生產中常用菌種的分離、選育和保藏

主講人：韓北忠劉萍帶圖象分析系統的微生物菌種

顯微觀察裝置

第一節菌種的分離簡介

一、菌種的來源根據資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。二、分離思路

新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準確地把所需要的菌種挑選出來。實驗室或生產用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進行分離純化。有了優良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進的設備與之配合。定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養特性。采樣：有針對性地采集樣品。增殖：人為地通過控制養分或培條件，使所需菌種增殖培養后，在數量上占優勢。分離：利用分離技術得到純種。發酵性能測定：進行生產性能測定。這些特性包括形態、培養特征、營養要求、生理生化特性、發酵周期、產品品種和產量、耐受最高溫度、生長和發酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。三、新種分離與篩選的步驟（一）采樣1、采樣對象以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細菌和放線菌為主，富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區和果園內。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。從自然界篩選2、采樣季節：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。3、采土方式：在選好適當地點后，用小薩子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標記，記錄采樣時間、地點、環境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時分離。（二）增殖培養為了容易分離到所需的菌種，讓無關的微生物至少是在數量上不要增加，可以通過配制選擇性培養基，選擇一定的培養條件來控制。例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對下階段的純種分離就會順利得多。（三）培養分離

盡管通過增殖培養效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長狀態。因此還必須分離，純化。在這—步，增殖培養的選擇性控制條件還應進一步應用，而且控制得細一點，好一點。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分離法。（四）篩選選這一步是采采用與生產產相近的培培養基和培培養條件，，通過三角角瓶的容量量進行小型型發酵試驗驗，以求得得適合于工工業生產用用菌種。（五）毒性性試驗自然界的一一些微生物物是在一定定條件下產產毒的，將將其作為生生產菌種應應當十分當當心，尤其其與食品工工業有關的的菌種，更更應慎重。。據有的國國家規定，，微生物中中除啤酒酵酵母、脆壁壁酵母、黑黑曲霉、米米曲霉和枯枯草桿菌作作為食用無無須作毒性性試驗外，，其他微生生物作為食食用，均需需通過兩年年以上的毒毒性試驗。。第二節培培養分離離從自然界中中分離培養養微生物是是菌種選育育的重要和和基礎的步步驟。到目前為止止，還沒有有一種分離離培養方法法能揭示一一個試樣中中所包含的的所有微生生物總數和和種類。在任一試樣樣中所存在在的微生物物僅為極少少數特定種種類的菌株株；在工業業微生物篩篩選過程中中，應及時時調整檢測測方法，以以與各種不不同類型的的生長和代代謝之微生生物相適應應。因此，建立立一更為科科學的和針針對性不強強的分離方方法是必要要的。一、成功的的分離培養養方法(1)認真真考它所需需產品的特特征和生產產過程；(2)制訂訂初步的篩篩選標準；；(3)將生生態學方法法運用到分分離和篩選選過程。二、培養分分離中要解解決的問題題1、“分離離什么和從從哪里分離離出?”2、必須充充分考慮所所分離微生生物的生產產能力、生生長速度、、生物群體體培養和產產品生產工工藝及其提提純的難易易和費用，，工業生產產發酵罐中中穩定性及及遺傳操作作的難易程程度等。3、選擇適適宜的培養養分離方法法和檢測方方法。三、將生態態學方法用用于培養分分離的一般般思路要點點1．羅列出出所要分離離的微生物物類群；2．根據所所采集樣本本的各種生生態參數，，描述所要要分離的微微生物之生生態系統或或棲息地：：3．將若干干樣本分成成若干類型型，如植物物和植物各各部，土壤壤(類型和和土層)、、巖石、水水、昆蟲和和發酵食品品等；4．羅列出出所要考察察和測量的的環境參數數，如pH、鹽分、、水分、氧氧化還原電電勢及溫度度等；5．列出生生物系統中中有用的自自然底物，，如森林土土壤中的幾幾丁質、葡葡萄表皮的的果膠；6．根據上上述1-5項中所獲獲得的數據據，設計分分離方法，，即選擇適適宜的稀釋釋液、底物物、試樣、、天然浸出出汁和培養養條件；7．用標準準方法作對對照來評價價生態學分分離方法；；8．根據待待檢材料的的生態參數數需要，修修改已知的的方法；9．運用特特定的富集集方法，富富集那些可可能具有篩篩選意義的的微生物類類群。