實驗部分（10分）1、計算胸腺指數、脾指數公式：單位mg/10g胸腺指數=胸腺重量/（小鼠體重X10）脾臟指數=脾臟重量/（小鼠體重X10）2、（1）白細胞（WBC）計數公式：X/4X10X20X106/L二白細胞/LX：為4個大方格內白細胞總數。-4：為每大方格（即0.1ul）內白細胞平均數。X10：1個大方格的容積為0.1U1,換算成1ul°X20:血液的稀釋倍數。X106：將ul換算成L（2）計數方法：自小鼠尾靜脈采血0.02mL將其插入稀釋液底部，輕輕將血放出，混勻。用微量吸管或玻璃棒取混勻的細胞懸液1滴，充入計數池與蓋片的縫隙中，靜置2-3min，使白細胞下沉。在顯微鏡下用低倍鏡（10X）計數四角4個大方格的白細胞總數。注意事項：①在大方格內壓線細胞應按“數上不數下，數左不數右”的原則計數。②稀釋液要過濾，小試管、計數板須清潔，以免雜質、微粒等被誤認為細胞。③沖池前要搖勻，要注意，沖池時不可氣泡，否則應重新沖池。（3）血液稀釋液用的是3%稀乙酸3、腹腔巨噬細胞試驗（1）實驗原理：巨噬細胞是機體非特異性免疫功能的重要組成部分，可非特異吞噬較大的顆位性異物如雞紅細胞、白色念珠菌等，稱為大吞噬現象。將雞紅細胞注入小鼠腹腔中，巨噬細胞由于具有趨化性，便向雞紅細胞處聚集，將之內吞入胞質，形成吞噬泡，然后在胞內與溶酶體融合，將雞紅細胞消化分解一段時間后取巨噬細胞，利用巨噬細胞貼壁的特性觀察吞噬現象，作為判定其吞噬活性的指標。（2）染料及染色方法：Giemsa（姬姆薩應用液）染色5min后再用蒸餾水漂洗晾干（3）淀粉肉湯的作用：誘導腹腔內產生較多的巨噬細胞4、肝臟DNA提取實驗，（1）研磨抽提各步所用試劑：研磨肝臟先用冰冷的生理鹽水水洗3次再置于加入2ml勻漿液的研缽中，研磨至無明顯組織塊存在。離心棄上清加消化液55°C水浴酶解過夜，沉淀加Rnase。加入等體積酚:氯仿:異戊醇抽提慢慢旋轉混勻離心用擴口吸頭移出含DNA的水相加等體積氯仿:異戊醇，慢慢顛倒混勻，離心。用擴口吸頭小心吸出含DNA的水相，加1/10體積的NaAc，小心混勻充分，再向管中加入2倍體積的無水乙醇，混勻充分。待基因組DNA脫水成絲，即為染色體絲，用槍頭小心吸出液體，染色體用75%冷乙醇洗滌一次離心超凈臺中稍微干燥（不要太干，否則DNA不易溶解）加TE緩沖液即可得到小鼠肝臟基因組DNA。（2）提DNA的各試劑及作用，提取DNA的一般過程是將分散好的組織細胞在含SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質，再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質，得到的DNA溶液經乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。在勻漿后提取DNA的反應體系中，SDS可破壞細胞膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分離，EDTA則抑制細胞中DNase的活性；蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）存在下保持很高的活性，可將蛋白質降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來。