47/482/48目錄色譜法概述 1氣相色譜儀 1載氣系統(tǒng) 2進(jìn)樣系統(tǒng) 2分離系統(tǒng) 2檢測系統(tǒng) 3液相色譜儀 4輸液系統(tǒng) 5進(jìn)樣系統(tǒng) 5檢測系統(tǒng) 6離子色譜法 7氣質(zhì)聯(lián)用氣相色譜 8液質(zhì)聯(lián)用液相色譜 9質(zhì)－質(zhì)聯(lián)用 10高壓液相色譜HPLC 10概論 10一、液相色譜理論發(fā)展簡況 10二、HPLC的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn) 11三、色譜法分類 11四、色譜分離原理 12II．基本概念和理論 14一、基本概念和術(shù)語 14二、塔板理論 18三、速率理論（又稱隨機(jī)模型理論） 19III．HPLC系統(tǒng) 22一、輸液泵 22二、進(jìn)樣器 25三、色譜柱 27四、檢測器 31五、數(shù)據(jù)處理和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng) 35六、恒溫裝置 35IV．固定相和流動(dòng)相 36一、基質(zhì)（擔(dān)體） 36二、化學(xué)鍵合固定相 38三、流動(dòng)相 40V．HPLC應(yīng)用 45一、樣品測定 45二、方法研究 461/49色譜法概述色譜法:是一種重要的分離分析方法，它是利用不同物質(zhì)在兩相中具有不同的分配系數(shù)(或吸附系數(shù)、滲透性)，當(dāng)兩相作相對運(yùn)動(dòng)時(shí)，這些物質(zhì)在兩相中進(jìn)行多次反復(fù)分配而實(shí)現(xiàn)分離。在色譜技術(shù)中，流動(dòng)相為氣體的叫氣相色譜，流動(dòng)相為液體的叫液相色譜。固定相可以裝在柱內(nèi)，也可以做成薄層。前者叫柱色譜，后者叫薄層色譜。根據(jù)色譜法原理制成的儀器叫色譜儀，目前，主要有氣相色譜儀和液相色譜儀。色譜法的創(chuàng)始人是俄國的植物學(xué)家茨維特。1905年，他將從植物色素提取的石油醚提取液倒人一根裝有碳酸鈣的玻璃管頂端，然后用石油醚淋洗，結(jié)果使不同色素得到分離，在管內(nèi)顯示出不同的色帶，色譜一詞也由此得名。這就是最初的色譜法。后來，用色譜法分析的物質(zhì)已極少為有色物質(zhì)，但色譜一詞仍沿用至今，在50年代，色譜法有了很大的發(fā)展。1952年，詹姆斯和馬丁以氣體作為流動(dòng)相分析了脂肪酸同系物并提出了塔板理論。1956年范第姆特總結(jié)了前人的經(jīng)驗(yàn)，提出了反映載氣流速和柱效關(guān)系的范笨姆特方程，建立了初步的色譜理論。同年，高萊(Golay)發(fā)明了毛細(xì)管拄，以后又相繼發(fā)明了各種檢測器，使色譜技術(shù)更加完善。50年代末期，出現(xiàn)了氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用的儀器，克服了氣相色譜不適于定性的缺點(diǎn)。則年代，由于檢測技術(shù)的提高和高壓泵的出現(xiàn)，高效液相色譜迅遠(yuǎn)發(fā)展，使得色譜法的應(yīng)用范圍大大擴(kuò)展。目前，由于高效能的色譜往、高靈敏的檢測器及微處理機(jī)的使用，使得色譜法已成為一種分析速度快、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣的分析儀器。氣相色譜儀典型的氣相色譜儀具有穩(wěn)定流量的載氣，將汽化的樣品由汽化室?guī)肷V柱，在色譜柱中不同組分得到分離，并先后從色譜柱中流出，經(jīng)過檢測器和記錄器，這些被分開的組分成為一個(gè)一個(gè)的色譜峰。通常由下列五個(gè)部分組成：載氣系統(tǒng)（包括氣源和流量的調(diào)節(jié)與測量元件等）進(jìn)樣系統(tǒng)（包括進(jìn)樣裝置和汽化室兩部分）分離系統(tǒng)（主要是色譜柱）檢測、記錄系統(tǒng)（包括檢測器和記錄器）輔助系統(tǒng)（包括溫控系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等）載氣系統(tǒng)載氣通常為氮、氫和氫氣，由高壓氣瓶供給。由高壓氣瓶出來的載氣需經(jīng)過裝有活性炭或分子篩的凈化器，以除去載氣中的水、氧等有害雜質(zhì)。由于載氣流速的變化會(huì)引起保留值和檢測靈敏度的變化，因此，一般采用穩(wěn)壓閥、穩(wěn)流閥或自動(dòng)流量控制裝置，以確保流量恒定。載氣氣路有單柱單氣路和雙柱雙氣路兩種。前者比較簡單，后者可以補(bǔ)償因固定液流失、溫度被動(dòng)所造成的影響，因而基線比較穩(wěn)定。進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)包括進(jìn)樣裝置和汽化室。氣體樣品可以用注射進(jìn)樣，也可以用定量閥進(jìn)樣。液體樣品用微量注射器進(jìn)樣。固體樣品則要溶解后用微量注射器進(jìn)樣。樣品進(jìn)入汽化室后在一瞬間就被汽化，然后隨載氣進(jìn)入色譜柱。根據(jù)分析樣品的不同，汽化室溫度可以在50一400℃范圍內(nèi)任意設(shè)定。通常，汽化室的溫度要比使用的最高柱溫高10一50℃以保證樣品全部汽化。進(jìn)洋量和進(jìn)樣速度會(huì)影響色譜柱效率。進(jìn)樣量過大造成色譜柱超負(fù)荷，進(jìn)樣速度慢會(huì)使色譜峰加寬，影響分離效果。分離系統(tǒng)色譜柱是色譜儀的分離系統(tǒng)。試樣中各組分的分離在色譜柱中進(jìn)行，因此，色譜柱是色譜儀的核心部分。色譜往主要有兩類：填充柱和毛細(xì)管柱。