關于原理示意圖詳解第1頁，共18頁，2023年，2月20日，星期三一、實驗目的了解和掌握免疫酶技術的測定原理。掌握酶聯免疫吸附測定技術的操作步驟，學會利用競爭ELISA的方法，定量測定抗體或抗原。了解免疫酶技術在生物學和醫學研究的重要意義及應用價值。第2頁，共18頁，2023年，2月20日，星期三二、實驗原理免疫標記技術（immunolabellingtechnique）:

是指用熒光素、放射性同位素、酶、發光劑或電子致密物質等作為示蹤劑，標記抗體或抗原進行的抗原抗體反應。

特點：高度靈敏、特異、快速，定性、定量、定位分類：免疫酶技術、免疫熒光技術、放射免疫技術、免疫電鏡技術、免疫膠體金技術和發光免疫測定。第3頁，共18頁，2023年，2月20日，星期三免疫酶技術(enzymeimmunoassay)：

是將抗原和抗體的特異性免疫反應與酶的催化反應相結合而建立的一種免疫檢測技術。

就是利用酶標記抗體或抗原，以檢測相應抗原或抗體的一種免疫學標記技術。第4頁，共18頁，2023年，2月20日，星期三酶聯免疫吸附試驗ELISA（enzymelinkedimmunosorbentassay）

是一類常用的免疫酶技術。是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應在固相表面進行。常用的酶：辣根過氧化物酶(HRP)

堿性磷酸酶（AP）。第5頁，共18頁，2023年，2月20日，星期三ELISA檢測抗原

Ag+ Ab*?Ag-Ab*第6頁，共18頁，2023年，2月20日，星期三ELISA檢測抗體

Ab+ Ag*?Ab-Ag*第7頁，共18頁，2023年，2月20日，星期三ELISA檢測抗體Ag+Ab1?Ag-Ab1Ag-Ab1+Ab2*?Ag-Ab1-Ab2*第8頁，共18頁，2023年，2月20日，星期三第9頁，共18頁，2023年，2月20日，星期三競爭ELISA檢測

抗原第10頁，共18頁，2023年，2月20日，星期三固定OD值第11頁，共18頁，2023年，2月20日，星期三第12頁，共18頁，2023年，2月20日，星期三實驗材料：羊抗人血清白蛋白抗體（一抗）已知含量的人血清白蛋白（作標準曲線）待檢人血清白蛋白辣根過氧化物酶標記的驢抗羊抗體（二抗）包被液CBS：PH9.6，0.05mol/L碳酸鹽緩沖液洗板液或稀釋液：PH7.4，0.01mol/LPBS底物溶液：OPD-H2O2終止液：2mol/LH2S04酶標反應板（一條/人）第13頁，共18頁，2023年，2月20日，星期三三、操作步驟包被抗原

抗原用包被液（CBS）稀釋至合適濃度，加入到酶標板中，100μl/孔，放入濕盒中，4℃過夜。次日，用洗板液洗板3次（將洗板液加入每孔，1min后傾去），以洗去未包被的游離抗原。抗原100ul/孔濕盒中，4℃過夜酶標板第14頁，共18頁，2023年，2月20日，星期三抗原與抗體的預孵育制作標準曲線：

在稀釋板中，用PBS倍比稀釋標準抗原，每種濃度的抗原最終為50μl，分別在各抗原孔中加入250μl一定濃度的抗體，放入37℃恒溫培養箱中30min。待測抗原：

取50μl未知濃度的抗原按照同上操作。待測抗原50ulPBS50ul50ul稀釋液50ul50ul100ul標準抗原250ul抗體稀釋板37℃，30min第15頁，共18頁，2023年，2月20日，星期三3.與固相抗原的競爭結合

取稀釋板中預孵育的抗原抗體混合液100μl，加入酶標板的抗原孔中，放入37℃恒溫培養箱中60min。洗板3次。100ul稀釋板酶標板37℃，60min洗板3次第16頁，共18頁，2023年，2月20日，星期三4.酶標二抗的結合

酶標抗體用稀釋液稀釋至工作濃度后，加入每孔中，100ul/孔，置濕盒中放37℃30min。洗板3次。5.加入底物顯色液（用前再配制，并置棕色瓶內）每孔加入底物顯色液，100ul/孔，濕盒中37℃保溫一定時間。6.終止反應

待出現明顯顏色反應（或一定時間）后，加入終止液，

50ul/孔以終止反應。7.結果測定用酶標儀在492nm波長下測定OD值。