..v細胞因子分子量還原型SDSPAGE測定標準操作規程依據：《中華人民XX國藥典》2005年版第三部。X圍：適用于細胞因子蛋白質分子量測定。目的：測定待檢品分子量是否符合《中華人民XX國藥典》2005年版要求原理：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳是利用丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺在催化劑的作用下聚合成大分子凝膠后再進行電泳。因此它兼具了分子篩效應與電泳效應。其催化系統為過硫酸銨-TEMED系統。而SDS這種陰離子表面活性劑的加入，它能使蛋白質氫鍵、疏水鍵打開，并按一定比例與蛋白質分子結合成帶負電的復合物，其負電荷遠遠超過了蛋白質原有的電荷，因而掩蓋了不同種類的蛋白質間原有的電荷差別。這樣就使電泳的遷移率只取決于分子量大小這一因素，從而達到分離不同組分的蛋白質的目的，并在還原劑巰基乙醇的存在下，（定量的巰基乙醇可以使蛋白質分子內的二硫鍵徹底還原；以使SDS定量的結合到蛋白質分子上去，使蛋白質具有相同的構象），可以檢測到是否有蛋白質聚合體的產生。內容：材料1．1樣品：經二人復核批號無誤后檢測1．2試劑甲醇CH3OH分析純無水乙醇C2H5OH分析純濃鹽酸HCl 分析純甘油C3H8O3分析純硝酸銀AgNO3分析純重鉻酸鉀K2Cr2O7分析純正丁醇C4H9OH分析純甲醛HCHO分析純丙烯酰胺CH2CHCONH2分析純甲叉雙丙烯酰胺[（CH2CHCONH2）2]CH2分析純過硫酸銨（NH4）2S2O8分析純TEMED（四甲基乙二胺）(CH3)2N(CH2)2N(CH3)2分析純甘氨酸C2H5NO2分析純SDS（十二烷基硫酸鈉）C12H25O4SNa分析純乙酸CH3COOH分析純碳酸鈉Na2CO3分析純β-巰基乙醇HSCH2CH2OH分析純溴酚藍C19H10Br4O5S分析純1．3分子量標準品：法瑪西亞公司。1．4注射用水：符合《中華人民XX國藥典》2005年版要求1．5設備扭力天平XX第二天平儀器廠垂直板狀電泳槽東方儀器廠恒溫恒流電泳儀法瑪西亞公司快速電泳槽 BIORAD USA全自動掃描儀 CS-930 日本島津TS-1型搖床1．6器皿：500ml瓶、100ul移液器、1ml吸管、10ml吸管、3000ml三角瓶、平皿、1000ml燒杯、80ml燒杯，以上器皿經本室洗刷組處理。2方法2．1準備工作2．1．1工作環境：控制區，確認場地清場合格，摘下“清場合格”標志牌，掛上“使用中”標志牌。2．1．2調試儀器設備2．1．2．1恒溫恒流電泳儀工作狀態良好，已經掛“備用”標志牌。2．1．2．2全自動掃描儀工作狀態良好，已掛“備用”標志牌。2．1．2．3扭力天平工作狀態良好，已掛“備用”標志牌。2．1．3摘下扭力天平“備用”標志牌，掛“運行”標志牌。2．1．4配液：以下溶液的配制完成后，均需經二人復核無誤后，在瓶外貼標簽，注明溶液的名稱、濃度、體積、批號及配制日期。2．1．4．1聚丙烯酰胺凝膠母液100ml用扭力天平準確稱取丙烯酰胺30g,甲叉雙丙烯酰胺0.8g，加50ml注射用水溶解后定容至100ml，過濾，置于棕色瓶中，二人復核，貼簽，標明溶液的名稱、濃度、體積、批號、配制日期，42．1．4．2分離膠緩沖液100ml用扭力天平準確稱取Tris18.15g，溶于80ml注射用水中，溶解后，加濃鹽酸調節pH8.8，補加注射用水至100ml，置于250ml瓶中，2．