TE緩沖液（pH8.0）：10mmol/LTris-HCl、25mmol/LEDTA5XTBE:5.4gTris、2.75g硼酸、2mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）,加水到100ml第一章緒論1、先天性免疫：也稱自然免疫指能非特異的阻擋或清除入侵體內的病原微生物及體內出現的突變、衰老細胞。先天性免疫在感染的早期執行防衛功能。2、獲得性免疫：機體與外來侵染物接觸以后獲得的免疫特性。3、過繼免疫：又稱過繼轉移，指通過轉移免疫的淋巴細胞到一個未免疫的個體使其與供體具有同樣特異的免疫性。第二章抗原1、完全抗原與半抗原的區別：完全抗原同時具有免疫原性和抗原性，半抗原只有抗原性而不具有免疫原性，如二硝基酚、青霉素。注：免疫原性，當一種物質免疫機體后能誘導機體產生相應抗體，或者激活淋巴細胞產生免疫應答的特性。抗原性/特異反應性，能與相應抗體或致敏淋巴細胞發生特異性結合的能力。2、抗原的五種分類方法（了解）①按抗原的來源分：天然抗原、人工抗原、合成抗原②按抗原與機體的親緣關系分：自身抗原、同種異型抗原（Ag來自同種生物不同個體）、異種抗原（來自不同種X異嗜性抗原（不同種屬生物間存在的共同抗原）③按抗原是否依賴T細胞分：胸腺依賴性抗原TD-Ag（必須有Th細胞的輔助才能刺激B細胞產生抗體的抗原）、胸腺非依賴性抗原TI-Ag（不須Th細胞的輔助即可刺激B細胞產生抗體）④按抗原是否在體內細胞內合成分：內源性抗原（指細胞內產生的蛋白質抗原，在有核細胞內加工，由MHCI分子遞呈）、外源性抗原（指由細胞外進入細胞的蛋白質抗原在抗原遞呈細胞內加工，由MHCII分子遞呈）。3、超抗原：只需極低濃度即可誘發最大的免疫效應的一類抗原，類似絲裂原的作用。SAg作用機制與普通抗原的區別：①不需要Ag遞呈②無MHC限制性③與T細胞的V0區結合4、抗原決定簇：又稱表位，指位于抗原分子表面或其他部位的具有一定組成和特殊結構的化學基團，是抗原分子與抗體及TCR/BCR特異結合的基本單位。5、半抗原特點：半抗原+蛋白質（載體）=完全抗原（賦予半抗原以免疫原性的蛋白質稱為載體）6、佐劑：預先或與抗原同時注入機體，可增強機體對抗原的免疫應答或改變免疫應答類型的非特異性免疫增強性物質。第三章抗體1、抗體與免疫球蛋白的區別：抗體（Ab）指能和相應抗原特異性結合的具有免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白（Ig）指具有抗體活性的或化學結構與抗體相似球蛋白。Ab都是Ig，Ig不一定是Ab,即并非所有的免疫球蛋白都具有抗體活性。2、五大類免疫球蛋白的特點：①IgG，含量最高，是五類Ig中半衰期最長的，3個月的嬰兒能合成IgG，易通過毛細血管壁，廣泛分布于細胞外液中。唯一能通過胎盤的Ig，能從經典途徑激活補體，發揮調理作用、ADCC作用，再次免疫應答產生的抗體。②IgM：五聚體，分子量最大（900kd），又稱巨球蛋白，效價高，新生兒最早合成的Ig，初次免疫應答產生的Ig一血清中特異性IgM水平增高提示有近期感染，激活補體（能力最強）③IgA，血清型IgA主要為單體形式存在血清中。分泌型IgA為二聚體形式存在唾液、淚液、初乳、呼吸道和腸道分泌液中，稱SigA。嬰兒可從母乳中獲得SIgA，這是一種重要的自然被動免疫。發揮ADCC作用④IgD，是B細胞成熟的一個標志。⑤IgE，血清中含量