填充柱：填充柱由柱管和固定相組成，柱管材料為不銹鋼或玻璃，內(nèi)徑為2—4毫米，長為1—3米。往內(nèi)裝有固定相，固定相又包括固體固定相和液體固定相兩種。毛細(xì)管柱：毛細(xì)管柱又叫空心柱，空心柱分涂壁空心柱，多孔層空心柱和涂載體空心柱。涂壁空心柱是將固定液均勻地涂在內(nèi)徑0．1—0．5毫米的毛鋼管內(nèi)壁而成。毛細(xì)管的材料可以是不銹鋼、玻璃或石英。這種色譜柱具有滲透性好、傳質(zhì)阻力小等特點(diǎn)，因此柱子可以做得很長(一般幾十米，最長可到三百米)。和填充柱相比，其分離效率高，分析速度快,樣品用量小。其缺點(diǎn)是樣品負(fù)荷量小，因此經(jīng)常需要采用分流技術(shù)。柱的制備方法也比較復(fù)雜；多孔層空心柱是在毛細(xì)管內(nèi)壁適當(dāng)沉積上一層多孔性物質(zhì)，然后涂上固定液。這種柱容量比較大，滲透性好，故有穩(wěn)定、高效、決速等優(yōu)點(diǎn)。檢測系統(tǒng)熱導(dǎo)檢測器熱導(dǎo)檢測器(Thermalcoductivitydetector，簡稱TCD)，是應(yīng)用比較多的檢測器，不論對有機(jī)物還是無機(jī)氣體都有響應(yīng)。熱導(dǎo)檢測器由熱導(dǎo)池池體和熱敏元件組成。熱敏元件是兩根電阻值完全相同的金屬絲(鎢絲或白金絲)，作為兩個(gè)臂接入惠斯頓電橋中，由恒定的電流加熱。如果熱導(dǎo)池只有載氣通過，載氣從兩個(gè)熱敏元件帶走的熱量相同，兩個(gè)熱敏元件的溫度變化是相同的，其電阻值變化也相同，電橋處于平衡狀態(tài)。如果樣品混在載氣中通過測量池，由于樣號(hào)氣和載氣協(xié)熱導(dǎo)系數(shù)不同，兩邊帶走的熱量不相等，熱敏元件的溫度和阻值也就不同，從而使得電橋失去平衡，記錄器上就有信號(hào)產(chǎn)生。這種檢測器是一種通用型檢測器。被測物質(zhì)與載氣的熱導(dǎo)系數(shù)相差愈大，靈敏度也就愈高。此外，載氣流量和熱絲溫度對靈敏度也有較大的影響。熱絲工作電流增加—倍可使靈敏度提高3—7倍，但是熱絲電流過高會(huì)造成基線不穩(wěn)和縮短熱絲的壽命。熱導(dǎo)檢測器結(jié)構(gòu)簡單、穩(wěn)定性好，對有機(jī)物和無機(jī)氣體都能進(jìn)行分析，其缺點(diǎn)是靈敏度低。氫火焰離子化檢測器氫火焰離子化檢測器(FlameIonizationDetector，F(xiàn)ID)簡稱氫焰檢測器。它的主要部件是一個(gè)用不銹鋼制成的離子室。離子室由收集極、極化極(發(fā)射極)、氣體入口及火焰噴嘴組成。在離子室下部，氫氣與載氣混合后通過噴嘴，再與空氣混合點(diǎn)火燃燒，形成氫火焰。無樣品時(shí)兩極間離子很少，當(dāng)有機(jī)物進(jìn)入火焰時(shí)，發(fā)生離子化反應(yīng)，生成許多離子。在火焰上方收集極和極化極所形成的靜電場作用下，離子流向收集極形成離子流。離子流經(jīng)放大、記錄即得色譜峰。有機(jī)物在氫火焰中離子化反應(yīng)的過程如下：當(dāng)氫和空氣燃燒時(shí)，進(jìn)入火焰的有機(jī)物發(fā)生高溫裂解和氧化反應(yīng)生成自由基，自由基又與氧作用產(chǎn)生離子。在外加電壓作用下，這些離子形成離子流，經(jīng)放大后被記錄下來。所產(chǎn)生的離子數(shù)與單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入火焰的碳原子質(zhì)量有關(guān)，因此，氫焰檢測器是一種質(zhì)量型檢測器。這種檢測器對絕大多數(shù)有機(jī)物都有響應(yīng)，其靈敏度比熱導(dǎo)檢測器要高幾個(gè)數(shù)量級，易進(jìn)行痕量有機(jī)物分析。其缺點(diǎn)是不能檢測惰性氣體、空氣、水、C0，CO2、NO、S02及H2S等。電子捕獲檢測器電子捕獲檢測器是一種選擇性很強(qiáng)的檢測器，它只對合有電負(fù)性元素的組分產(chǎn)生響應(yīng)，因此，這種檢測器適于分析合有鹵素、硫、磷、氮、氧等元素的物質(zhì)。在電子捕獲檢測器內(nèi)一端有一個(gè)多放射源作為負(fù)極，另一端有一正極。兩極間加適當(dāng)電壓。當(dāng)載氣(N2)進(jìn)入檢測器時(shí)，受多射線的輻照發(fā)生電離，生成的正離子和電子分別向負(fù)極和正極移動(dòng)，形成恒定的基流。合有電負(fù)性元素的樣品AB進(jìn)入檢測器后，就會(huì)捕獲電子而生成穩(wěn)定的負(fù)離子，生成的負(fù)離子又與載氣正離子復(fù)合。結(jié)果導(dǎo)致基流下降。因此，樣品經(jīng)過檢測器，會(huì)產(chǎn)生一系列的倒峰。電子捕獲檢測器是常用的檢測器之一，其靈敏度高，選擇性好。主要缺點(diǎn)是線性范圍較窄。液相色譜儀氣相色譜法是一種很好的分離、分析方法，它具有分析速度快、分離效能好和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。但是氣相色譜僅能分析在操作溫度下能汽化而不分解的物質(zhì)。據(jù)估計(jì)，在已知化合物中能直接進(jìn)行氣相色譜分析的化合物約占15％，加上制成衍生物的化合物，也不過20％左右。對于高沸點(diǎn)化合物；難揮發(fā)及熱不穩(wěn)定的化合物、離子型化合物及高聚物等，很難用氣相色譜法分析。為解決這個(gè)問題，70年代初發(fā)展了高效液相色譜。高效液相色譜的原理與經(jīng)典液相色譜相同，但是它采用了高效色譜拄、高壓泵和高靈敏度檢測器。因此，高效液相色譜的分離效率、分析速度和靈敏度大大提高。就其分離機(jī)理的不同，高效液相色譜可以分為液－固吸附色譜、液－液分配色譜、離子交換色譜和凝膠滲透色譜四類。