細胞生物學實驗幾種光學顯微鏡的使用

實驗目的

了解幾種光學顯微鏡的結構、工作原理、主要用途和使用方法；掌握使用普通顯微鏡提高分辨力的方法。實驗原理O2O1B1A1ABA2F1F2B2

幾種光學顯微鏡1．普通光學顯微鏡：

普通光學顯微鏡也叫復式顯微鏡，是最常見，最簡單的顯微鏡。它適于觀察一般固定的，有色的透明度較高的標本。其最大分辨力一般為0.2微米，從構造上可分光學、機械和電子三大系統。2．暗視野顯微鏡：

暗視野顯微鏡是以丁達爾現象(Tyndallphenomenon)(即光的微粒散射現象)為基礎設計的，它使用了特殊的聚光器進行斜射照明，因光源中心束不直入物鏡，所以視野黑暗，而被檢細胞器因斜射照明發生衍射和反射，所以發亮可見。暗視野顯微鏡可用增加光照方法增加物體與背景的反差，因而可觀察到0.2-0.004微米直徑的微小粒子，但它分不清被檢物的細微構造，它常用于觀察物體的存在與運動。暗視野顯微鏡與普通光學顯微鏡的區別，主要在于聚光器的不同，致使照明方法有別。確切地說，稱暗視野顯微鏡為暗視野照明更為貼切，它是照明光線僅照亮被檢樣品而不進入物鏡，使視野背景暗黑，樣品明亮的照明方法。

3．相差顯微鏡：

相差是指同一光線經過折射率不同的介質其相位發生變化并產生的差異。相位是指在某一時間上，光的波動所達到的位置。

一般由于被檢物體(如不染色的細胞)所能產生的相差的差別太小，我們的眼睛是很難分辨出這種差別的，只有在變相差為振幅差(明暗之差)之后，才能被分辨。

相差顯微鏡是以光的干涉現象為基礎設計的。與普通光學顯微鏡比較，它在聚光器和物鏡上作了改動。用裝有環狀光欄的聚光器造成的空心光線柱，使直射光

(背景)和衍射光

(樣品)分開。同時在物鏡的后焦面上裝有相位板，使直射光和衍射光發生干涉，從而把我們肉眼不能見的相位差變為可見的振幅差，同時相位板上裝有吸收膜，吸收部分直射

(或衍射)光以增加反差，使人們能夠看清更加細微的結構。所以相差顯微鏡一般用于觀察活細胞的細微結構。4．熒光顯微鏡：

熒光是指某些物質經波長較短的光線照射后，分子被激活吸收能量后呈激發態，其能量除部分轉化為熱量或用于光化學反應外，相當一部分則以波長較長的光能形式輻射出來，這種波長長于激發光的可見光稱作熒光。

熒光顯微鏡是以紫外線

(3650A)或藍紫光

(4200A)照射某些物質，可激發其產生熒光的原理為基礎設計的，利用一個高發光效率的光源，經過一個濾光系統得到紫外光(或藍紫外光)，直接照射標本中的自然熒光物質，使其產生自發熒光，再加以鏡檢。或以熒光染料先對標本進行染色，然后使之在上述光源照射下產生次生熒光，再加以鏡檢。這種顯微鏡主要用于觀察熒光(或次生熒光)物質在細胞內分布情況，以及測定細胞器的生理活性。

如何提高分辨力顯微鏡的能力是質量和性能的標志。能力包括分辨率、放大率、焦點深度和視場寬度等。其中最重要的是分辨率。各種能力都有一定的界限，既互相作用，又互相制約。改善和提高了某種能力，同時降低了某些能力，只能顧其主要，兼顧其他，綜合統籌。1．數片孔徑(numerialaperture)

數片孔徑(N.A.)也叫鏡口率，是物鏡和被檢樣品之間的介質的折射率(n)與物鏡所接受的光錐頂角(亦稱孔徑角)的一半α(半孔徑角)正弦的乘積。其公式如下：N.A.=n·sinα

物鏡的數值孔徑愈大，顯微鏡的能力愈強，數值孔徑與分辨率成正比，與焦點深度成反比。物鏡的數值孔徑的N.A.值刻在物鏡殼上，如40／0.65表示40倍的物鏡，數值孔徑為0.65。物鏡的數值孔徑隨前透鏡直徑的減少而增大。顯微鏡物鏡的前透鏡口徑愈小，數值孔徑愈大，放大倍數愈高，價格愈高。

