第三章

細(xì)胞生物學(xué)研究方法

研究方法和手段的不斷創(chuàng)新推動(dòng)著科學(xué)的發(fā)展，每當(dāng)有一種新的重大技術(shù)突破時(shí)，即預(yù)示著科學(xué)將又一次飛躍，所以研究方法是非常重要的。當(dāng)今細(xì)胞生物學(xué)中使用的方法多種多樣，但總地來說，可劃分為四大類：細(xì)胞形態(tài)觀察的方法（顯微技術(shù)）、細(xì)胞組分分析與原位檢測技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)等。為什么學(xué)習(xí)研究方法？細(xì)胞生物學(xué)研究方法第一節(jié)：常用模式生物第二節(jié)：細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法第三節(jié)：組分分析第四節(jié)：細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞功能第一節(jié)、研究細(xì)胞生物學(xué)的模式生物:個(gè)體較小

易培養(yǎng)

操作簡單

生長繁殖快病毒：生物大分子互作、基因表達(dá)調(diào)控、腫瘤的發(fā)生與防治

細(xì)菌：轉(zhuǎn)基因、基因表達(dá)調(diào)控

酵母菌：細(xì)胞分裂周期調(diào)控、蛋白質(zhì)互作等

線蟲：1mm，959cell，3Day，發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、基因組學(xué)

果蠅：基因保守，與人類基因同源性高

斑馬魚：透明，個(gè)體發(fā)育與組織形態(tài)發(fā)生

小鼠：哺乳動(dòng)物

擬南芥：植物遺傳學(xué)幾種模式生物CaenorhabditiselegansDrosophilamelanogasterArabidopsisthaliana早在20世紀(jì)最初的20年中，人們就發(fā)現(xiàn)，如果把關(guān)注的焦點(diǎn)集中在相對(duì)簡單的生物上則發(fā)育的現(xiàn)象難題可以得到部分解答。因?yàn)檫@些生物的細(xì)胞數(shù)量更少，分布相對(duì)單一，變化也較好觀察。由于進(jìn)化的原因，細(xì)胞生命在發(fā)育的基本模式方面具有相當(dāng)大的同一性，所以利用位于生物復(fù)雜性階梯較低級(jí)位置上的物種來研究發(fā)育共通規(guī)律是可能的。尤其是當(dāng)在有不同發(fā)育特點(diǎn)的生物中發(fā)現(xiàn)共同形態(tài)形成和變化特征時(shí)，發(fā)育的普遍原理也就得以建立。因?yàn)閷?duì)這些生物的研究具有幫助我們理解生命世界一般規(guī)律的意義，所以它們被稱為“模式生物”。第二節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法光學(xué)顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。電子顯微鏡：以電子束為光源。掃描隧道顯微鏡（一）普通光學(xué)顯微鏡①照明系統(tǒng)1.構(gòu)成：②光學(xué)放大系統(tǒng)③機(jī)械裝置2.原理：經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡進(jìn)一步放大成像。普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)顯微鏡物象是否清楚不僅決定于放大倍數(shù)，還與顯微鏡的分辨力（resolution）有關(guān)。分辨率是指區(qū)分開兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離n=介質(zhì)折射率；α=鏡口角（聚焦點(diǎn)對(duì)物鏡鏡口的張角），N.A.=鏡口率（numericapertu??）。3.分辨力：指分辨物體最小間隔的能力。

?R=0.61λ/N．A．

–其中λ為入射光線波長；N．A．為鏡口率＝ｎsinα/2，n=介質(zhì)折射率；α=鏡口角（樣品對(duì)物鏡鏡口的張角）。?思考：如何提高顯微鏡的分辨能力？介質(zhì)空氣水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.66幾種介質(zhì)的折射率顯微鏡和顯微鏡的分辨能力肉眼：0.2mm;光鏡：0.2um;電鏡：0.2nm（二）相差顯微鏡把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處。原理用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本微分干涉差顯微鏡Differentialinterferencecontrastmicroscope（DIC）1952年，Nomarski發(fā)明，利用兩組平面偏振光的干涉，加強(qiáng)影像的明暗效果，能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。標(biāo)本可略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)。培養(yǎng)物中未經(jīng)染色的的同一個(gè)動(dòng)物細(xì)胞的三個(gè)圖象。A.普通光學(xué)顯微鏡亮視野看到的。B.微分干涉顯微鏡。C.相差顯微鏡系統(tǒng)。特點(diǎn)：光源為紫外線，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡；有兩個(gè)特殊的濾光片；照明方式通常為落射式。特異蛋白質(zhì)等生物大分子定性定位研究，標(biāo)本需特異熒光染料，光源為短波光（三）熒光顯微鏡Fluorescencemicroscope落射熒光顯微鏡的構(gòu)造吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡分色鏡汞燈紫外線保護(hù)罩孔徑光欄（FS）視場光欄（AS）細(xì)胞內(nèi)的天然物質(zhì)如葉綠素，經(jīng)紫外線照射后能發(fā)出可見熒光----自發(fā)熒光。細(xì)胞內(nèi)某些成分用熒光染料進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下也能觀察到熒光----誘發(fā)熒光。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingreen熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍(lán)色）用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。（四）激光共聚焦掃描顯微境Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM（四）激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)