最低，半衰期最短2.5天，與肥大細胞、嗜堿性粒細胞表面的Fc8R結合，能引起I型變態反應。ADCC抗體依賴細胞介導的細胞毒作用：IgG或IgA與靶細胞結合后其Fc段和攜帶FcyR的效應細胞（NKcells、M^和PMN）或FcaR的效應細胞（PMN）結合，釋放穿孔素或顆粒酶導致靶細胞溶解或凋亡。PMN：中性粒細胞3、抗體多樣性：①胚系中眾多的V、D、J基因片段；②V-D-J和V-J重排時，基因片段進行隨機組合（DNA多樣性的主要來源）；③VDJ連接過程中的核苷酸缺失和N區的核苷酸插入：④匚鏈H鏈之間隨機配對組合；⑤體細胞突變。B細胞成熟過程：淋巴十細胞今原B細胞今前B細胞今未成熟細胞今成熟B細胞今抗原作用成活化B細胞今記憶B細胞今漿細胞（分泌胞漿Ig）第四章補體系統1、補體組成成分及理化特性：2、補體活化的經典途徑：激活過程（三個階段），識別階段：抗原和抗體結合后，抗體發生構象改變，使Fc段的補體結合部位暴露，補體C1與之結合并被激活，這一過程被稱為補體激活的啟動或識別。活化階段：活化的C1s依次酶解C4、C2,形成具有酶活性的C3轉化酶，后者進一步酶解C3并形成C5轉化酶。膜攻擊階段:膜攻擊復合體（C5b6789n）形成C5aC4b2b3b今C5今C5b+C6+C7今C5b67+C8分C5b678+nC9分C5b6789n（膜攻擊復合體）分細胞裂解注，MAC（溶膜復合物）的效應機制：①膜孔改變了膜的通透性，使K+、蛋白質等可以外滲，胞內滲透壓降低，細胞溶解；②鈣離子被動向胞內彌散，細胞死亡3、補體活化三條途徑的比較比較項目補體激活物質經典途徑凝集素途徑Ag-Ab復合物（IgG1.2.3.IgM）凝集素（MBL）參與的補體成分C3轉化酶C5轉化酶作用效應C1?C9C4,C2?C9C4b2bC4b2bC4b2b3bC4b2b3b參與體液免疫有特異性參與體液免疫無特異性旁路途經IgG4,IgA,IgE及

多糖類物質C3比較項目補體激活物質經典途徑凝集素途徑Ag-Ab復合物（IgG1.2.3.IgM）凝集素（MBL）參與的補體成分C3轉化酶C5轉化酶作用效應C1?C9C4,C2?C9C4b2bC4b2bC4b2b3bC4b2b3b參與體液免疫有特異性參與體液免疫無特異性旁路途經IgG4,IgA,IgE及

多糖類物質C3,P,B,D因子，C5?C9

C3bBb

C3bBb3b參與體液免疫無特異性I因子的抑制作用（Factorl），裂解C3b為iC3b和C3f,繼而裂解iC3b為C3c和C3dg，裂解C4b為C4c和C4d。S蛋白的作用，結合C5b67,阻止膜攻擊復合物的形成5、C1抑制分子（C1inhibitor,C1INH）的作用，結合活化的C1rC1s，使其失去正常酶解底物C4和C2的功能C4bp的抑制作用：結合C4b，抑制C4b與C2的結合，防止C3轉化酶的組裝。促進I因子對C4b的蛋白水解6、常見補體缺陷病：系統性紅斑狼瘡、遺傳性血管水腫病（C1IHN缺陷引起）、奈瑟菌感染第五章免疫系統的組織、器官、細胞1、初級淋巴器官又叫中樞免疫組織器官包括骨髓和胸腺骨髓，造血組織，各類免疫細胞的發生場所，B細胞發育成熟的場所。包括骨髓基質細胞和造血干細胞，造血干細胞又有髓樣干細胞系和淋巴樣干細胞系（B淋巴細胞、T淋巴細胞）。