四、自然界界中細菌的的分離(一)采樣樣和采集方方法為了從一特特定生態系系統中分離離出具有代代表性的細細菌菌群，，特別是分分離那些在在唯一微環環境區域中中出現的菌菌群時，必必須十分重重視樣本的的采集。樣本采集時時所需的工工具通常有有無菌刮鏟鏟、土樣采采集器、鑷鑷子、解剖剖刀、手套套、無菌小小塑料袋和和塑料瓶等等。采樣的注意意事項1、采樣時時應盡可能能保持相對對無菌；2、所采集集的樣本必必須具有某某種代表性性；3、采好的的樣必須完完整地標上上樣本的種種類及采集集日期、地地點以及采采集地點的的地理、生生態參數等等；4、應充分分考慮采樣樣的季節性性和時間因因素，因為為真正的原原地菌群的的出現可能能是短暫的的；5、采好的的樣應及時時處理，暫暫不能處理理的也應貯貯存于4℃℃下，但貯貯存時間不不宜過長。。這是因為為一旦采樣樣結束，試試樣中的微微生物群體體就脫離了了原來的生生態環境，，其內部生生態環境就就會發生變變化，微生生物群體之之間就會出出現消長1．土樣采采集方法森林、旱地地，草地可可先掘洞，，由土壤下下層向上層層順序采集集；水田等浸水水土壤在不不損土層結結構的情況況下插入圓圓筒采集。。如果層次次要求不嚴嚴格，可取取離地面5～15cm處的土土。將采集集到的土樣樣盛入聚乙乙烯袋或玻玻璃瓶中。。在采集植物物根際土樣樣時，一般般方法是自自土壤中慢慢慢拔出植植物根，在在大量無菌菌水中浸漬漬約20min，洗洗去粘附在在根上的土土壤，然后后再用無菌菌水漂洗下下根部殘留留的土，這這部分上卻卻為根際土土樣。2．植物體體采集方法法在采集葉面面時，一般般是用滅菌菌的剪刀、、打孔器、、安全刀片片等，由幾幾片新鮮葉葉片的同一一部位切取取一小塊，，并注意不不要損傷周周圍邊緣。。選擇葉面時時應考慮葉葉位、葉齡齡、葉片正正反面和在在一片葉上上的取樣部部位。采集植物根根及根系時時，方法與與根際土樣樣采集方法法相似。將將洗凈的根根裝入采樣樣袋中，采采集根系時時，一般與與根際土樣樣一起保存存。3．水樣采采集方法用于細菌檢檢測的水樣樣應收集于于100m1干凈、、滅菌的廣廣口塑料瓶瓶中。由于表層水水中含有泥泥沙，故在在采樣時應應在較深的的靜水層中中采集水樣樣。方法是：握握住采樣瓶瓶底浸入水水中30-50cm處，然后后瓶口朝下下打開瓶蓋蓋，讓水樣樣進入。如如果有急流流存在的話話，應直接接將瓶口反反向于急流流。采集瓶瓶從水中取取出時應迅迅速并帶有有較大的弧弧度。水樣樣不應裝滿滿采樣瓶。。所有水樣樣都應在24h之內內迅速進行行檢測，或或者4℃下下貯存。(二)生態學參數數及培養基基

的組成成原則1、加入培培養基中的的天然提取取物種類和和用量、環環境生物物物理學參數數以及用于于平板涂布布分離樣本本的溶劑都都會影響實實驗中所要要分離的細細菌的數量量和種類。。2、就分離離培養基的的組成而言言，部分培培養基中必必須含有10-50%的天然然提取物。。加入培養養基中的天天然提取物物，部分培培養基中則則應含有多多種碳、氮氮源，如幾幾丁質、纖纖維素或果果膠。3、所有分分離培養基基中都應含含有抗真菌菌劑(如放放線菌酮和和制霉素)，摻加濃濃度一般為為50μg／m1，，以抑抑制真菌的的生長。4、瓊脂平平板在使用用前應置于于37℃培培養箱中孵孵育l、2天。5、培養基基的生物物物理學參數數，如pH及鹽分也也應調節到到與試樣的的生態系統統參數值相相近。土中細菌的的富集培養養與分離分離土樣中中的大部分分細菌的分分離程序中中無需進行行富集。但對某些少少數細菌則則要求特殊殊的富集或或選擇技術術才能很好好地被分離離培養。富集方法運用細菌的的酶誘導性性，在分離離培養基中中添加若干干抗生素、、復雜底物物及生長因因子的前體體物質來激激活細菌某某一特殊基基因組，可可以建立起起若干富集集技術。富集可以促促進抗性的的產生并維維持下來。。土樣中細菌菌的富集：：適度稀釋釋后，取0.1m1涂布已添添加及未添添加富集底底物(如幾幾丁質、纖纖維素等)的土浸出出汁平板。。植物體上細細菌的分離離：無菌富富集，加植植物浸出液液適度培養養取樣，洗洗滌，取1ml經適適度稀釋后后涂布平板板。水中細菌的的分離：水水樣通過0.22μμm無菌濾濾膜，取出出濾膜用1ml無菌菌稀釋液將將濾膜上的的沉積洗下下。用樣本本稀釋液適適度稀釋,涂布平板板倒置培養養或濾紙壓壓印分離法法。水中細菌分分離的簡易易富集技術術在無菌的、、用棉團塞塞好的廣口口三角燒瓶瓶中連續培培養，定期期取樣涂布布適宜分離離瓊脂平板板上；在不同水體體的水樣中中加入一定定的底物如如蔗糖、多多糖及蛋白白質等，同同樣可以促促進水中微微生物的增增殖。培養過程中中可加入低低濃度的抗抗真菌劑以以抑制真菌菌的生長。。另一富集方方法是在培培養燒瓶中中添加細菌菌“附著材材料”，如如無菌的植植物組織或或土壤浸出出液。通過改變培培養溫度和和培養周期期可選擇性性富集嗜冷冷性細菌、、中溫菌和和嗜高溫菌菌。次代培養及及純化步驟驟1、涂布的的平板經培培養后，如如生長出菌菌落，則按按涂布不同同稀釋度的的稀釋液所所得的單菌菌菌落和多多菌菌落對對瓊脂平板板進行分類類。2、、用用無無菌菌牙牙簽簽將將菌菌落落轉轉接接到到篩篩選選平平板板上上及及轉轉接接至至添添加加有有少少量量天天然然浸浸出出液液的的適適宜宜保保藏藏瓊瓊脂脂斜斜面面上上。。3、、篩篩選選平平板板經經培培養養后后，，按按生生長長出出菌菌落落的的形形態態學學特特征征如如色色素素、、菌菌落落形形態態等等進進行行最最初初分分組組。。4、、將將認認為為有有希希望望的的菌菌落落用用牙牙簽簽轉轉接接到到另另一一模模擬擬分分離離瓊瓊脂脂平平板板上上進進行行篩篩選選。。五、、放放線線菌菌的的分分離離(一一)采采樣樣及及采采集集方方法法應盡盡可可能能實實行行無無菌菌操操作作。。所采采集集的的樣樣本本應應具具有有一一定定的的代代表表性性。。