LaserScanningConfocalMircroscope在熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上裝有激光掃描裝置，以單色激光作為光源，使樣品被激發(fā)出熒光，利用計(jì)算機(jī)迸行圖像處理，從而得內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像laserconfocalscanningmicroscope,LCSMLCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)/熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)（P55）是檢測活體中生物大分子納米距離和納米距離變化的有力工具，可用于檢測某一細(xì)胞中兩個(gè)蛋白質(zhì)分子是否存在直接的相互作用。FRET現(xiàn)象：當(dāng)供體發(fā)射的熒光與受體發(fā)色團(tuán)分子的吸收光譜重疊，并且兩個(gè)探針的距離在10nm以內(nèi)時(shí)，就會(huì)發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移，稱FRET現(xiàn)象。采用融合表達(dá)方式，可將兩個(gè)蛋白的距離拉近于5～10nm。FRET效率反映了被檢的兩種蛋白是否直接作用及作用的強(qiáng)弱。熒光漂白恢復(fù)技術(shù)（P56）又稱光脫色恢復(fù)技術(shù)，可用于檢測活體細(xì)胞表達(dá)或細(xì)胞內(nèi)部的分子運(yùn)動(dòng)以及在各種結(jié)構(gòu)上分子動(dòng)態(tài)變化率的大小。原理：利用高能量激光束的照射使特定的區(qū)域的熒光發(fā)生不可逆的淬滅，光漂白區(qū)熒光的恢復(fù)可通過非漂白區(qū)的熒光標(biāo)記分子在膜上或胞質(zhì)中運(yùn)動(dòng)至光漂白區(qū)來完成。二、電子顯微鏡以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束波長與加速電壓(通常50~120KV)的平方根成反比由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬倍用于觀察超微結(jié)構(gòu)（小于0.2μm）電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡基本區(qū)別

顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理光鏡LM200nm可見光（400-700nm）紫外光（約200nm)玻璃透鏡不要求真空利用樣品對(duì)光的吸收形成明暗反差和顏色變化電鏡TEM0.2nm電子束（0.01-0.9）電磁透鏡真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對(duì)電子的散射和透射形成明暗反差不同光線的波長名稱可見光紫外光X射線α射線電子束0.1Kv10Kv波長（nm）390~76013~3900.05~130.005~10.1230.0122（一）透射電子顯微鏡transmissionelectronmicroscope,TEM香煙過濾嘴纖維表面的煙霧粒子血液凝塊構(gòu)造（紅色為紅血球，蘭色為血小板，黃色為纖維蛋白）。TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE，TEM放大200倍的斜紋藻

作者：邁克爾·斯特林格(MichaelStringer)

作品名稱：《斜紋藻》(海洋硅藻)(200倍)

拍攝地點(diǎn)：英國艾塞克斯郡濱海韋斯特克利夫

所用技術(shù)：暗視野和偏振光

2009年世界顯微大賽放大30倍碳納米管

作者：保羅·馬歇爾(PaulMarshall)

作品名稱：碳納米管(30倍)

工作單位：加拿大國家研究理事會(huì)

拍攝地點(diǎn)：加拿大安大略湖渥太華

所用技術(shù)：立體顯微鏡技術(shù)

2009年顯微大賽作者：查爾斯·卡茲萊克(CharlesKazilek)

作品名稱：日本專業(yè)紙纖維(100倍)

工作單位：亞利桑那州大學(xué)