胸腺，胸腺位于胸腔縱隔上部，分左、右兩葉，呈扁條狀。胸腺表面包有薄層結締組織被膜。被膜內伸形成胸腺隔，將胸腺分成許多小葉，每個小葉的周邊為皮質，深部為髓質。胸腺的功能是T細胞分化成熟的場所；分泌胸腺激素。法氏囊：鳥類的泄殖腔的上方，Bcell的發育場所，切除之后不能產生抗體2、次級淋巴器官又稱外周淋巴器官，包括淋巴結、脾以及腸系、皮膚等有關組織淋巴組織器官。T、B細胞定居的場所；免疫應答的發生部位淋巴結：不管發生哪類免疫應答，都會引起局部淋巴結腫大脾臟：是人體中最大的淋巴器官，位于左腹部，最大的免疫器官，主要功能是過濾和儲存血液3、BT細胞活化的三信號機制（1）B細胞活化的雙信號機制：第一信號是B細胞的BCR識別并結合抗原肽，其抗原刺激信號由Iga/Igp傳導入細胞內；第二信號即協同刺激信號：B細胞活化需Th細胞的輔助。T細胞表面的CD40L、LFA-1等與B細胞表面的相應的配體CD40、ICAM-1等結合增強B細胞與T細胞之間的作用，共同提供B細胞活化的第二信號。（2）Th細胞（CD4+TH細胞）活化的雙信號：第一信號是Th細胞識別抗原肽的同時還識別與抗原肽結合的MHCII類分子，其識別抗原的信號由CD3傳遞入細胞內；第二信號是B細胞表面協同刺激分子如B7、ICAM-1等與T細胞表面協同刺激分子受體CD28、LFA-1等結合，產生T細胞活化的協同刺激信號第三信號：活化后的B細胞表面可表達IL-2、4、5、6等多種細胞因子受體。同時APC如巨噬細胞釋放IL-1等細胞因子作用于Th細胞（即也有人稱之為T細胞活化的第三信號），Th細胞在此三個信號的刺激下充分活化、增殖，產生更多的細胞因子如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6等作用于B細胞（即B細胞活化的第三信號）。4、B細胞的主要表面標志：①BCR復合物，由BCR（mIg）、Iga、Ig。組成。②Fc受體（FcR），主要由FcyR、Fc￡R分子組成。識別并結合不同的抗體的Fc段。③補體受體④MHC-II抗原⑤B7分子—T細胞協同刺激分子，對B細胞的抗原呈遞及B細胞與T細胞之間信號傳遞起重要作用。⑥CD40分子一B細胞協同刺激分子，同CD40L（活化T細胞）結合促B細胞對TD-Ag應答，誘導Ig同種型的類別轉換5、T細胞表面標記：①TCR-CD3復合物，由TCR與CD3組成。傳遞T細胞活化信號②CD4和CD8分子③整合素，介導T細胞的移行；在T細胞同APC或靶細胞間起粘附作用；起信號傳導作用。④CD2分子又稱LFA-2（淋巴細胞功能相關抗原-2）和￡受體（綿羊紅細胞受體），介導T細胞與抗原遞呈細胞間的粘附作用。⑤CD28分子和CTLA-4，CD28分子與表達在APC上的B7分子結合，為初始T細胞提供協同刺激信號，促使T細胞活化和增殖。CTLA-4分子同B7分子結合提供抑制信號給化T細胞，阻止T細胞的增殖，限制T細胞分泌IL-2。⑥.CD40L（CD40ligand，又稱gp39分子），分布在活化的T細胞表面，CD40L分子與表達在B細胞上的CD40分子結合，為B細胞提供協同刺激信號。⑦絲裂原受體⑧白細胞介素受體，介導細胞間相互作用的細胞因子。如IL-1R、IL-2R6、單核吞噬細胞：單核細胞體積較大，蹄狀核，透射電鏡顯示其高爾基體發達、線粒體豐富、胞漿顆粒明顯。