樣本本采采集集完完后后，，應應及及時時處處理理或或在在4℃℃下下貯貯存存，，貯貯存存試試樣樣處處應應與與劃劃線線，，篩篩選選平平板板分分開開，，貯貯存存時時間間不不宜宜過過長長。。(二二)生生態態學學參參數數放線線菌菌分分離離培培養養過過程程中中所所需需考考慮慮的的生生態態參參數數有有溫溫度度、、pH、、離離子子強強度度、、氧氧化化還還原原電電勢勢和和底底物物濃濃度度。。（三三））培培養養基基的的組組成成原原則則大多多數數放放線線菌菌的的分分離離培培養養是是在在貧貧脊脊或或復復雜雜底底物物的的瓊瓊脂脂平平板板上上進進行行的的。。除除嗜嗜溫溫性性放放線線菌菌外外，，其其他他放放線線菌菌一一般般在在培培養養4-20天天內內在在分分離離平平板板上上緩緩慢慢形形成成菌菌落落。。在放放線線菌菌分分離離瓊瓊脂脂中中通通常常都都加加入入抗抗真真菌菌劑劑制制霉霉菌菌素素或或放放線線菌菌酮酮，，以以抑抑制制真真菌菌的的繁繁殖殖。。選擇擇性性地地添添加加抗抗生生素素。。分離離瓊瓊脂脂平平板板制制備備好好后后，，一一般般皆皆應應在在37℃℃培培養養箱箱中中存存放放3天天。。放線線菌菌的的分分離離土樣樣中中放放線線菌菌的的非非選選擇擇性性分分離離：：土土樣樣風風干干，，磨磨碎碎，，無無菌菌海海綿綿壓壓印印土土樣樣后后壓壓印印平平板板后后培培養養。。植物物體體上上放放線線菌菌的的分分離離：：無無菌菌取取植植物物組組織織，，干干燥燥以以減減少少細細菌菌數數量量，，剪剪碎碎植植物物材材料料后后植植入入平平板板表表層層后后培培養養。。也也可可洗洗下下微微生生物物后后振振蕩蕩培培養養。。水中中放放線線菌菌的的分分離離：：為為使使所所要要分分離離的的放放線線菌菌的的數數量量種種類類增增多多，，一一般般將將水水樣樣離離心心或或濾濾紙紙過過濾濾，，取取離離心心沉沉積積或或濾濾紙紙表表面面沉沉積積進進行行系系列列稀稀釋釋和和涂涂布布。。次代代培培養養及及純純化化菌落落形形成成后后可可根根據據肉肉眼眼可可見見的的菌菌落落形形態態上上的的差差異異，，作作初初步步的的鑒鑒定定和和區區分分。。通過過高高倍倍放放大大進進行行鏡鏡檢檢，，可可了了解解氣氣生生和和營營養養孢孢子子形形成成情情況況。。成功功地地分分離離出出各各種種不不同同的的放放線線菌菌屬屬及及種種的的關關鍵鍵是是所所采采集集樣樣本本的的本本身身及及其其分分離離用用的的瓊瓊脂脂培培養養基基；；而而肉肉眼眼識識別別不不同同的的生生長長形形態態、、從從而而初初步步地地加加以以鑒鑒定定，，在在分分離離放放線線菌菌時時顯顯得得尤尤為為重重要要。。將分離平板上上所形成的菌菌落用經火焰焰灼燒滅菌的的鉤形針或無無菌牙簽挑取取，點接到瓊瓊脂平板上進進行影印培養養，以進一步步篩選和分離離。六、真菌分離1、利用低碳碳／氮比的培培養基可使真真菌生長菌落落分散，利于于計數，分離離和鑒定。這這里主要是利利用營養成分分的減少而使使生長減慢，，并由此限制制真菌的遷涉涉生長。2、改變培養養溫度將有利利于不同嗜溫溫區真菌的分分離。3、有時，真真菌子實體形形成必須有光光線，這在分分離培養時應應加以考慮。。4、選擇性富富集：是通過過一定的方式式使樣本中一一種或一群微微生物數量上上的增加而利利于分離的一一種技術。富集可以是種種水平的，如如通過營養要要求的改變來來富集分離鐮鐮刀菌；也可可以是組成群群水平的，如如以纖維素為為唯一碳源的的選擇性培養養基可選擇性性富集所有能能降解纖維素素的纖維素裂裂解微生物。。5、選擇性抑抑制培養基可可使非目標微微生物消除或或減少到一定定程度。在分分離培養基中中加入一定的的抗生素即可可有效地抑制制細菌生長及及菌落形成。。真菌的分離方方法土中真菌的分分離：稀釋法法，混入法，，壓貼法，粘粘附法，浮選選法，注射器器采集法，土土過篩法，庶庶糖密度梯度度離心法。植物材料中真真菌的分離：：植入法，壓壓貼法，洗滌滌法，浸泡法法。水中真菌的分分離：水樣稀稀釋后涂布分分離。餌誘技技術常用于水水中真菌的富富集。子實體直接分分離培養擔子子菌：新采集集的子實體組組織植入平板板內或在放于于液體培養基基表面放一小小塊無菌濾紙紙上培養。七、生產選種種是在長年累月月的生產實踐踐中，在培養養工藝條件沒沒有任何可見見變更情況下下，突然發現現某些批次生生產水平提高高較大，這就就有可能是個個別自然變異異朝更好的方方向變的細胞胞，在這種條條件下很適應應于培養條件件，并逐漸顯顯示出它的生生長優勢，這這種優勢的發發展，促使它它優良的生產產性能表露。。進行類似新新種篩選分離離，達到獲得得新的優良生生產菌種的目目的。第三節工工業菌種的育育種方針工業菌種的育育種：是運用遺傳學學原理和技術術對某個用于于特定生物技技術目的的菌菌株進行的多多方位的改造造。通過改造造，可使現存存的優良性狀狀強化，或去去除不良性質質或增加新的的性狀。工業菌種育種種的方法誘變基因轉移基因重組育種過程包括下列3個個步驟：(1)在不影影響菌種活力力的前提下，，有益基因型型的引入。(2)希望基基因型的選出出。(3)改良菌菌種的評價(包括實驗規規模和工業生生產規模)。。選擇育種方法法時綜合考慮慮的因素(1)待改良良性狀的本質質及與發酵工工藝的關系(如批式或連連續發酵試驗驗)；(2)對這一一特定菌種的的遺傳和生物物化學萬面認認識的明了程程度；(3)經濟費費用。如果對特定菌菌種的基本性性狀及其工藝藝知曉甚少，，則多半采用用隨機誘變、、篩選及選育育等技術：如果對其遺傳傳及生物化學學方面的性狀狀已有較深的的認識，則可可選擇基因重重組等手段進進行定向育種種。工業菌種改良良方法(1)解除或或繞過代謝途途徑中的限速速步驟：通過過增加特定基基因的拷貝數數或增加相應應基因的表達達能力來提高高限速酶的含含量；在代謝謝裔途徑中引引伸出新的代代謝步驟，由由此提供一個個旁路代謝途途徑。