拍攝技術(shù)：共焦2009年顯微大賽放大100倍的專業(yè)紙纖維

2、制樣技術(shù)1）超薄切片電子束穿透力很弱，用于電鏡觀察的標(biāo)本須制成厚度僅50nm的超薄切片，用超薄切片機(jī)（ultramicrotome）制作。通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。包埋的樣品玻璃或金屬刀片超薄切片條將切片條置于玻片上，染色、加蓋玻片切片機(jī)的臂2）負(fù)染技術(shù)NegativeStainedActin用重金屬鹽（如磷鎢酸）對(duì)鋪展在載網(wǎng)上的樣品染色；吸去染料，干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達(dá)1.5nm左右。3）冰凍蝕刻freeze-etching亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后，冰升華，暴露出了斷面結(jié)構(gòu)。向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（replica）。AYeastCell（二）掃描電子顯微鏡20世紀(jì)60年代問世，用來觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)。分辨力為6~10nm，由于人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最近兩個(gè)光點(diǎn)的能力）為0.2mm，掃描電鏡的有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X。Scanningelectronmicroscope（SEM）工作原理：是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級(jí)電子由探測器收集，信號(hào)經(jīng)放大用來調(diào)制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。掃描電子顯微鏡原理人類紅細(xì)胞酵母酵母細(xì)胞原理：根據(jù)隧道效應(yīng)而設(shè)計(jì)，當(dāng)原子尺度的針尖在不到一個(gè)納米的高度上掃描樣品時(shí)，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV~2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強(qiáng)度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，將掃描過程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。分辨率：橫向?yàn)?.1~0.2nm，縱向可達(dá)0.001nm。用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進(jìn)行觀察。（三）掃描隧道顯微鏡scanningtunnelingmicroscope，STM掃描隧道顯微鏡原理第三節(jié)細(xì)胞組分的分析方法一、用超速離心技術(shù)分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物是分離細(xì)胞器（如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體）及各種大分子基本手段。轉(zhuǎn)速為10~25kr/min的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)。轉(zhuǎn)速>25kr/min，離心力>89kg者稱為超速離心機(jī)。目前超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)100000r/min，離心力超過500kg。?特點(diǎn)：–介質(zhì)密度均一

–速度由低向高，逐級(jí)離心?用途：分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。?沉降順序：核—線粒體—溶酶體與過氧化物酶體—內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體—核蛋白體。?可將細(xì)胞器初步分離，常需進(jìn)一步通過密度梯度離心再行分離純化。（一）差速離心DifferentialcentrifugationLowspeedHighspeedDifferentialcentrifugation用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離。類型：速度沉降、等密度沉降。常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求：

1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時(shí)，粘度不高；

2）PH中性或易調(diào)為中性；

3）濃度大時(shí)滲透壓不大；

4）對(duì)細(xì)胞無毒。（二）密度梯度離心Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation二、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色方法用于對(duì)某些細(xì)胞成分進(jìn)行定性和定位研究。1.物理固定：血膜空氣快速干燥、冷凍干燥。2.化學(xué)固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等試劑。顯示多糖常用乙醇固定，顯示酶類多用甲醛丙酮緩沖液固定。（一）固定（二）顯示方法1.金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應(yīng)產(chǎn)物最終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。2.Feulgen反應(yīng)：細(xì)胞中的醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示脫氧核糖核酸。3.聯(lián)苯胺反應(yīng)：過氧化酶分解H202。產(chǎn)生新生氧，后者將無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變成棕色化合物。4.

脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。四氧化鋨+不飽和脂肪酸黑色（證明脂肪滴的存在）5.

米倫反應(yīng)：用于蛋白質(zhì)檢測。氮汞試劑蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的酪氨酸殘基反應(yīng)，形成紅色沉淀。6.

PAS反應(yīng)：確定多糖的存在，其原理是利用希夫試劑與醛基之間的反應(yīng)，這時(shí)的醛基來自過碘酸氧化多糖的1,2-乙二醇基，使醛基釋放。免疫熒光法（immunofluorescenttechnique）：常用的螢光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。酶標(biāo)免疫法（enzyme-labeledantibodymethod）：常用的酶有辣根過氧化物酶，酶與底物發(fā)生反應(yīng)后形成不透明的沉積物，從而顯示出抗原存在的部位。三、免疫細(xì)胞化學(xué)immunocytochemistry根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，對(duì)抗原進(jìn)行定位測定的技術(shù)。常用的標(biāo)記物有熒光素和酶。四、顯微光譜分析技術(shù)細(xì)胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收曲線。可利用顯微分光光度計(jì)對(duì)某些成分進(jìn)行定位、定性和定量測定。五、放射自顯影術(shù)?原理：將放射性同位素標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時(shí)間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。?一般用14C和3H標(biāo)記。常用3H-TDR來顯示DNA，用3HUDR顯示RNA；用3H氨基酸研究蛋白質(zhì)，用3H甘露糖、3H巖藻糖研究多糖。