主要功能：①吞噬殺傷功能，參與機體的非特異免疫防御②加工處理提呈抗原，啟動特異性免疫應答③抗腫瘤作用（ADCC效應）④免疫調節作用7、樹突細胞：分布在外周免疫器官的淋巴濾泡。是最有效的抗原呈遞細胞粒細胞：有豐富的胞質顆粒，根據對染色劑的不同反應，可分為中性、嗜酸性、嗜堿性三種類型，是重要的免疫效應細胞抗原呈遞細胞（APC）主要有三類：巨噬細胞、樹突狀細胞、B細胞第六早到第十一早主要組織相容性復合物（MHC）：表達于脊椎動物有核細胞表面的一類具有高度多態性、含有多個基因座位，并緊密連鎖的基因群。MHC分布、結構、功能，和區別。主要有兩大類：MHC-I、MHC-IIoMHC-I類分子表達于所有有核細胞表面，MHC-II類分子表達于部分細胞表面,APC、活化的T細胞。兩者都是共顯性表達。結構功能上差異很大。一）HLA-I類結構特點：二條多肽鏈（非共價鍵連接的糖蛋白）a鏈（重鏈）45kD，由MHC-I類基因編碼，具有高度多態性。P鏈，即82m,12kD，由15號染色體基因編碼（人）功能區：肽結合區：a1和a2功能區是與已處理過的特異性抗原肽片段結合的部位Ig樣區：a3是與TC細胞表面CD8分子結合的部位，82m與維持HLA-I類分子的構型穩定性有關跨膜區：固定MHC-I類分子胞漿區：參與細胞內外的信號傳遞功能：識別和呈遞內源性抗原肽，與輔助受體CD8結合，對CTL的識別起限制作用二）HLA-II類結構特點：兩條異質多肽鏈（非共價鍵連接的糖蛋白）：a鏈：35kD,a1和a2功能區8鏈：28kD,81和82功能區兩條鏈均由MHC-II類基因編碼產生功能區：肽結合區：a1和81功能區是與已處理過的，特異性抗原肽片段結合的部位Ig樣區：a2和82是與Th細胞表面CD4分子結合的部位跨膜區：固定MHC-II類分子胞漿區：參與細胞內外的信號傳遞功能：識別和呈遞外源性抗原肽，與輔助受體CD4結合，對Th的識別起限制作用。3..MHC的遺傳特點：MHC基因為單元型遺傳方式，共顯性表達。子女與父母有一半HLA相同。子女間1/4機率完全相同，完全不同；1/2機率一半HLA相同。MHC的共顯性表達。4.單克隆抗體（McAb）由單一克隆B細胞雜交瘤產生的，只識別抗原分子某一特定抗原決定簇的特異性抗體。5單克隆抗體的制備：1.抗原的制備2.免疫動物3.親本細胞的選擇4.細胞融合（PEG（聚乙二醇）介導細胞融合，最常用的細胞融合劑）5.雜交瘤細胞的選擇培養6.雜交瘤細胞的篩選（最經常用方法是ELISA法）。7.雜交瘤細胞的克隆化（同時要凍結保存以防失種）8.單克隆抗體的鑒定9?分泌單克隆抗體雜交瘤細胞系的建立10.單克隆抗體的大量制備免疫凝集：直接凝集反應：①玻片法用于定性測Ag，如ABO血型鑒定、細菌鑒定②試管法用于定量測Ab，如診斷傷寒病的肥達氏反應間接凝集反應：是用可溶性抗原包被在一種與免疫無關的，具一定大小的不溶性顆粒（即載體顆粒，如：乳膠顆粒或紅細胞）的表面，然后與相應抗體作用，在有適宜電解質存在的條件下，結合產生的凝集現象沉淀反應：①溶液中的沉淀反應：環狀沉淀反應是使抗原與抗體在沉淀管內形成交界面，然后在此交界面處出現一環狀的乳白色沉淀物。