1．4．3濃縮膠緩沖液100ml用扭力天平準確稱取Tris6.05g，溶于80ml注射用水中，溶解后，加濃鹽酸調pH6.8，補加注射用水至100ml，置于250ml瓶中，2．1．4．41%SDS50ml用扭力天平準確稱取SDS0.5g，溶于50ml注射用水中，溶解后，置于棕色瓶中，2．1．4．51%TEMED50ml用吸管準確吸取TEMED0.5ml，溶于50ml注射用水中，二人復核，貼簽，標明溶液的名稱、濃度、體積、批號、配制日期，4℃2．1．4．61%過硫酸銨50ml用扭力天平準確稱取過硫酸銨0.5g，溶于50ml注射用水中，二人復核，貼簽，標明溶液的名稱、濃度、體積、批號、配制日期，4℃2．1．4．7電極緩沖液3000ml用扭力天平準確稱取Tris9g、甘氨酸43.2g、SDS3g，溶于2000ml注射用水中，補加注射用水至3000ml，置于3000ml三角瓶中，二人復核，貼簽，標明溶液的名稱、濃度、體積、批號、配制日期，常溫貯存。2．1．4．8固定液500ml用量筒準確量取甲醇250ml，乙酸50ml，補加注射用水至500ml，置于500ml瓶中，二人復核，貼簽，標明溶液的名稱、濃度、體積、批號、配制日期，常溫貯存。2．1．4．9洗液3000ml用量筒準確量取無水乙醇300ml，乙酸150ml，補加注射用水至3000ml，置于3000ml三角瓶中，二人復核，貼簽，標明溶液的名稱、濃度、體積、批號、配制日期，常溫貯存。2．1．4．10重鉻酸鉀溶液200ml用扭力天平準確稱取重鉻酸鉀10g，加注射用水至200ml；加濃HNO32ml搖勻溶解，置于棕色瓶中，二人復核，貼簽，標明溶液的名稱、濃度、體積、批號、配制日期，2．1．4．11硝酸銀溶液200ml用扭力天平準確稱取硝酸銀0.4g，加注射用水至200ml，置于棕色瓶中，避光保存，二人復核，貼簽，標明溶液的名稱、濃度、體積、批號、配制日期，2．1．4．12顯色液3000ml用扭力天平準確稱取Na2CO318g，加注射用水至3000ml，溶解后，加0.6ml甲醛，置于3000ml三角瓶中，2．1．4．13終止液500ml用吸管準確吸取乙酸5ml，溶于500ml注射用水中，置于500ml瓶中，二人復核，貼簽，標明溶液的名稱、濃度、體積、批號、配制日期，常溫貯存。2．1．4．14樣品處理液（還原型）10ml用扭力天平準確稱取Tris0.303g、SDS0.8g、溴酚藍0.189g，溶于2ml注射用水中，加入甘油4ml，β-巰基乙醇2ml，濃HCl0.189ml，加注射用水定容至10ml，二人復核，貼簽，標明溶液的名稱、濃度、體積、批號、配制日期，42．1．5樣品準備：將樣品自冰箱內拿出，放置室溫溶化后，將樣品與樣品處理液按3：1（V/V）的比例混勻，沸水處理3～5分鐘，待用。2．2操作過程2．2．1．1分離膠（13.5%）制備聚丙烯酰胺凝膠母液14.4ml,分離膠緩沖液8ml,1%SDS3.2ml，注射用水3.2ml，1%過硫酸銨1.6ml，1%TEMED1.6ml，制成膠量32ml。2．2．1．2濃縮膠（4.5%）的制備聚丙烯酰胺凝膠母液2.4ml,,濃縮膠緩沖液4ml,注射用水4.8ml，1%SDS1.6ml，1%過硫酸銨1.6ml，1%TEMED1.6ml，pH6.8，成膠量16ml。2．2．1．