(2)增加加前體體物的的濃度度。(3)改變變代謝謝途徑徑，減減少無無用副副產品品的生生成以以及提提高菌菌種對對高濃濃度的的有潛潛在毒毒性的的底物物、前前體或或產品品的耐耐受力力。(4)抑制制或消消除產產品分分解酶酶。(5)改進進菌種種外泌泌產品品的能能力。。(6)消除除代謝謝產品品的反反饋抑抑制。。如誘誘導代代謝產產品的的結構構類似似物抗抗性。。提高特特定基基因的的表達達水平平(1)引入入強轉轉錄及及翻譯譯信號號，可可通過過在一一高效效表達達載體體上克克隆靶靶基因因；在在靶基基因的的上游游引入入強啟啟動子子；修修改現現有表表達信信號，，提高高基因因效力力等。。(2)誘導導解除除基因因表達達抑制制的突突變。。改進菌菌種的的生長長效率率提高菌菌株對對底物物的利利用率率方法法：a.通通過確確定并并改變變代謝謝中的的耗能能部分分;b.由由另另一菌菌株的的高效效低能能代謝謝途徑徑代謝謝來實實現。。c.賦賦予予菌種種對多多種底底物，，特別別是價價廉而而豐富富的底底物的的利用用能力力，由由此可可降低低操作作費用用。第四節節誘誘變變育種種以微生生物的的自然然變異異作為為基礎礎的生生產選選種的的機率率并不不很高高，一一個基基因的的自然然突變變頻率率僅10-6-10-10左左右。。誘變育育種：：以誘誘發突突變為為基礎礎的育育種，，是迄迄今為為止國國內外外提高高菌種種產量量、性性能的的主要要手段段。誘變物理、、化學學或生生物誘誘變方方法一、誘誘變劑劑和誘誘變處處理物理誘誘變劑劑：射射線如如紫外外線、、X——射線線、γγ—射射線，，快中中子；；物理因因素中中目前前使用用得最最方便便而且且十分分有效效的是是紫外外線。。許多多高產產菌株株的選選育都都用過過紫外外線，，對于于一般般實驗驗室、、中小小型工工廠都都適用用，也也很安安全。。其他的的幾種種射線線都是是電離離性質質的，，有一一定的的穿透透力，，一般般都由由專業業人員員在專專門的的設備備中使使用，，否則則有一一定危危險性性。化學誘誘變劑劑：化學因因子如如堿基基類似似物、、5——氟尿尿嘧啶啶、烷烷化劑劑等。。化學誘誘變劑劑中使使用最最多、、最有有效的的是烷烷化劑劑。使用化化學誘誘變劑劑的優優缺點點：1、大大多數數情況況下，，就突突變數數量而而言，，要比比電離離輻射射更有有效。。2、化化學誘誘變劑劑是很很經濟濟的，，因為為只需需要少少量的的合適適的誘誘變劑劑，設設備是是實驗驗室的的一般般玻璃璃器皿皿，一一個蒸蒸氣罩罩。而而用電電離輻輻射±±行工工作時時，設設備費費用大大，并并要注注意安安全性性。3、大大部分分誘變變劑是是致癌癌劑，，所以以在使使用中中必須須非常常謹慎慎，要要避免免化學學誘變變劑與與皮膚膚接觸觸，，，且切切勿吸吸入其其蒸氣氣，有有人對對某些些誘變變劑極極其敏敏感，，甚至至未直直接接接觸就就會過過敏，，這就就更要要當心心。誘變劑劑的選選擇1．堿堿基類類似物物和羥羥胺具具有很很高的的特異異性，，但很很少使使用，，回復復突變變率高高，效效果不不大。。2．亞亞硝酸酸和烷烷化劑劑應用用的范范圍較較廣，，造成成的遺遺傳損損傷較較多。。其中中亞硝硝基胍胍和甲甲基磺磺酸乙乙酯常常被稱稱為““超誘誘變劑劑”，，甲基基磺酸酸乙酯酯是毒毒性最最小的的誘變變劑之之一。。3．吖吖啶類類誘變變劑可可以造造成生生化代代謝途途徑的的完全全中斷斷。4．紫紫外線線仍十十分有有效。。電離離輻射射是造造成染染色體體巨大大損傷傷的最最好誘誘變劑劑，它它能造造成不不可回回復的的缺突突變。。但它它可能能影響響鄰近近基因因的性性能。。二、誘誘變育育種步步驟出發菌菌株的的選擇擇處理菌菌懸液液的制制備誘變處處理中間培培養分離和和篩選選(一)出發發菌株株的選選擇1．自自然界界新分分離的的野生生型菌菌株，，對誘誘變處處理較較敏感感，容容易達達到好好的效效果。。2．在在生產產中經經生產產選種種得到到的菌菌株與與野生生型較較相像像，也也是良良好的的出發發菌株株。3．每每次誘誘變處處理都都有一一定提提高的的菌株株，往往往多多次誘誘變能能積累累較多多的提提高。。4．出出發菌菌株開開始時時可以以同時時選2～3株，，在處處理比比較后后，將將更適適合的的出發發菌株株留作作繼續續誘變變。5．要要盡量量選擇擇單倍倍體細細胞、、單核核或核核少的的多細細胞體體來作作出發發誘變變細胞胞，這這是由由于變變異性性狀大大部分分是隱隱性的的，特特別是是高產產基因因。6．根根據采采用的的誘變變劑或或根據據細胞胞生理理狀態態或誘誘變譜譜選擇擇誘變變劑，，因為為同一一誘變變劑的的重復復處理理會使使細胞胞產生生抗性性，使使誘變變效果果下降降。有有的誘誘變劑劑是作作用于于營養養細胞胞，就就要選選對數數期的的細胞胞：有有的作作用于于休止止期，，就可可選用用孢子子。(二)處理理菌懸液的的制備這一步驟的的關鍵是制制備單細胞胞和單孢子子狀態的、、活力類似似的菌懸液液，為此要要進行合適適培養基的的培養，并并要離心，，洗滌，過過濾。(三)誘變變處理根據前面有有關誘變劑劑及誘變處處理的介紹紹，結合誘誘變對象的的實際，設設計誘變處處理方案。。(四)中間間培養由于在發生生了突變尚尚未表現出出來之前，，有一個表表現延遲的的過程，即即細胞內原原有酶量的的稀釋過程程(生理延延遲)，需需3代以上上的繁殖才才能將突變變性狀表現現出來。這這個過程對對今后的篩篩選和獲得得穩定菌株株都是極為為重要的。。方法：讓變異處理理后細胞在在液體培養養基中培養養幾小時，，以讓細胞胞的遺傳物物質復制，，讓細胞繁繁殖幾代，，以得到純純的變異細細胞。