液—固色譜的色譜柱內(nèi)填充固體吸附劑，由于不同組分具有不同的吸附能力，因此，流動(dòng)相帶著被測組分經(jīng)過色譜柱時(shí)，各組分被分開。液—液色譜的流動(dòng)相和固定相都是液體。作為固定相的液體涂在惰性擔(dān)體上，流動(dòng)相與固定液不互溶。當(dāng)帶有被測組分的流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱時(shí)，組分在兩相間很快達(dá)分配平衡，由于各組分在兩相間分配系數(shù)不同而彼此分離。以非極性溶液作流動(dòng)相，極性物質(zhì)作固定相的液—液色譜叫正相色譜；極性溶液作流動(dòng)相，非極性物質(zhì)作固定相的液—液色譜叫反相色譜。離子交換色譜的色譜柱內(nèi)填充離子交換樹脂，依靠樣品離子交換能力的差別實(shí)現(xiàn)分離。而凝膠色譜是按試樣中分子大小的不同來進(jìn)行分離的。在上述四類色譜中，應(yīng)用最廣泛的是液—液色譜，因此，在本節(jié)的討論中以液—液色譜為主。高效液相色譜的基本理論和定性定量分析方法與氣相色譜基本相同。高效液相色譜儀由輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng)高效液相色譜的輸液系統(tǒng)包括流動(dòng)相貯存器、高壓泵和梯度淋洗裝置。流動(dòng)相貯存器為不銹鋼或玻璃制成的容器，可以貯存不同的流動(dòng)相。高壓泵是高效液相色譜儀最重要的部件之一。由于高效液相色譜儀所用色譜柱直徑細(xì)，固定相粒度小，流動(dòng)相阻力大，因此，必須借助于高壓泵使流動(dòng)相以較快的速度流過色譜這。高壓泵需要滿足以下條件：能提供150－450kg/cm2的壓強(qiáng)；流速穩(wěn)定，流量可以調(diào)節(jié)；耐腐蝕。目前所用的高壓泵有機(jī)械泵和氣動(dòng)放大泵兩種。梯度淋洗裝置可以將兩種或兩種以上的不同極性溶劑，按一定程序連續(xù)改變組成，以達(dá)到提高分離效果，縮短分離時(shí)間的目的。它的作用與氣相色譜中的程序升溫裝置類似。梯度淋洗裝置分為兩類：一類叫外梯度裝置；一類內(nèi)梯度裝置。外梯度裝置是流動(dòng)相在常壓下混合，靠一臺(tái)高壓泵壓至色譜柱；內(nèi)梯度裝置是先將溶劑分別增壓后，再由泵按程序壓入混合室，再注入色譜柱。進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)一般高效液相色譜多采用六通閥進(jìn)樣。先由注射器將樣品常壓下注入樣品環(huán)。然后切換閥門到進(jìn)樣位置，由高壓泵輸送的流動(dòng)相將樣品送人色譜柱。樣品環(huán)的容積是固定的，因此進(jìn)樣重復(fù)性好。分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)包括色譜柱、連接管、恒溫器等。色譜柱是高效液相色譜儀的心臟。它是由內(nèi)部拋光的不銹鋼管制成，一般長10—50cm，內(nèi)徑2—5mm，柱內(nèi)裝有固定相。液相色譜的固定相是將固定該涂在擔(dān)體上而成。擔(dān)體有兩類：一類是表面多孔型擔(dān)體；另一類是全多孔型擔(dān)體。近年來又出現(xiàn)了全多孔型微粒擔(dān)體。這種擔(dān)體檢度為5—10um，是由nm級的硅膠微粒堆積而成，又叫堆積硅珠。由于顆粒小，所以柱效高，是目前最廣泛使用的一種擔(dān)體。在高效液相色譜分析中，適當(dāng)提高柱溫可改善傳質(zhì)，提高桂效，縮短分析時(shí)間。因此，在分析時(shí)可以采用帶有恒溫加熱系統(tǒng)的金屬夾套來保持色譜拄的溫度。溫度可以在室溫到60℃間調(diào)節(jié)。檢測系統(tǒng)高效液相色譜的檢測器很多，最常用的有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器等。(1)紫外檢測器紫外檢測器是液相色譜中應(yīng)用最廣泛的檢測器，適用有紫外吸收物質(zhì)的檢測。在進(jìn)行高效液相色譜分析的樣品中，約有80％的樣品可以使用這種檢測器。紫外檢測器的工作原理如下：由光源產(chǎn)生波長連續(xù)可調(diào)的紫外光或可見光，經(jīng)過透鏡和遮光板變成兩束平行光，無樣品通過時(shí)，參比池和樣品池通過的光強(qiáng)度相等，光電管輸出相同，無信號(hào)產(chǎn)生；有樣品通過時(shí)，由于樣品對光的吸收，參比池和樣品池通過的光強(qiáng)度不相等，有信號(hào)產(chǎn)生。根據(jù)朗伯—比爾定律，樣品濃度越大，產(chǎn)生的信號(hào)越大，這種檢測器靈敏度高，檢測下限約為10(-10)g／ml，而且線性范圍廣，對溫度和流速不敏感，適于進(jìn)行梯度洗脫。(2)示差折光檢測器示差折光檢測器是根據(jù)不同物質(zhì)具有不同折射率來進(jìn)行組分檢測的。凡是具有與流動(dòng)相折射率不同的組分，均可以使用這種檢測器。如果流動(dòng)相選擇適當(dāng)，可以檢測所有的樣品組分。示差折光檢測器分為反射式和沂射式兩種。反射式示差折光檢測器是根據(jù)下述原理制成的：光在兩種不同物質(zhì)界面的反射百分率與入射角和兩種物質(zhì)的折射率成正比。如果入射角固定，光線反射百分率僅與這兩種物質(zhì)的沂射率成正比。光通過僅有流動(dòng)相的參比池時(shí)，由于流動(dòng)相組成不變，故其折射率是固定的；光通過工作池時(shí)，由于存在待測組分而使折射串改變，從而引起光強(qiáng)度的變化，測量光強(qiáng)度的變化，即可測出該組分濃度的變化。