–14C半衰期為5730年，3H為12.5年。用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等六、分子雜交技術(shù)具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補(bǔ)關(guān)系。（一）原位雜交（insituhybridization）用于檢測染色體上的特殊DNA序列。最初是使用帶放射性的DNA探針，后來又發(fā)明了免疫探針法。原位雜交：用標(biāo)記的核酸探針通過分子雜交確定特殊的核苷酸序列在染色體上或在細(xì)胞中的位置的方法。（二）Southern雜交是體外分析特異DNA序列的方法，操作時(shí)先用限制性內(nèi)切酶將核DNA或線粒體DNA切成DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再用探針雜交，通過放射自顯影，即可辨認(rèn)出與探針互補(bǔ)的特殊核苷序列。將RNA轉(zhuǎn)移到薄膜上，用探針雜交，則稱為Northern雜交。七、流式細(xì)胞術(shù)用途：對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。原理：包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個(gè)細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，送入計(jì)算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)99%。包被細(xì)胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細(xì)胞計(jì)（flowcytometer）。應(yīng)用：1.分析細(xì)胞表面標(biāo)志2.分析細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)3.分析細(xì)胞受體4.分析腫瘤細(xì)胞的DNA、RNA含量5.分析免疫細(xì)胞的功能原理：在一定PH值下細(xì)胞表面帶有凈的正或負(fù)電荷，能在外加電場的作用下發(fā)生泳動(dòng)。各種細(xì)胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細(xì)胞荷電量有所不同，故在一定的電場中的泳動(dòng)速度不同。用途：活細(xì)胞分離，研究生命結(jié)構(gòu)的表面性質(zhì)，鑒定細(xì)胞或單細(xì)胞有機(jī)體的功能和病理狀態(tài)、檢測細(xì)胞生理狀態(tài)和病理狀態(tài)、分離不同種類的細(xì)胞，如分離哺乳動(dòng)物的XY精子。八、細(xì)胞電泳第三節(jié)

細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)第四節(jié)

細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)一、細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)是當(dāng)前細(xì)胞生物學(xué)乃至整個(gè)生命科學(xué)研究與生物工程中最基本的試驗(yàn)技術(shù)。植物細(xì)胞培養(yǎng)為植物育種開辟了一條嶄新的途徑動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)為疫苗生產(chǎn)、藥物研制與腫瘤防治等醫(yī)學(xué)實(shí)踐提供了全新的手段（一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)：組織塊，剪碎胰酶或膠原酶消化分散EDTA良好的營養(yǎng)液與無菌的培養(yǎng)環(huán)境（體溫、PH）+小牛血清有利于細(xì)胞的貼壁與分裂牛血清的分類

根據(jù)牛出生時(shí)間和血清采制分離方法分為：1.胎牛血清：八月齡胎牛心臟穿刺取血；2.新生牛血清：出生12-24小時(shí)新生牛靜脈采血；3.高級(jí)新生牛血清：采血后靜置自然析出的血清；標(biāo)準(zhǔn)新生牛血清：經(jīng)離心分離的血清；普通新生牛血清：融血或微融血的血清；

4.小牛血清：出生三月齡小牛動(dòng)脈采血分離血清；原代培養(yǎng)（primaryculture）：即培養(yǎng)直接來自動(dòng)物機(jī)體的細(xì)胞群;將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)培養(yǎng)瓶稱為傳代或傳代培養(yǎng)（Passage）。細(xì)胞株（cellstrain）：從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群。細(xì)胞系（cellline）：從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細(xì)胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，可無限繁殖。克隆（clone）：亦稱無性系。指由同一個(gè)祖先細(xì)胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。下表實(shí)驗(yàn)室中常用的幾種細(xì)胞細(xì)胞系名稱細(xì)胞類型來源3T3成纖維細(xì)胞小鼠HeLa宮頸癌上皮細(xì)胞HenriettaLacksBHK21成纖維細(xì)胞敘利亞倉鼠PtKl上皮細(xì)胞袋鼠L6成肌細(xì)胞大鼠PCI2嗜鉻細(xì)胞大鼠SP2漿細(xì)胞小鼠SP2／0骨髓瘤漿細(xì)小鼠CHO卵巢中國地鼠HenriettaLacks,Americanblack,diedofcancerofuterinecervixin1951群體培養(yǎng)克隆培養(yǎng)Hela細(xì)胞CHO細(xì)胞（二）植物細(xì)胞培養(yǎng)1.外植體培養(yǎng)：誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織。用于研究植物的生長發(fā)育、分化和變異；進(jìn)行無性繁殖；制取代謝產(chǎn)物。2.懸浮細(xì)胞培養(yǎng)：適合于進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，制取植物代謝產(chǎn)物。4.單倍體培養(yǎng)：通過花藥或花粉培養(yǎng)可獲得單倍體植株（DH群體）3.原生質(zhì)體培養(yǎng)：培養(yǎng)脫壁后的細(xì)胞，一般為體細(xì)胞（2n）特點(diǎn)：