這樣樣，隱性的的變異就會會顯現出來來，若不經經液體培養養基的中間間培養，直直接在平皿皿上分離就就會出現變變異和不變變異細胞同同時存在于于一個菌落落內的可能能，形成混混雜菌落，，以致造成成篩選結果果的不穩定定和將來的的菌株退化化。(五)分離離和篩選篩選分初篩篩和復篩。。初篩以迅迅速篩出大大量的達到到初步要求求的分離菌菌落為目的的，以量為為主。復篩則是精精選，以質質為主，也也就是以精精確度為主主。因此在在具體方法法上就有差差異.例如初篩可可以在平皿皿上直接以以菌落的代代謝產物與與某些染料料或基質的的作用形成成的變色圈圈或透明圈圈的大小來來挑取參加加復篩者，，而將90%的菌落落淘汰。在在數量減少少后就要仔仔細比較參參加復篩和和再復篩的的菌株，最最后才能選選得優秀菌菌株。在以以后的復篩篩階段，還還應不斷結結合自然分分離，純化化菌株。紫外線的誘誘變育種紫外線誘變變一般采用用15W紫紫外線殺菌菌燈，波長長為2537A．燈燈與處理物物的距離為為15～30cm，，照射時間間依菌種而而異，一般般為幾秒至至幾十分鐘鐘。一般我我們常以細細胞的死亡亡率表示，，希望照射射的劑量死死亡率控制制在70～～80%為為宜。被照射的菌菌懸液細胞胞數，細菌菌為106個／ml左右，霉霉菌孢子和和酵母細胞胞為106～107個／ml。由于紫紫外線穿透透力不強，，要求照射射液不要太太深，約0.5～1.0cm厚，同時時要用電磁磁攪拌器或或手工進行行攪拌，使使照射均勻勻。由于紫外線線照射后有有光復活效效應，所以以照射時和和照射后的的處理應在在紅燈下進進行。(二)操作作步驟1．將細菌菌培養液以以3000r／min離心5min，，傾去上清清液，將菌菌體打散加加入無菌生生理鹽水再再離心洗滌滌。2．將菌懸懸液放入一一巳滅菌的的，裝有玻玻璃珠的三三角瓶內用用手搖動，，以打散菌菌體。將菌菌液倒入有有定性濾紙紙的漏斗內內過濾，單單細胞濾液液裝入試管管內，一般般處于渾濁濁態的細胞胞液含細胞胞數可達108個／／ml左右右，作為待待處理菌懸懸液。3．取2～～4m1制制備的菌液液加到直徑徑9cm培培養皿內，，放入一無無菌磁力攪攪拌子，然然后置磁力力攪拌器上上、15W紫外線下下30cm處。在正正式照射前前，應先開開紫外線10min，讓紫外外燈預熱，，然后開啟啟皿蓋正式式在攪拌下下照射10～50s。操作均均應在紅燈燈下進行，，或用黑紙紙包住，避避免白熾光光。4．取未照照射的制備備菌液和照照射菌液各各o.5ml進行稀稀釋分離，，計數活菌菌細胞數。。5．取照射射菌液2ml于液體體培養基中中(300ml三角角瓶內裝30ml培培養液)，，120r／min振蕩培養養4～6h。6．取中間間培養液稀稀釋分離、、培養。7．挑取菌菌落進行篩篩選。亞硝基胍誘誘變曲霉菌菌N—甲基——N'-硝硝基-N-亞硝基胍胍(NGN，MNNG或TG)對真核核或原核微微生物都有有強烈的誘誘變作用。。其精確的的作用機制制尚不很清清楚，據認認為是伴隨隨著重氮甲甲烷的生成成及在酸性性條件下生生成亞硝酸酸，直接作作用于細胞胞內的DNA復制系系統，從而而誘發了變變異。MNNG的誘誘變作用隨隨pH的升升高而增強強。(二)操作作步驟1．單孢子子懸液制備備取斜斜面，加入入6ml0.1mol／LpH6.o的磷磷酸緩沖液液，用接種種環刮下孢孢子，振蕩蕩試管，立立即通過帶帶濾紙漏斗斗過濾，由由此制得單單孢子懸液液，若孢子子液渾濁狀狀，其孢子子濃度可達達l06個個／ml，，此為待處處理孢子懸懸液。2．MNNG溶液的的制備用用分析天天平稱取2mg，加加入2ml0.1mol／／LpH6.0磷酸緩沖沖液，于暗暗處振蕩溶溶解。3．誘變處處理吸吸取MNNG溶液lml，加加入到1m1孢子懸懸液中，30℃振蕩蕩30min，立即即稀釋1000倍停停止作用，，然后以10-2，，10-4兩個稀釋釋度分離培培養，30℃3天天后計數。。4．死亡率率計算將將未處理理的孢子液液1ml加加入1ml磷酸緩沖沖液中，同同上逐級稀稀釋分離，，30℃下培養養3天。根根據處理前前后的活孢孢子數可計計算出死亡亡率。5．挑取菌菌落進行糖糖化酶及蛋蛋白酶產量量篩選．第五節營營養缺陷陷型的選育育營養缺陷型型是指通過過誘變而產產生的缺乏乏合成某些些營養物質質如氨基酸酸、維生素素和堿基等等的能力，，必須在其其基本培養養基中加入入相應的營營養成分才才能正常生生長的變異異株。與營養缺陷陷型對應的的是野生型型。能滿足野生生型菌株正正常生長的的培養基稱稱基本培養養基(MM)；在基本培養養基中加入入相應的營營養成分的的稱補充培培養基(SM)；能滿足各種種營養缺陷陷型生長的的稱完全培培養基(CM)，如如牛肉膏蛋蛋白胨培養養基、麥芽芽汁培養基基等。營養缺陷型型的用途營養缺陷型型在生產上上和科學研研究上用途途很大。目目前生產氨氨基酸、核核苷酸的菌菌種都是各各種類型的的缺陷型。。要研究代代謝途徑，，育種技術術都必須有有營養缺陷陷型的菌株株為材料。。篩選營養缺缺陷型的步步驟誘變淘汰野生型型檢出缺陷型型確定生長譜譜一、誘變方方法物理誘變化學誘變二、淘汰野野生型抗生素法：：野生型能能在MM中中生長，而而缺陷型不不能，于是是將誘變處處理液在MM中培養養短時讓野野生型生長長，處于活活化階段，，而缺陷型型無法生長長，仍處于于休眠狀態態。由于細細菌或酵母母對一些抗抗生素敏感感，于是就就相應加入入一定量的的抗生素，，結果活化化狀態的野野生型就被被殺死，保保存了缺陷陷型。一般般細菌可以以采用青霉霉素，酵母母可采用制制霉菌素。。菌絲過濾法法：對于霉霉菌，因孢孢子生長后后會長出菌菌絲體，就就可用濾紙紙過濾法將將菌絲濾去去，而缺陷陷型孢子卻卻因未發芽芽而不能濾濾過。三、檢出缺缺陷型原理：在固固體基本培培養基和完完全培養基基上，生長長情況完全全不同，缺缺陷型在CM上生長長良好，而而在MM上上則不生長長，野生型型都能生長長。