出現此環狀反應的抗原最高稀釋度即為沉淀素的效價②凝膠中的沉淀反應一一單/雙向免疫擴散③免疫電泳血清免疫電泳，火箭免疫電泳，對流免疫電泳（電滲析抗體點陽極，抗原點陰極）④免疫印跡免疫標記技術：常用的免疫標記技術：①免疫熒光技術（IF）常用熒光素：異硫氰酸熒光素（FITC）發黃綠色熒光藻紅蛋白（PE）發紅色熒光②酶聯免疫吸附試驗（ELISA）③免疫印跡法（Westernblotting臉測HIV免疫應答是免疫細胞識別抗原后活化、增殖、分化，產生的應答產物（如抗體和效應性免疫細胞）參與生理性和病理性效應的過程。細胞免疫應答是從初始T細胞接受抗原刺激到分化成效應T細胞并將抗原清除的過程。主動免疫：指用抗原刺激一個個體而產生的免疫性，受到免疫的個體再遇到相同的抗原刺激便會做出強烈的免疫應答。被動免疫：指把一種特異性抗體人工轉移給未收到過該病毒侵染的個體，使該個體獲得抗該病毒的能力。過繼免疫：指通過轉移免疫的淋巴細胞到一個未免疫的個體，使其與供體具有同樣特異的免疫性。細胞凋亡或程序化細胞死亡：是多細胞有機體為調控機體發育，維護內環境穩定，由基因控制的細胞主動死亡過程，是細胞衰老自然死亡的主要方式之一。細胞凋亡的檢測方法：形態學檢測常用的DNA特異性染料有：碘化丙啶（PI）可以使死細胞和凋亡晚期染色，但不染活細胞和凋亡早期細胞，并能在紫外光下發出紅色熒光；生物化學檢測:染色質DNA斷裂，形成180?200bp整數倍的DNA片段；電泳后可觀察DNAladder免疫學檢測：ELISA（靈敏度高、需要的細胞數少、最低可檢測到50個細胞凋亡，且可同時對多份樣品進行檢測，抗體沒有種屬特異性，可用以測定不同種屬細胞凋亡，測定時方法較簡便，不需要預先標記細胞）陽性選擇與陰性選擇陽性選擇：表達TCR-ap的CD4+CD8+雙陽性細胞與胸腺皮質的上皮細胞直接接觸，能夠識別MHC—II類或I類分子的雙陽性細胞被選擇而繼續發育為CD4+或CD8+的單陽性細胞，反之，則發生細胞凋亡。陽性選擇，使T細胞獲得了MHC的限制性：CD4-MHCIICD8-MHC-I經過陽性選擇的單陽性細胞與皮、髓質交界的巨噬細胞或樹突狀細胞表面的自身抗原肽一MHC復合物高親和力結合，則導致克隆消除，或克隆不應答。反之則順利地穿過胸腺髓質并發育為CD4+或CD8+單陽性的成熟T細胞。陰性選擇，使T細胞獲得了對自身抗原耐受、對非己抗原識別的能力經過陽性和陰性選擇后，CD4+或CD8+單陽性細胞離開胸腺進入外周免疫器官而成為具有免疫活性的外周T細胞，發揮免疫效應免疫調節：免疫應答過程中,各種免疫細胞與免疫分子相互作用形成正負調節的網絡結構,并在遺傳基因、神經系統以及內分泌系統的協同作用下維持機體的平衡和穩定。免疫調節之一抗體的調節作用：）受體交聯：BCR-Ag-Ab-FcyRIIb，產生抑制信號，阻斷B細胞應答。獨特型（idiotype,Id）不同B細胞克隆產生的不同Ig分子（Ab1）V區及TCR和BCR的V區所具有特異性免疫原性，可誘導機體產生相應的抗獨特型抗體（Ab2）。獨特型指Ig的V區的抗原特異性決定簇。細胞介素分類：白細胞介素（interleukin,IL）干擾素（Interferon,IFN）集落刺激因子（colonystimulatingfactor，CSF）腫瘤壞死因子（Tumornecrosisfactor,TNF）生長因子（Growthfactor,GF）趨化因子（chemokineCK）免疫耐受:由于抗原誘導的專一性淋巴細胞功能缺失或死亡而導致的一種特異性無應答狀態，或稱為負免疫應答。影響免疫耐受形成的因素之一注射途徑:：靜脈注射〉口服〉腹腔注射〉皮下及肌肉注射