偏轉(zhuǎn)式示差折光檢測器是根據(jù)下述原理：當(dāng)一束光透過折射率不同的兩種物質(zhì)時(shí)，此光束會(huì)發(fā)生一定程度的偏轉(zhuǎn)，其偏轉(zhuǎn)程度正比于兩物質(zhì)折射率之差。示差折光檢測器的優(yōu)點(diǎn)是通用性強(qiáng)，操作簡便；缺點(diǎn)是靈敏度低，最小檢出限約為10(-7)g/ml，不能做痕量分析。此外，由于洗脫液組成的變化會(huì)使折射率變化很大，因此，這種檢測器也不適用于梯度洗脫。(3)熒光檢測器物質(zhì)的分子或原子經(jīng)光照射后，有些電子被激發(fā)至較高的能級，這些電子從高能級躍至低能級時(shí)，物質(zhì)會(huì)發(fā)出比入射光波長較長的光，這種光稱為熒光。在其他條件一定的情況下，熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正比。許多有機(jī)化合物具有天然熒光活性，另外，有些化合物可以利用柱后反應(yīng)法或柱前反應(yīng)法加入熒光化試劑，使其轉(zhuǎn)化為具有熒光活性的衍生物。在紫外光激發(fā)下，熒光活性物質(zhì)產(chǎn)生熒光，由光電倍增管轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)。熒光檢測器是一種選擇性檢測器，它適合于稠環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素、蛋白質(zhì)等熒光物質(zhì)的測定。這種檢測器靈敏度非常高，其檢出限可達(dá)10(-12)_10(-13)g/ml，比紫外檢測器高2—3個(gè)數(shù)量級，適合于痕量分析。而且可以用于梯度洗脫。其缺點(diǎn)是適用范圍有一定的局限性。離子色譜法離子色譜法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)測定溶液中陰離子和陽離子的一種分析方法。離子色譜是液相色譜的一種。離子色譜是利用不同離子對固定相親合力的差別來實(shí)現(xiàn)分離的。離子色譜的固定相是離子交換樹脂，離子交換樹脂是苯乙烯-二乙烯基苯的共聚物。樹脂核外是一層可離解的無機(jī)基團(tuán)，由于可離解基團(tuán)的不同，離子交換樹脂又分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂。當(dāng)流動(dòng)相將樣品帶到分離柱時(shí)，由于樣品離子對離子交換樹脂的相對親合能力不同而得到分離，由分離柱流出的各種不同離子，經(jīng)檢測器檢測，即可得到一個(gè)個(gè)色譜峰。然后用通常的色譜定性定量方法進(jìn)行定性定量分析。離子色譜法是進(jìn)行離子測定的快速、靈敏、選擇性好的方法，它可以同時(shí)檢測多種離子.特別是對陰離子的測定更是其他方法所不能相比的。如果說高頻感應(yīng)等離子光譜是同時(shí)測定多種元素的快速、準(zhǔn)確的分析方法，那么，同時(shí)測定多種陰離子的快速、靈敏的方法便是離子色譜法了。離子色譜自1975年問世以來，已經(jīng)得到了飛快的發(fā)展，并且引起了分析工作者的廣泛注意。目前，離子色譜法已經(jīng)在能源、環(huán)境、冶金、電鍍、半導(dǎo)體、水文地質(zhì)等方面廣泛應(yīng)用，并且開始進(jìn)入了與生命科學(xué)有關(guān)的分析領(lǐng)域。我國從80年代初期引進(jìn)離子色譜儀，開始了離子色譜的應(yīng)用研究工作，同時(shí)也開始了儀器的研制，目前已能生產(chǎn)離子色譜儀。隨著離子色譜技術(shù)的發(fā)展，離于色譜儀在我國的應(yīng)用將日益普及。離子色譜的工作原理（1）離子交換平衡離子色譜中使用的固定相是離子交換樹脂。離子交換樹脂上分布有固定的帶電荷的基團(tuán)和能游動(dòng)的配位離子。當(dāng)樣品加入離子交換色譜往后，如果用適當(dāng)?shù)娜芤合疵?，樣品離子即與樹脂上能游動(dòng)的離子進(jìn)行交換，并且連續(xù)進(jìn)行可逆交換吸附和解吸，最后達(dá)到吸附平衡。（2）化學(xué)抑制型離子色譜工作原理待測樣品由流動(dòng)相帶入分離柱，由分離柱將不同離子分開，由檢測器得色譜峰。但是，用于離子色譜的洗脫液，一般都是強(qiáng)電解質(zhì)溶液，其電導(dǎo)值一般較待測離子高2—3個(gè)數(shù)量級，如果用電導(dǎo)檢測器檢測待測離子，待測離子信號(hào)將完全被洗脫液所淹沒。氣質(zhì)聯(lián)用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用色譜法是有機(jī)物的有效分離分析方法，特別適用于進(jìn)行有機(jī)物的定量分析，但定性分析比較困難。質(zhì)譜法擅長定性分析，但對復(fù)雜的有機(jī)混合物分析則無能為力。如果把二者結(jié)合起來，則能發(fā)揮兩種儀器各自的優(yōu)點(diǎn)。因此，目前所有的質(zhì)譜儀都與氣相色譜相連。組成氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用(GC—MS)系統(tǒng)。該技術(shù)是在50年代后期開始研究的。到60年代后期已經(jīng)成熟并出現(xiàn)了商品儀器。色譜儀是在常壓下工作，而質(zhì)譜儀是在高真空下工作，因此，必須有一個(gè)連接裝置，將色譜流出的載氣去掉，使壓強(qiáng)降低，樣品氣進(jìn)入離子源。這個(gè)連接裝置叫分子分離器。目前一般使用噴射式分子分離器，樣品氣和載氣(He)一起由色譜柱流出進(jìn)入分子分離器。由于載氣分子量小，擴(kuò)散快；經(jīng)過噴咀后，很快擴(kuò)散開并被抽走。樣品氣分子量大，擴(kuò)散慢，依靠慣性進(jìn)入質(zhì)譜儀。