具體方法：：影印法、、點種法、、夾層法1．將一較較平皿直徑徑小1cm的金屬圓圓筒蒙上一一層滅菌的的絲絨，用用金屬夾夾夾住，滅菌菌。2．將完全全培養基上上長出的全全部菌落在在絲絨上輕輕輕一壓，，使之成為為印模，標標記方位。。3．將基本本培養基平平皿和完全全培養基平平皿在標記記的同一方方位上先后后輕輕一壓壓，此菌印印模即復印印于上。(一)影印印法4．將CM和MM在恒溫箱箱中培養。。5．二平皿皿相同方位位進行比較較，即即可發現在在MM平皿皿上長出的的菌落少于于GM平板板上的。MM上未長長而相應于于CM上長長出的那幾幾個菌落就就可能是缺缺陷型。此法要求平皿皿上菌落不能能太多，菌落落之間應有一一定間隔。(二)點種法法也就是任意法法。用接種針或牙牙簽將CM上上長出的菌落落在MM和CM兩副平板板上接種，依依次在相應位位置點種，然然后一起培養養，觀察其生生長情況。此法結果明確確，但工作量量大。(三)夾層法法先在培養皿上上倒一層基本本瓊脂培養基基，凝固后涂涂上一層含菌菌的MM，凝凝固后再倒一一薄層MM瓊瓊脂培養基，，培養24h，將出現的的菌落標記，，然后倒上一一層CM瓊脂脂培養基，再再培養。這時時第二批長出出的菌落就可可能是缺陷型型。此法缺點是，，結果有時不不明確，而且且將缺陷型菌菌落從夾層中中挑出并不很很容易。四、營養缺陷陷型生長譜的的確定驗證確定是缺缺陷型后，就就需確定其缺缺陷的因子，，即生長譜測測定。生長譜測定的的方法將缺陷型菌株株培養后，收收集菌體，制制備成細胞懸懸液，與MM培養基(融融化并涼至50℃)混合合并傾注平皿皿。待凝固后后，分別在平平皿的5～6個區間放上上不同的營養養組合的混合合物或吸飽此此組合營養物物的濾紙圓片片。培養后會會在某組合區區長出，就可可測得所需營營養。—個平平皿測一個菌菌。以不同組合的的營養混合物物與融化涼至至50℃的MM培養基混混合鋪成平皿皿，然后在這這些平皿上劃劃線接種各個個缺陷型菌株株于各相應位位置，培養后后根據在這些些組合長出可可推知其營養養因子。在5～6個平皿皿上可測20株菌以上。。第六節基基因育種基因重組育種種：是運用體體外DNA各各種操作或修修改手法獲得得目的基因，，再借助于病病毒、細菌質質粒或其他載載體，將目的的基因轉移至至新的宿主細細胞并使其在在新的宿主細細胞系統內進進行復制和表表達，或者通通過細胞間的的相互作用，，使一個細胞胞的優秀性狀狀經其間遺傳傳物質的交換換而轉移給另另—個細胞的的方法。一個完整的基基因克隆過程程包括以下步步驟１、獲得待克克隆的DNA片段（基因因）；２、目的基因因與載體在體體外連接；３、重組DNA分子導入入宿主細胞；；４、篩選、鑒鑒定陽性重組組子；５、重組子的的擴增與／或或表達。2.2基因重組一、質粒的特特點1、質粒的存存在并非微生生物生命活動動必需。2、每個細胞胞中存在的質質粒數稱為該該質粒的拷貝貝數。不同類類型的質粒其其拷貝數各異異，同一質粒粒在不同條件件下，拷貝數數也可能差異異很大，有嚴嚴緊型和松弛弛型兩種。3、質粒DNA分子常呈呈現三種形態態；常見的一一種是共價、、閉環狀DNA(CCCDNA)；其次是由由于—條鏈有有缺口而產生生的開環DNA(ocDNA)；第第三種是由雙雙環分子兩段段均斷裂而產產生的線性DNA。質粒載體二、各類質粒粒所賦予宿主主細胞的不同同表現型抗生素抗性：：抗生素的產產生；大腸桿桿菌素的產生生；腸毒素的的產生；復雜雜有機化合物物的降解；限限制性核酸內內切酶和修飾飾酶的產生；；殺傷性能。。在自然條件下下，許多質粒粒可經細菌接接合或相似方方式在宿主間間相互轉移。。在實驗室條條件下，質粒粒也可經人工工手段將其轉轉化入宿主細細胞內。三、質粒DNA的提取方方法細菌培養和質質粒擴增；細菌的收獲和和裂解；質粒DNA的的提取。四、遺傳轉化化轉化是指受體體細胞直接攝攝取供體細胞胞游離的DNA片段，將將其同源部分分進行堿基配配對，組合到到自己的基因因中，從而獲獲得供體細胞胞的某些遺傳傳性狀。(二)操作步步驟：質粒DNA轉轉化感受態大大腸桿菌1．從瓊脂平平板上挑取新新鮮菌落接入入10ml肉肉湯培養基中中，37℃培培養過夜。2．取0.5ml培養物物接入50ml肉湯中，，無菌添加0.4ml2.5mol／LMgCl2，于于37℃振蕩蕩培養。3．將o.1mol／LCaCl2溶液、試試管及吸管在在冰浴中冷卻卻。4．當培養物物OD600在o.5～～o.8左右右時，開始收收獲細胞(大大約需2～2.5h)．．5．將培養物物置冰浴中冷冷卻10min。6．取10ml培養物置置2個冷離心心管中棄去上上清液。7．加入1ml0.1mol／LCaCl2，再加0.9mlCaCl2，置冰浴中中放置20min。8．3000r／min離心10min，棄去去上清液．9．加入1ml0.1mol／LCaCl2，重新懸懸浮細胞，置置冰浴中保存存。10．加入1～20μl待轉化質粒粒DNA溶溶液。11．在冰上上放置20min，在37℃處理2min。再再插入冰中．．加入0.9m1肉湯37℃靜置培培養90min。12．以不同同的量涂布選選擇培養基平平板。13．于37℃培養過夜夜。鑒定轉化化菌落。常用的遺傳轉轉化系統1、自然系統統2、人工誘導導（完整細胞胞）（1）二價陽陽離子系統：：Ca2+，，Ca2++Mg2+，，Mg2+，，Ca2++輔助噬菌體體，Tris+Ca2+（2）單價陽陽離子系統：：PEG+Li+/Cs+/Rb+（3）凍融系系統（4）Triton處理理：人工誘導導（PEG/原生質體））重組DNA中中常用的工具具酶包括限制性核核酸內切酶、、DNA連接接酶、DNA聚合酶、逆逆轉錄酶等.限制性內切酶酶切開DNA分分子所需的酶酶：每一種酶酶都有其各自自的作用位點點。