3灌膠灌膠時先將電泳槽陽極側用透析紙包上，在電泳槽內加滿水，靠水壓封住陽極側縫隙，以免膠溶液漏出；在兩玻璃板間加分離膠，加膠完畢后，用注射器沿玻璃板在液面上覆蓋一層（約0.3cm高）正丁醇；待膠凝固后，將電泳槽內注射用水及膠表面的正丁醇倒掉，并用濾紙吸干；向電泳槽內加入電極緩沖液、在濃縮膠位置插上梳子，在分離膠上加濃縮膠，待膠凝固后抽去梳子。2．2．2加樣:將處理后樣品按每孔不少于5ug的蛋白量，加入樣品槽內，同時在另一測加入分子量標準品作對照。2．2．3電泳:打開電泳儀，摘下“備用”標志牌，掛“運行”標志牌，調定電流，起始電流15mA，待指示線跑至分離膠處，改電流為25mA，電泳時間約為2.5小時，待指示劑至底線處，停止電泳,關閉電泳儀，摘掉“運行”標志牌,掛“備用”標志牌。2．2．4染色電泳完畢后取下膠片，置于5倍膠體積的固定液內12h（或室溫振蕩30分鐘）；洗液洗三次，每次10分鐘，37℃搖床內振蕩；取5ml重鉻酸鉀母液加入200ml注射用水中，將膠片置其中,避光,振蕩10分鐘；用注射用水洗數次至黃色本底變白；加入新配制的0.2%AgNO3溶液白熾燈下照射30分鐘；水洗五次；顯色液500ml中加甲醛0.35ml2．2．5掃描2．2．5．1打開掃描儀,摘下“備用”標志牌,掛上“運行”標志牌。2．2．5．2對膠片進行掃描,同時記錄下掃描結果。2．2．5．3關閉掃描儀,摘下“運行”標志牌,掛“備用”標志牌。2．2．6摘下場地“使用中”標志牌,掛“待處理”標志牌。3結果判定3．1制作標準蛋白泳動曲線：以各標準蛋白質的相對遷移率為橫坐標，蛋白質分子量的對數為縱坐標，在半對數坐標紙上作圖，可得到一條標準曲線。3．2計算檢品的Rf值蛋白質樣品移動距離蛋白質樣品移動距離×染色前膠長脫色后膠長指示劑移動距離Rf=在標準蛋白質分子量的泳動曲線上查得LogMW，查反對數表即得待檢品的蛋白質分子量。3．3判定標準所得的檢品蛋白質分子量結果與理論值進行比較，誤差不超過10%，為合格。IFNα1b理論值：19.4KDIFNα2b理論值：19247KDIFNα2a理論值：19.2KDIL-2理論值：15.5KDGM-CSFb理論值：14.5KD3．4判定結果，填寫記錄。4清場4．1需要低溫貯存的液體放入冰箱，避光的液體放入陰暗處。4．2稱藥之后將藥品瓶蓋蓋緊，放回藥品柜。4．3關閉扭力天平，清潔干凈后放回原處，掛“備用”標志牌。4．4清潔工作臺面，用專用抹布擦凈，地面用專用拖布拖凈。4．5用過的玻璃器皿用純化水沖洗干凈后返回洗刷組。4．6填寫清場記錄。4．7清場后由車間工序負責人或質量監督員檢查合格后,摘下待處理標志,掛“清場合格”標志牌。5注意事項5．1本實驗所用SDS需高純度SDS,如不純需重結晶。5．2樣品必須經沸水處理3-5分鐘,以免有亞穩聚合物存在。6引用文獻6．1參考標準：《中華人民XX國藥典》2005年版。6．2《生化實驗技術和方法》，X龍翔主編，高等教育。6．3醫用實驗病毒學。附:SDS(快速電泳)準備工作同前。制膠1．1分離膠制備：（13.5%）聚丙烯酰胺凝膠母液7.2ml,分離膠緩沖液4ml,1%SDS3.2ml，注射用水1.6ml，1%過硫酸銨0.8ml，1%TEMED0.8ml，制成膠量16ml。1．2濃縮膠的制備(4.5%)聚丙烯酰胺凝膠母液1.2ml,濃縮膠緩沖液2ml,注射用水2.4ml，1%SDS0.8ml，1%過硫酸銨0.8ml，1%TEM