這樣，經(jīng)過分子分離器后，壓強(qiáng)由常壓降到10(-2)Pa，載氣被抽除，實(shí)現(xiàn)了載氣和樣品氣的分離。如果色譜儀使用毛細(xì)管柱，由于毛細(xì)管柱流量很小，可以不必經(jīng)過分子分離器而直接進(jìn)入離子源。這樣，混合物樣品由色譜儀一個(gè)一個(gè)分開，由質(zhì)譜儀一個(gè)一個(gè)鑒定，并且根據(jù)需要由數(shù)據(jù)系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，快速地得到各種信息。因此，GC—MS系統(tǒng)已成為有機(jī)物分析的重要工具。液質(zhì)聯(lián)用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用對于熱穩(wěn)定性差或不易汽化的樣品，使用GC—MS有一定的困難。因此，近年來又發(fā)展了液相色譜—質(zhì)譜(LC—MS)聯(lián)用技術(shù)。LC和MS連接的主要問題是如何去除溶劑。目前應(yīng)用較多的接口裝置有傳送帶式和熱噴霧式兩種。傳送帶接口是依靠不銹鋼或高聚物的傳送帶將樣品送入離子源。在傳送過程中，溶劑被加熱汽化并用泵抽走，樣品在離子源汽化并電離,這種接口適用于非極性溶劑。對于極性溶劑，由于汽化慢，需要分流，因而樣品利用率低，影響了整個(gè)系統(tǒng)的靈敏度。熱噴霧接口是80年代發(fā)展起來的新的接口裝置。這種裝置包括汽化器、電窩室和抽氣系統(tǒng)三部分。汽化器是一根金屬毛細(xì)管，內(nèi)徑約0．15mm,毛細(xì)管采用直接電加熱法加熱。電離室有發(fā)射電子的燈絲和放電電離裝置。抽氣系統(tǒng)主要是一個(gè)機(jī)械泵，有的加冷阱，目的為了捕集溶劑。熱噴霧接口的電離方式有三種：直接熱噴霧電離、放電電離和電子束電離。熱噴霧電離是在流動(dòng)相中加入電解質(zhì)(如醋酸銨)，當(dāng)流動(dòng)相通過加熱的汽化器后，以接近汽化(或部分汽化)的狀態(tài)從毛細(xì)管噴出，形成合有細(xì)微霧滴的氣流，因?yàn)槿芤褐泻嫌须娊赓|(zhì)，溶液中就含有一定量的離子，微小霧滴因而帶電。隨著霧滴的不斷蒸發(fā)變小，形成局部強(qiáng)電場，發(fā)生場解吸電離。場解吸電離生成的溶劑離子和樣品離子還可以通過離子分子反應(yīng)生成新的離子。此外，還可以利用放電電離和電子束使熱噴霧氣流產(chǎn)生化學(xué)電離。先使溶劑分子電離，然后與樣品分子反應(yīng)生成樣品離子。電離生成的離子進(jìn)入分析器，溶劑氣體由抽氣系統(tǒng)抽出。熱噴霧方式的特點(diǎn)：(1)直接熱噴霧電離產(chǎn)生的樣品離子一般為質(zhì)子化的離子或所加陽離子與樣品分子的合成離子，如(M十H)+，(M十NH4)+等。這種電離方式比化學(xué)電離溫和，譜圖往往有較強(qiáng)的準(zhǔn)分子離子。因而更適用于難汽化和熱不穩(wěn)定樣品的分子；(2)能滿足一船液相色譜流量要求，100%的水也能分析；(3)有良好的色譜分辨率，靈敏度等于或優(yōu)于傳送帶方式；(4)需加入電解質(zhì)，操作麻煩，結(jié)構(gòu)信息少，適合于四極質(zhì)譜而不適合于磁質(zhì)譜。以上兩種聯(lián)接裝置，雖然使液相色譜和質(zhì)譜的聯(lián)用成為可能，但都有不足之處。目前正在發(fā)展中的超臨界流體色譜(SFC)和質(zhì)譜(MS)聯(lián)用，可能是對難揮發(fā)、易分解物質(zhì)進(jìn)行聯(lián)用分析最有前途的方法。質(zhì)－質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜—質(zhì)譜聯(lián)用80年代初，在傳統(tǒng)的質(zhì)譜儀基礎(chǔ)上，發(fā)展了質(zhì)譜—質(zhì)語(MS—MS)聯(lián)用技術(shù)。它和GC—MS不同，GC—MS是依靠GC將混合物分離，然后由MS定性。而MS—MS則是依靠第一級MS分離出特定的離子，經(jīng)過碰撞活化后，再依靠第二級MS進(jìn)行定性分析。質(zhì)譜—質(zhì)譜聯(lián)用方式很多，既有磁式質(zhì)譜—質(zhì)譜聯(lián)用，如BEB型、EBE型、BEBE型(B：磁分析器，E：靜電分析器)，又有四極質(zhì)譜—質(zhì)譜聯(lián)用，如QQQ型(Q：四極場)，也有混合質(zhì)譜項(xiàng)譜聯(lián)用，如EBQQ型。無論哪種類型的聯(lián)用，都采用了碰撞誘導(dǎo)分解(CID)技術(shù)。質(zhì)譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對于有機(jī)物結(jié)構(gòu)研究是非常有用的。利用它可以進(jìn)行于離子掃描、母離子掃描以及中性丟失掃描。子離子掃描可以用來研究某個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)；母離子掃描則用以研究一組相關(guān)的化合物；而中性丟失掃描。可以在復(fù)雜的混合物中，尋找縣有相同官能團(tuán)的系列化合物。同時(shí)，采用MS—MS技術(shù)還可以直接進(jìn)行混合有機(jī)物的分析。由第一級MS選擇復(fù)雜混合物中的特定離子，碰撞活化后由第二級MS定性測定。另外，對于分子量大的熱不穩(wěn)定的化合物，可以利用場解吸—質(zhì)譜—質(zhì)譜(FD—MS—MS)或快原于轟擊—質(zhì)譜—質(zhì)譜(FAB—MS—MS)聯(lián)用方法，充分發(fā)揮MS—MS聯(lián)用的優(yōu)勢。（完）高壓液相色譜HPLC概論一、液相色譜理論發(fā)展簡況