–①比較容易攝取外來的遺傳物質(zhì)，如DNA；

–②便于進(jìn)行細(xì)胞融合，形成雜交細(xì)胞；

–③適宜條件下可產(chǎn)生細(xì)胞壁，經(jīng)誘導(dǎo)分化成完整植株。PlantCellCultureAnimalCellCulture二、細(xì)胞工程細(xì)胞工程是在細(xì)胞水平上的生物工程。1.細(xì)胞融合2.單克隆抗體技術(shù)3.細(xì)胞拆合與顯微操作技術(shù)1.細(xì)胞融合細(xì)胞融合（cellfusion）或細(xì)胞雜交：通過培養(yǎng)和介導(dǎo)，兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合并成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞的過程。同核體：相同基因型的細(xì)胞融合而成。異核體：不同基因型的細(xì)胞融合而成。自發(fā)融合：同種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中自發(fā)合并的現(xiàn)象。誘發(fā)融合：異種間的細(xì)胞必須經(jīng)誘導(dǎo)劑處理才能融合。誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法：生物方法（仙臺(tái)病毒、副流感病毒和新城雞瘟病毒）、化學(xué)方法（聚乙二醇,PEG）、物理方法（電擊和激光）。細(xì)胞融合（二）動(dòng)物細(xì)胞融合1.過程：（二）動(dòng)物細(xì)胞融合1.過程：滅活的病毒顆粒黏附于細(xì)胞表面細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞膜連接細(xì)胞融合，形成雜種細(xì)胞思考：1、什么叫動(dòng)物細(xì)胞融合？2、促進(jìn)細(xì)胞融合的方法有哪些?

3、細(xì)胞融合技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)是什么？4、植物體細(xì)胞雜交與動(dòng)物細(xì)胞融合有哪些異同？物理法化學(xué)法生物法

電場法(效率高、傷害小、易操作)（離心、振動(dòng)、電刺激）聚乙二醇（PEG）(一)動(dòng)物細(xì)胞融合（細(xì)胞雜交）總結(jié)：比較植物體細(xì)胞雜交和動(dòng)物細(xì)胞融合比較項(xiàng)目植物體細(xì)胞雜交動(dòng)物細(xì)胞融合原理融合前處理誘導(dǎo)方法用途細(xì)胞膜的流動(dòng)性、植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞膜的流動(dòng)性用纖維素酶、果膠酶去壁用胰蛋白酶使細(xì)胞分散物理、化學(xué)方法物理、化學(xué)、生物方法獲得部分或完整植株主要用于制備單克隆抗體2.單克隆抗體技術(shù)正常淋巴細(xì)胞（如小鼠脾細(xì)胞）具有分泌抗體的能力，但不能長期培養(yǎng)；瘤細(xì)胞（如骨髓瘤）可以在體外長期培養(yǎng)，但不分泌抗體。英國人Kohler和Milstein1975將兩種細(xì)胞雜交而創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù)，獲1984年的諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。既能分泌專一抗體、又具有無限增殖能力的細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)，得到由單細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而形成細(xì)胞群，即單克隆。單克隆細(xì)胞將合成一種決定簇的抗體，稱為單克隆抗體。定義：1、抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法該法制備抗體的特點(diǎn)：產(chǎn)量低、純度低，且抗體的特異性差、靈敏度低。輸入漿細(xì)胞動(dòng)物體內(nèi)