常用限制性內內切酶種類及特性W.Arber,H.O.Smith限制性內切酶酶的剪切方式式粘性未端：切切開后的兩段段DNA各留留下一個尾，，這2個尾的的核苷酸順序序完全一樣，，中是方向相相反。它們之之間是互補的的，在適當條條件下可以再再連接一起。。其它工具酶連接酶T4DNA修補工具酶DNA聚合酶I末端加工酶S1核酸酶，，堿性磷酸酸單脂酶末端轉移酶人工加polyA或polyT尾反轉錄酶載體－宿主系系統載體(vector)是是攜帶外源DNA進入宿宿主細胞進行行擴增和表達達的DNA；；一般是通過改改造質粒、噬噬菌體或病毒毒等構建的。。載體應具備以以下條件：１、能在適當當的宿主細胞胞中復制；２、具有多種種限制酶的單單一切點（即即所謂多克隆隆位點）以便便外源DNA插入；３、具有篩選選標志以區別別陽性與陰性性重組分子；；４、載體分子子較小，以便便體外基因操操作，同時載載體DNA與與宿主DNA便于分離；；５、對于表達達型載體還應應具有與宿主主細胞相適應應的啟動子、、增強子、加加尾信號等基基因表達元件件。宿主細胞必須須符合以下條條件１、對載體的的復制和擴增增沒有嚴格的的限制；２、不存在特特異的內切酶酶體系降解外外源DNA；；３、在重組DNA增殖過過程中，不會會對它進行修修飾；４、重組缺陷陷型，不會產產生體內重組組；５、容易導入入重組DNA分子；６、符合重組組DNA操作作的安全標準準。目的基因的獲獲取一、通過建立立基因文庫分分離靶基因基因文庫包括括兩類：基因因組文庫：利利用限制性內內切酶。cDNA：用用mRNA反反轉錄成單鏈鏈DNA，再再經DNA聚聚合酶的作用用產生雙鏈DNA。可去去除真核生物物基因中不表表達的內含子子。二、化學合成成法制備DNA片段從蛋白質肽鏈鏈的氨基酸順順序可以知道道它的遺傳密密碼，再依照照密碼合成基基因。三、聚合酶鏈鏈反應法擴增增基因片段對于已知全部部或部分核苷苷酸序列的基基因，可以通通過聚合酶鏈鏈反應（ＰＣＣＲ），以基基因組DNA或cDNA模板擴增得得到目的基因因片段。PCR技術根據需擴增片片段的兩端設設計引物。使DNA解鏈鏈（高溫），，引物結合于于基因的兩端端（低溫），，在合適溫度度下開始合成成（鏈延長））反應。特點：需要很很少的DNA模板，且能能直接從基因因組中得到目目的基因。DNA擴增PCR反應DNA片斷的克隆載體的條件：a復制起點b適宜的限限制酶切點c選擇標記記DNA分子的的體外連接DNA片段的的體外連接是是重組DNA技術的關鍵鍵。DNA連連接是由DNA連接酶催催化完成的。。一、DNA連連接酶DNA連接酶酶催化兩條雙雙鏈DNA片片段相鄰的5’-磷酸和和3’-羥基基間形成磷酸酸二酯鍵。在分子克隆中中最有用的的的DNA連接接酶是來自ＴＴ４噬菌體的的DNA連連接酶。T4DNA連接酶在分分子克隆中主主要用于：１、連接具有有同源互補粘粘性末端的ＤＤＮＡ片段；；２、連接雙鏈鏈DNA分子子間的平端；；３、在雙鏈平平端的DNA分子上添加加合成的人工工接頭或適配配子。重組DNA導導入宿主菌體外連接的重重組DNA分分子必須導入入適當的受體體細胞中才能能大量的復制制、增殖和表表達。根據所所采用的載體體的性質，將將重組DNA分子導入受受體可有不同同的方法。一、轉化化指以細菌質質粒為載體體，將外源源基因導入入受體細胞胞的過程。。轉化時，，細菌必須須經過適當當的處理使使之處于感感受態－即即容易接受受外源DNA的狀態態，然后利利用短暫熱熱休克使DNA導入入細菌宿主主中。此外還可用用電穿孔法法轉化細菌菌，它的優優點是操作作簡便、轉轉化效率高高、適用于于任何菌株株。二、轉染和和感染利用噬菌體體DNA作作為載體時時可經兩種種方式導入入受體菌。。一種是感感染，即在在體外將噬噬菌體DNA包裝成成病毒顆粒粒，然后使使其感染受受體菌。另另一種方式式是轉染，，即在DNA連接酶酶作用下使使噬菌體DNA環化化，再象重重組質粒一一樣地轉化化進受體菌菌。但習慣慣上常把以以噬菌體DNA為載載體構建成成的重組子子導入細胞胞的過程統統稱為轉染染。重組克隆的的篩選與鑒鑒定基因克隆的的最后一步步是從轉化化細菌菌落落中篩選出出含有陽性性重組子的的菌落，并并鑒定重組組子的正確確性。通過細菌培培養以及重重組子的擴擴增，獲得得所需的基基因片段的的大量拷貝貝。進一步步研究該基基因的結構構、功能，，或表達該該基因的產產物。一、抗藥性性標志的篩篩選如果克隆載載體帶有某某種抗藥性性標志基因因如ampr或tetrr，，轉化后后只有含這這種抗藥基基因的轉化化子細菌才才能在含該該抗菌素的的平板上幸幸存并形成成菌落，這這樣就可將將轉化菌與與非轉化菌菌區別開來來。如果重重組DNA時將外源源基因插入入標志基因因內，該標標志基因失失活，通過過有無抗菌菌素培養基基對比培養養，還可區區分單純載載體或重組組載體（含含外源基因因）的轉化化菌落。二、β－半半乳糖苷酶酶系統篩選選很多載體都都攜帶一段段細菌的lacZ基基因，它編編碼β－半半乳糖苷酶酶N-端的的146個個氨基酸，，稱為α－－肽，它表表達β－半半乳糖苷酶酶的C-端端肽鏈。當載體與宿宿主細胞同同時表達兩兩個片段時時，宿主細細胞才有ββ－半乳糖糖苷酶活性性，使特異異的底物X-gal變為蘭蘭色化合物物，這就是是所謂的αα－互補。。而重組子由由于基因插插入使α－－肽基因失失活，不能能形成α－－互補，在在含X-gal的平平板上，含含陽性重組組子的細菌菌為無色菌菌落或噬菌菌斑。三、菌落快快速裂解鑒鑒定法從平板上直直接挑選菌菌落裂解后后，直接電電泳檢測載載體質粒大大小，判斷斷有無插入入片段存在在，該法適適于插入片片段較大的的重組子初初篩。四、內切酶酶圖譜鑒定定經初篩鑒定定有重組子子的菌落，，小量培養養后，再分分離出重組組質粒或重重組噬菌體體DNA，，用相應的的內切酶切切割，釋放放出插入片片斷；對于于可能存在在雙向插入入的重組子子，還要用用內切酶消消化鑒定插插入的方向向。