引物設計實例第一頁，共十四頁，2022年，8月28日SPBamHIpcDNA3.1NR1Plasmid1:Plasmid2GFP第二頁，共十四頁，2022年，8月28日SPBamHI(GGATCC)pcDNA3.1NR1-1aGFP第三頁，共十四頁，2022年，8月28日121ggggctcctagagaacccgggggcgcttgaccgcgcgcgggcggcccgcgggtcgtacat181cgcgaggtcgtcgcactcgcgcaacccagagccaggcccgctgtgcccggagctcatgag241caccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc

cgcgcggatcc301cgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgtt361ccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgc421cacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacct481catctctagccaggtctacgctatcctagttagccacccgcctactcccaacgaccactt541cactcccacccctgtctcctacacagctggcttctacagaatccctgtcctgggactgac601tacccgaatgtccatctactctgacaagagtatccacctgagtttccttcgcacggtgcc661gccctactcccaccagtccagcgtctggtttgagatgatgcgagtctacaactggaacca721catcatcctgctggtcagcgacgaccacgagggacgggcagcgcagaagcgcttggagac781gttgctggaggaacgggagtccaaggcagagaaggtgctgcagtttgacccaggaaccaa

NR1的編碼序列(~4000bp)紅色為信號肽,藍色為BamHI酶切位點,下劃線標出酶切位點的閱讀框第四頁，共十四頁，2022年，8月28日ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGFP序列(~700bp)第五頁，共十四頁，2022年，8月28日引物要求PCR擴增GFPGFP兩邊添加BamHI酶切位點保證NR1的閱讀框不改變第六頁，共十四頁，2022年，8月28日5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3’3’

TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5’GFP序列5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3’

3’

TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………CGTACCTGCTCGACATGTTCATT5’Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………………..AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5’Primer2Primer1:5’

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………..Primer2:5’

TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….Primer1:5’

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………..Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….第一步：擴增GFP基本序列變性,引物復性除掉了第七頁，共十四頁，2022年，8月28日第二步：GC比值；Tm值Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA…………..Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）除掉了第八頁，共十四頁，2022年，8月28日第三步：酶切位點Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）BamHI:ggatccPrimer1:5’

ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2:5’

ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC第九頁，共十四頁，2022年，8月28日第四步：閱讀框atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc

cgcgcg

gat

cccgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgttccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgccacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacct…..Primer1:5’

ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGANR1序列：Primer1:5’

ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA增加了第十頁，共十四頁，2022年，8月28日atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc

cgcgcggatcccgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgttccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgccacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacctNR1序列：5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3’

GFP序列cgcgcg

gatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC

……………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG??ggatcccgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgttccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgccacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacct插入GFP后的組合序列第十一頁，共十四頁，2022年，8月28日Primer2:5’

ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCCPrimer2: