小食心蟲、尺蠖、大袋蛾，卷葉蛾等。第58頁，共65頁，2023年，2月20日，星期四2、蘇云金桿菌的使用方法（1）