重組DNA的鑒定遺傳學方法法第七節雜雜交育種(一)細菌菌雜交在細菌中實實現雜交的的種類尚不不多，主要要是大腸桿桿菌，其他他還有鼠傷傷寒沙門氏氏菌、銅綠綠假單胞菌菌、淋病奈奈氏球菌等等。大腸桿菌中中存著致育育因子F，，有F因子子為F+，，沒有F因因子稱F-。F因子存在在于細胞中中形式：游游離狀態(F+細胞胞)；整合合狀態，即即F因子插插入胞核質質的一定位位置上(Hfr細胞胞)。F因子有明明顯的感染染性，大腸腸桿菌的接接合，實質質上是F因因子的轉移移，所以F+和Hfr稱供體體菌，而F-稱受體體菌。（二）酵母雜雜交育種技技術1、酵母繁繁殖方式酵母為單細細胞型真菌菌，一般以以出芽方式式生殖，在在通常情況況下，繁殖殖體為雙倍倍體，但經經過特定條條件的誘導導，可使其其產生單倍倍體孢子并并可出芽產產生單倍體體繁殖體。。單倍體細胞胞具α及εε2兩種交交配型。兩兩種交配型型細胞經其其細胞壁上上特定的凝凝聚因子誘誘導而進行行交配，恢恢復為雙倍倍體；同一一交配型細細胞之間，，則因細胞胞壁上凝集集因子的存存在而不能能進行交配配。在生活過程程中，酵母母細胞還可可以形成三三倍體、四四倍體、多多倍體或非非整倍體細細胞。2、酵母雜雜交一般而言，，雜交育種種運用了酵酵母的單雙雙倍生活周周期，將不不同基因型型和相對的的交配型的的單倍體細細胞經誘導導雜交而形形成二倍體體細胞，經經篩選便可可獲得新的的遺傳性狀狀。酵母的雜交交方法有孢孢子雜交法法、群體交交配法、單單倍體細胞胞雜交法和和罕見交配配法。就啤啤酒酵母而而言，運用用罕見交配配法更易獲獲得結果。。第八節原原生質體體育種原生質體育育種技術主主要有原生生質體融合合、原生質質體轉化技技術，此外外尚有原生生質體誘變變育種等。。原生質休融融合育種是是基因重組組的一種重重要方法。。原生質體融融合作為一一種新的基基因重組手手段是1978年第第三屆國際際工業微生生物遺傳學學討論會上上提出來的的。一、原生質質體融合育育種的特點點(一)雜交交頻率較高高：細胞壁壁去除后在在高滲條件件下形成類類似于球形形的原生質質體。(二)受接接合型或致致育型的限限制較小：：二親株中中任何一株株都可能起起受體或供供體的作用用，因此有有利于不同同種屬間微微生物的雜雜交。(三)遺傳傳物質傳遞遞更為完整整：原生質質體融合是是二親株的的細胞質和和細胞核進進行類似的的合二為一一的過程。。(四)存在在著兩株以以上親株同同時參與融融合形成融融合子的可可能性。（五有可能能采用產量量性狀較高高的菌株作作融合親株株。(六)提高高菌株產量量的潛力較較大。(七)有助助于建立工工業微生物物轉化體系系。二、原生質質體融合育育種步驟1．標記菌菌株的篩選選和穩定性性驗證。2．原生質質體制備。。3．等量原原生質體加加聚乙二醇醇促進融合合。4．涂布于于再生培養養基，再生生出菌落。。5．選擇性性培養基上上劃線生長長，分離驗驗證，挑取取融合子進進一步試驗驗、保藏。。6．生產性性能篩選。。三、原生質質體融合育育種的要點點（一）標記記菌種的選選擇獲得標記菌菌種的方法法是采用常常規誘變育育種，篩選選出營養缺缺陷型或／／和抗藥性性菌株。這這里最重要要的是標記記必須穩定定。采用抗藥性性菌株除可可作標記外外，在實驗驗室中還可可排除雜菌菌污染的干干擾。為的的是確證融融合的成功功，可以采采用多標記記菌種。(二)原生生質體的制制備原生質體的的制備主要要是在高滲滲壓溶液中中加入細胞胞壁分解酶酶，將細胞胞壁分離剝剝離，結果果剩下由原原生質膜包包住的類似似球狀的細細胞，它保保持原細胞胞的一切活活性。在放線菌和和細菌中，，制備原生生質體主要要采用溶菌菌酶；酵母母和霉菌一一般可用蝸蝸牛酶或纖纖維素酶等等。影響原生質質體制備的的因素1．菌體的的前處理為了使酶作作用的效果果好一些，，可將菌作作一些前處處理。如細細菌加入亞亞抑制劑量量的青霉素素。2．菌體的的培養時間間為了使細胞胞易于原生生質體化，，一般選擇擇增殖期的的菌體。3．酶濃濃度對于不同種種屬的微生生物，不僅僅對酶的種種類要求不不同，就是是對酶的濃濃度也有差差異。另外外，最佳酶酶濃度還隨隨不同的生生長期的菌菌體而變化化。4．酶處理理溫度5．破壁時時的pH值值6．滲透壓壓穩定劑等滲透壓在在原生質體體制備中，，不僅起到到保護原生生質體免于于膨裂，而而且還有助助于酶和底底物的結合合，滲透壓壓穩定劑多多采用甘露露醇，山梨梨醇，蔗糖糖等有機物物和KCl和NaCl等無機機物。第九九節節篩篩選選新新的的代代謝謝產產物物一、、開開發發新新的的代代謝謝產產物物的的途途徑徑(1)從從自自然然界界分分離離新新的的微微生生物物菌菌株株，，或或采采用用新新的的檢檢閱閱方方法法篩篩選選新新的的代代謝謝產產物物。。(2)對對已已知知微微生生物物的的代代謝謝產產物物進進行行化化學學修修飾飾。。(3)利利用用微微生生物物轉轉化化改改造造代代謝謝產產物物的的結結構構。。(4)通通過過原原生生質質體體融融合合獲獲得得新新的的代代謝謝產產物物。。(5)DNA重重組組技技術術。。二、、篩篩選選微微生生物物新新的的代代謝謝產產物物的的程程序序突變型型菌株株的篩篩選一、產產量性性狀突突變株株的篩篩選三、篩篩選微微生物物代謝謝產物物的目目標篩選克克服抗抗生素素抗性性菌株株的活活性物物質；；篩選抗抗腫瘤瘤、抗抗病毒毒的活活性物物質；；研究有有藥理理活性性的酶酶抑制制劑及及免疫疫調節節劑；；尋找食食品工工業最最好的的酵母母培養養物；；篩選降降解有有害物物質的的微生生物以以及治治療上上具有有低毒毒、長長效的的化學學藥物物等。四、篩篩選微微生物物代謝謝產物物的方方法(一)直接接方法法為了盡盡快確確定微