色譜法的分離原理是：溶于流動(dòng)相(mobilephase)中的各組分經(jīng)過固定相時(shí)，由于與固定相(stationaryphase)發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。

色譜法最早是由俄國植物學(xué)家茨維特（Tswett）在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時(shí)發(fā)現(xiàn)的，色譜法(Chromatography)因之得名。后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。

液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動(dòng)相，稱為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時(shí)間長（常有幾個(gè)小時(shí)）。高效液相色譜法(HighperformanceLiquidChromatography，HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱高壓液相色譜法(HighPressureLiquidChromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(HighSpeedLiquidChromatography，HSLP)。也稱現(xiàn)代液相色譜。二、HPLC的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)HPLC有以下特點(diǎn)：

高壓-壓力可達(dá)150~300Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75Kg/cm2以上。

高速-流速為0.1~10.0ml/min。

高效-可達(dá)5000塔板每米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。

高靈敏度-紫外檢測器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時(shí)消耗樣品少。

HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)：

速度快-通常分析一個(gè)樣品在15~30min，有些樣品甚至在5min內(nèi)即可完成。

分辨率高-可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果。

靈敏度高-紫外檢測器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測器可達(dá)0.1pg。

柱子可反復(fù)使用-用一根色譜柱可分離不同的化合物。

樣品量少，容易回收-樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。三、色譜法分類

按兩相的物理狀態(tài)可分為：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。氣相色譜法適用于分離揮發(fā)性化合物。GC根據(jù)固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC應(yīng)用最廣。液相色譜法適用于分離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。LC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。此外還有超臨界流體色譜法(SFC)，它以超臨界流體（界于氣體和液體之間的一種物相）為流動(dòng)相（常用CO2），因其擴(kuò)散系數(shù)大，能很快達(dá)到平衡，故分析時(shí)間短，特別適用于手性化合物的拆分。按原理分為吸附色譜法(AC)、分配色譜法(DC)、離子交換色譜法(IEC)、排阻色譜法(EC，又稱分子篩、凝膠過濾(GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC）和親和色譜法,此外還有電泳。按操作形式可分為紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。四、色譜分離原理

高效液相色譜法按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。1．液固色譜法

使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個(gè)吸附－解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。適用于分離分子量200~1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。2．液液色譜法

使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個(gè)分配平衡過程。

涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性；流動(dòng)相必須預(yù)先用固定相飽和，以減少固定相從擔(dān)體表面流失；溫度的變化和不同批號(hào)流動(dòng)相的區(qū)別常引起柱子的變化；另外在流動(dòng)相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已很少采用。現(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。

液液色譜法按固定相和流動(dòng)相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。正相色譜法

采用極性固定相(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相)；流動(dòng)相為相對非極性的疏水性溶劑(烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物(如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。反相色譜法

一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動(dòng)相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左右。隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無機(jī)樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動(dòng)相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會(huì)使硅膠溶解，太低的pH值會(huì)使鍵合的烷基脫落。有報(bào)告新商品柱可在pH1.5~10范圍操作。正相色譜法與反相色譜法比較表

正相色譜法反相色譜法固定相極性高～中中～低流動(dòng)相極性低～中中～高組分洗脫次序極性小先洗出極性大先洗出從上表可看出，當(dāng)極性為中等時(shí)正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。

3．離子交換色譜法

固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進(jìn)行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷吸引力而分離。

緩沖液常用作離子交換色譜的流動(dòng)相。被分離組分在離子交換柱中的保留時(shí)間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團(tuán)作用強(qiáng)弱有關(guān)外，它還受流動(dòng)相的pH值和離子強(qiáng)度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進(jìn)而影響其與固定相的作用。流動(dòng)相的鹽濃度大，則離子強(qiáng)度高，不利于樣品的解離，導(dǎo)致樣品較快流出。離子交換色譜法主要用于分析有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。4．離子對色譜法

又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。

分析堿性物質(zhì)常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強(qiáng)的離子對。

分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。

離子對色譜法常用ODS柱（即C18），流動(dòng)相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內(nèi)進(jìn)行分離。被測組分保時(shí)間與離子對性質(zhì)、濃度、流動(dòng)相組成及其pH值、離子強(qiáng)度有關(guān)。5．排阻色譜法

固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動(dòng)相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中，滯留時(shí)間長；大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動(dòng)相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。