2．分辨率(resolvingpower)

物鏡分辨率是指分辨被檢樣品細微結構的能力。通常以能清晰地分辨兩個物體點的最短距離來表示。其公式如下：R=0.61×λ/N.A．R：分辨率；

λ：照射光線波長；

N.A．：物鏡數值孔徑

分辨率以分辨兩個點的最短距離表示，R值愈小，分辨能力愈大。物鏡的分辨率與照明光線的波長成反比，與物鏡的數值孔徑成正比。

照明光線波長愈短，物鏡的數值孔徑愈大，顯微鏡的分辨率亦愈大。

物鏡的分辨力即顯微鏡的分辨率，目鏡與顯徽鏡的分辨率無關，它只把物像第二次放大，使眼睛便于觀察。目鏡只能將物鏡已經分辨的影像進行放大，無法觀察到未被物鏡分辨的細節。在光學成像過程中，目鏡不起初始造像作用，僅作放大而已。

3．放大率(magnification)

顯微鏡最后形成的物體放大影像，對被檢物體的大小比例稱為放大率，即像高比物高。放大倍數以長度計算，而不是以面積或體積計算。

顯微鏡的總放大率(Mt)應為：Mt=Mob×Me×MphMt：總放大率；Mob：物鏡放大率；

Me：目鏡放大率；Mph：攝影透鏡放大率

一般鏡檢觀察時，攝影附加透鏡的放大倍率不計算在內，因它未參于造像，顯微鏡辨別細微結構的能力，不取決于總放大率，而歸于物鏡的分辨率。顯微鏡的總放大率絕非愈高愈好，有其適量范圍：最低和最高界限。適宜的總放大率是所用物鏡數值孔徑的500～1000倍。在此范圍稱作有效放大率。例如：使用40／0.65物鏡時，應選配適宜的目鏡倍數范圍。

首先計算出有效放大倍率：

0.65×500～0.65×1000=325-650

再用物鏡放大倍率除以有效放大率：325÷40～650÷40=8-16

求得的數值是應選配的目鏡放大倍率的范圍，即要選用8×-16×的目鏡。

總之，總放大率超過物鏡數值孔徑的1000倍時，細微結構分辨不清，為空的放大，低于500倍時由于放大率過低，肉眼難以分辨。

4．焦點深度(depthoffocus)

當顯微鏡對被檢樣品的某一點或平面準焦時，影像的清晰范圍，不局限于這一點或面，在某上下的一定距離或深度內也是清晰的。這段清晰的距離或深度，就叫做焦點深度，簡稱焦深，焦深長表示清晰的上下范圍或深度大，焦深短，清晰的上下界限短。

顯微鏡的焦深可變，它與物鏡的數值孔徑和總放大率相關。焦深與物鏡的數值孔徑和總放大率成反比，收縮孔徑。影像的焦深加大，提高物鏡的數值孔徑，清晰深度變小，總放大率提高，焦深度小，總放大率降低，焦深加大。使用同一物鏡，配用倍率的目鏡，其焦深隨目鏡倍率加大而減少。

實驗用品：

(一)材料：草履蟲，洋蔥內表皮，紫鴨趾草等花粉，菠菜葉。(二)用品：普通光學顯微鏡，暗視野顯微鏡，相差顯微鏡，熒光顯微鏡，載玻片，蓋玻片，吸管，鑷子，剪刀等。實驗方法：

l．觀察草履蟲的外形、運動、纖毛、食物泡等。

取少許棉花纖維或擦鏡紙纖維，放于載玻片上，在其上滴一滴草履蟲懸液，然后加蓋玻片觀察。2．洋蔥表皮細胞和菠菜葉的細胞核、葉綠體的觀察在載玻片上滴一滴水，撕洋蔥鱗莖內表皮或菠菜下表皮一小塊放于其中，使其展開，然后加蓋玻片觀察。3．紫鴨趾草花粉外形、表面突起的觀察

在載玻片上滴一滴水，取紫鴨趾草雄蕊在其