某抗體

某抗原思考與探究：如何獲得大量化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體？再從動(dòng)物血清中分離抗體一個(gè)B淋巴細(xì)胞——只分泌一種特異性抗體小鼠骨髓瘤細(xì)胞——能無限增殖雜交瘤細(xì)胞1975年英國科學(xué)家米爾斯坦和柯勒設(shè)想：1、為什么選用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合?小鼠骨髓瘤細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)條件下大量增殖，B淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生抗體，細(xì)胞的同源性越近，融合形成的雜種細(xì)胞越易成活。2、骨髓瘤細(xì)胞是癌細(xì)胞嗎?有無限增殖能力的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，具有轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細(xì)胞，稱為癌細(xì)胞，所以說，瘤細(xì)胞不能等于癌細(xì)胞。雜交細(xì)胞滅活的病毒等手段小鼠骨髓瘤細(xì)胞B淋巴細(xì)胞經(jīng)免疫的小鼠提取雜交瘤細(xì)胞第一次篩選用特定的選擇性培養(yǎng)基第二次篩選能產(chǎn)生特定抗體、培養(yǎng)條件下能無限增殖的雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔提取單克隆抗體例題1：1975年，英國劍橋大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的科勒和米爾斯坦，把小鼠的淋巴細(xì)胞（脾細(xì)胞）和小鼠的骨髓瘤細(xì)胞融合起來，成為雜交瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)在體外大量生產(chǎn)抗體的目的。實(shí)驗(yàn)過程如圖所示。(1)淋巴細(xì)胞能與骨髓瘤細(xì)胞融合成一個(gè)細(xì)胞，兩種細(xì)胞膜也能“融合”在一起，說明細(xì)胞膜

。(2)單克隆抗體的準(zhǔn)確定義應(yīng)為()A．一類特殊抗體B．無性繁殖系C．單一抗體細(xì)胞的無性繁殖第產(chǎn)生的抗體

D．單一抗體細(xì)胞的有性繁殖系產(chǎn)生的抗體(3)雜交瘤細(xì)胞繁殖進(jìn)行的是_______分裂，其遺傳性狀__________。(4)單克隆抗體注入體內(nèi)后可以自動(dòng)追蹤抗原(病原體或癌變細(xì)胞等)并與之結(jié)合，而絕不攻擊任何正常細(xì)胞，故稱為“生物導(dǎo)彈”這是利用了_____________

。具有一定的流動(dòng)性C有絲不變抗體能與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的特點(diǎn)

※知識(shí)拓展：如何進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的抗體檢測及克隆化培養(yǎng)？

融合后的細(xì)胞經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細(xì)胞就是雜交瘤細(xì)胞。但這些雜交瘤細(xì)胞并非都是能分泌所需抗體的細(xì)胞，通常用“有限稀釋法”來選擇。將雜交瘤細(xì)胞稀釋，用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超過一個(gè)，通過培養(yǎng)讓其增殖。然后檢測各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法），那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中的細(xì)胞還不能保證是來自單個(gè)細(xì)胞，挑選陽性孔的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋，一般需進(jìn)行3～4次，直至確信每個(gè)孔中增殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。該過程即為雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。單克隆抗體：特異性強(qiáng)、純度高、靈敏度高，產(chǎn)量大、容易標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。優(yōu)點(diǎn)：可以用不純的抗原分子制備純化的單克隆抗體。原則上可以做出抗細(xì)胞中任何蛋白質(zhì)的單克隆抗體，以此作為探針，確定核蛋白在細(xì)胞中的位置或用于純化該種蛋白。3、單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)4、單克隆抗體的應(yīng)用１、可用于作為診斷試劑：有準(zhǔn)確，高效，簡易、快速的優(yōu)點(diǎn)２、可用于疾病治療３、可用于運(yùn)載藥物（作為運(yùn)載對(duì)應(yīng)疾病的藥物的“生物導(dǎo)彈”。）“生物導(dǎo)彈”＝單克隆抗體＋藥物總結(jié)一種誘導(dǎo)細(xì)胞融合的新方法一種新細(xì)胞滅活病毒雜交瘤細(xì)胞一個(gè)優(yōu)勢單克隆抗體特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢[例題2]（1）在用動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)制備單克隆抗體時(shí)，將抗原注射到小鼠體內(nèi)，可獲得(多選)

（

）A．T淋巴細(xì)胞B．效應(yīng)B淋巴細(xì)胞

C．抗體D．記憶細(xì)胞（2）下列關(guān)于單克隆抗體的制備和應(yīng)用的敘述中，正確的是(多選