II．基本概念和理論一、基本概念和術(shù)語1．色譜圖和峰參數(shù)?色譜圖(chromatogram)——樣品流經(jīng)色譜柱和檢測器，所得到的信號(hào)-時(shí)間曲線，又稱色譜流出曲線(elutionprofile)。?基線(baseline)——經(jīng)流動(dòng)相沖洗，柱與流動(dòng)相達(dá)到平衡后，檢測器測出一段時(shí)間的流出曲線。一般應(yīng)平行于時(shí)間軸。?噪音(noise)——基線信號(hào)的波動(dòng)。通常因電源接觸不良或瞬時(shí)過載、檢測器不穩(wěn)定、流動(dòng)相含有氣泡或色譜柱被污染所致。?漂移(drift)——基線隨時(shí)間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動(dòng)相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會(huì)產(chǎn)生漂移。?色譜峰(peak)——組分流經(jīng)檢測器時(shí)響應(yīng)的連續(xù)信號(hào)產(chǎn)生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態(tài)分布曲線（高斯Gauss曲線）。不對稱色譜峰有兩種：前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。前者少見。?拖尾因子(tailingfactor，T)——T＝，用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子(symmetryfactor)或不對稱因子(asymmetryfactor)。《中國藥典》規(guī)定T應(yīng)為0.95~1.05。T＜0.95為前延峰，T＞1.05為拖尾峰。?峰底——基線上峰的起點(diǎn)至終點(diǎn)的距離。?峰高(peakheight，h)——峰的最高點(diǎn)至峰底的距離。?峰寬(peakwidth，W)——峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作兩條切線與基線的兩個(gè)交點(diǎn)間的距離。W＝4σ?半峰寬(peakwidthathalf-height，Wh/2)——峰高一半處的峰寬。Wh/2＝2.355σ?標(biāo)準(zhǔn)偏差(standarddeviation，σ)——正態(tài)分布曲線x＝±1時(shí)（拐點(diǎn)）的峰寬之半。正常峰的拐點(diǎn)在峰高的0.607倍處。標(biāo)準(zhǔn)偏差的大小說明組分在流出色譜柱過程中的分散程度。σ小，分散程度小、極點(diǎn)濃度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。?峰面積(peakarea，A)——峰與峰底所包圍的面積。A＝×σ×h＝2.507σh＝1.064Wh/2h2．定性參數(shù)（保留值）?死時(shí)間(deadtime，t0)——不保留組分的保留時(shí)間。即流動(dòng)相（溶劑）通過色譜柱的時(shí)間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測定死時(shí)間。?死體積(deadvolume，V0)——由進(jìn)樣器進(jìn)樣口到檢測器流動(dòng)池未被固定相所占據(jù)的空間。它包括4部分：進(jìn)樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙（被流動(dòng)相占據(jù)，Vm）、柱出口管路體積、檢測器流動(dòng)池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其它3部分只起峰擴(kuò)展作用。為防止峰擴(kuò)展，這3部分體積應(yīng)盡量減小。V0＝F×t0（F為流速）?保留時(shí)間(retentiontime，tR)——從進(jìn)樣開始到某個(gè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時(shí)間。?保留體積(retentionvolume，VR)——從進(jìn)樣開始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)流出溶劑的體積。又稱洗脫體積。VR＝F×tR?調(diào)整保留時(shí)間(adjustedretentiontime，t'R)——扣除死時(shí)間后的保留時(shí)間。也稱折合保留時(shí)間(reducedretentiontime)。在實(shí)驗(yàn)條件（溫度、固定相等）一定時(shí)，t'R只決定于組分的性質(zhì)，因此，t'R（或tR）可用于定性。t'R＝tR－t0?調(diào)整保留體積(adjustedretentionvolume，V'R)——扣除死體積后的保留體積。V'R＝VR－V0或V'R＝F×t'R3．柱效參數(shù)?理論塔板數(shù)(theoreticalplatenumber，N)——用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。N取決于固定相的種類、性質(zhì)（粒度、粒徑分布等）、填充狀況、柱長、流動(dòng)相的種類和流速及測定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì)。如果峰形對稱并符合正態(tài)分布，N可近似表示為：N＝()2＝16()2＝5.54()2N為常量時(shí)，W隨tR成正比例變化。在一張多組分色譜圖上，如果各組分含量相當(dāng)，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。用半峰寬計(jì)算理論塔數(shù)比用峰寬計(jì)算更為方便和常用，因?yàn)榘敕鍖捀诇?zhǔn)確測定，尤其是對稍有拖尾的峰。N與柱長成正比，柱越長，N越大。用N表示柱效時(shí)應(yīng)注明柱長，如果未注明，則表示柱長為1米時(shí)的理論塔板數(shù)。（一般HPLC柱的N在1000以上。）若用調(diào)整保留時(shí)間(t'R)計(jì)算理論塔板數(shù)，所得值稱為有效理論塔板數(shù)(N有效或Neff)。?理論塔板高度(theoreticalplateheight，H)——每單位柱長的方差。H＝。實(shí)際應(yīng)用時(shí)往往用柱長L和理論塔板數(shù)計(jì)算：H＝，H有效＝。4．相平衡參數(shù)分配系數(shù)(distributioncoefficient，K)--在一定溫度下，化合物在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)，在固定相與流動(dòng)相中的濃度之比。

分配系數(shù)與組分、流動(dòng)相和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)，也與溫度、壓力有關(guān)。在不同的色譜分離機(jī)制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)，離子交換色譜法為選擇性系數(shù)(或稱交換系數(shù))，凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但一般情況可用分配系數(shù)來表示。

在條件(流動(dòng)相、固定相、溫度和壓力等)一定，樣品濃度很低時(shí)(Cs、Cm很小)時(shí)，K只取決于組分的性質(zhì)，而與濃度無關(guān)。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時(shí)色譜峰為拖尾峰；而有時(shí)隨著溶質(zhì)濃度增大，K也增大，這時(shí)色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進(jìn)樣量，使組分在柱內(nèi)濃度降低，K恒定時(shí)，才能獲得正常峰。

在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時(shí)間長，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時(shí)間短，先流出色譜柱?；旌衔镏懈鹘M分的分配系數(shù)相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提。

在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動(dòng)相的性質(zhì)影響。實(shí)踐中主要靠調(diào)整流動(dòng)相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時(shí)間，達(dá)到分離的目的。容量因子(capacityfactor，k)--化合物在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)，在固定相與流動(dòng)相中的量之比。因此容量因子也稱質(zhì)量分配系數(shù)。

容量因子的物理意義：表示一個(gè)組分在固定相中停留的時(shí)間（t'R）是不保留組分保留時(shí)間（t0）的幾倍。k＝0時(shí)，化合物全部存在于流動(dòng)相中，在固定相中不保留，t'R＝0；k越大，說明固定相對此組分的容量越大，出柱慢，保留時(shí)間越長。

容量因子與分配系數(shù)的不同點(diǎn)是：K取決于組分、流動(dòng)相、固定相的性質(zhì)及溫度，而與體積Vs、Vm無關(guān)；k除了與性質(zhì)及溫度有關(guān)外，還與Vs、Vm有關(guān)。由于t'R、t0較Vs、Vm易于測定，所以容量因子比分配系數(shù)應(yīng)用更廣泛。選擇性因子(selectivityfactor，α)--相鄰兩組分的分配系數(shù)或容量因子之比。α又稱為相對保留時(shí)間（《美國藥典》）。

要使兩組分得到分離，必須使α≠1。α與化合物在固定相和流動(dòng)相中的分配性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與柱尺寸、流速、填充情況無關(guān)。從本質(zhì)上來說，α的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學(xué)性質(zhì)的差異，即分子間相互作用力的差異。5．分離參數(shù)分離度(resolution，R)--相鄰兩峰的保留時(shí)間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。R＝。當(dāng)W1＝W2時(shí)，R＝。當(dāng)R＝1時(shí)，稱為4σ分離，兩峰基本分離，裸露峰面積為95.4%，內(nèi)側(cè)峰基重疊約2%。R＝1.5時(shí)，稱為6σ分離，裸露峰面積為99.7%。R≥1.5稱為完全分離。中國藥典規(guī)定R應(yīng)大于1.5。

提高分離度有三種途徑：①增加塔板數(shù)。方法之一是增加柱長，但這樣會(huì)延長保留時(shí)間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加選擇性。當(dāng)α＝1時(shí)，R＝0，無論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來改變選擇性：a.改變流動(dòng)相的組成及pH值；b.改變柱溫；c.改變固定相。③改變?nèi)萘恳蜃?。這常常是提高分離度的最容易方法，可以通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的組成來實(shí)現(xiàn)。k2趨于0時(shí)，R也趨于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否則不但分離時(shí)間延長，而且峰形變寬，會(huì)影響分離度和檢測靈敏度。一般k2在1~10范圍內(nèi)，最好為2~5，窄徑柱可更小些。

二、塔板理論1．塔板理論的基本假設(shè)

塔板理論是Martin和Synger首先提出的色譜熱力學(xué)平衡理論。它把色譜柱看作分餾塔，把組分在色譜柱內(nèi)的分離過程看成在分餾塔中的分餾過程，即組分在塔板間隔內(nèi)的分配平衡過程。塔板理論的基本假設(shè)為：1）色譜柱內(nèi)存在許多塔板，組分在塔板間隔（即塔板高度）內(nèi)完全服從分配定律，并很快達(dá)到分配平衡。

2）樣品加在第0號(hào)塔板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴(kuò)散可以忽略。

3）流動(dòng)相在色譜柱內(nèi)間歇式流動(dòng)，每次進(jìn)入一個(gè)塔板體積。

4）在所有塔板上分配系數(shù)相等，與組分的量無關(guān)。

雖然以上假設(shè)與實(shí)際色譜過程不符，如色譜過程是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，很難達(dá)到分配平衡；組分沿色譜柱軸方向的擴(kuò)散是不可避免的。但是塔板理論導(dǎo)出了色譜流出曲線方程，成功地解釋了流出曲線的形狀、濃度極大點(diǎn)的位置，能夠評價(jià)色譜柱柱效。2．色譜流出曲線方程及定量參數(shù)（峰高h(yuǎn)和峰面積A）

由色譜流出曲線方程可知：當(dāng)t＝tR時(shí)，濃度C有極大值。Cmax就是色譜峰的峰高。因此：①當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件一定時(shí)（即σ一定），峰高h(yuǎn)與組分的量C0（進(jìn)樣量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。②當(dāng)進(jìn)樣量一定時(shí)，σ越?。ㄖг礁撸甯咴礁?，因此提高柱效能提高HPLC分析的靈敏度。

由流出曲線方程對V(0~∞)求積分，即得出色譜峰面積A?？梢夾相當(dāng)于組分進(jìn)樣量C0，因此是常用的定量參數(shù)。把Cmax＝h和Wh/2＝2.355σ代入上式，即得A＝1.064×Wh/2×h，此為正常峰的峰面積計(jì)算公式。三、速率理論（又稱隨機(jī)模型理論）1．液相色譜速率方程

1956年荷蘭學(xué)者VanDeemter等人吸收了塔板理論的概念，并把影響塔板高度的動(dòng)力學(xué)因素結(jié)合起來，提出了色譜過程的動(dòng)力學(xué)理論--速率理論。它把色譜過程看作一個(gè)動(dòng)態(tài)非平衡過程，研究過程中的動(dòng)力學(xué)因素對峰展寬（即柱效）的影響。

后來Giddings和Snyder等人在VanDeemter方程（后稱氣相色譜速率方程）的基礎(chǔ)上，根據(jù)液體與氣體的性質(zhì)差異，提出了液相色譜速率方程（即Giddings方程）.2．影響柱效的因素1）渦流擴(kuò)散（eddydiffusion）。由于色譜柱內(nèi)填充劑的幾何結(jié)構(gòu)不同，分子在色譜柱中的流速不同而引起的峰展寬。渦流擴(kuò)散項(xiàng)A＝2λdp，dp為填料直徑，λ為填充不規(guī)則因子，填充越不均勻λ越大。HPLC常用填料粒度一般為3~10μm，最好3~5μm，粒度分布RSD≤5%。但粒度太小難于填充均勻（λ大），且會(huì)使柱壓過高。大而均勻（球形或近球形）的顆粒容易填充規(guī)則均勻，λ越小?？偟恼f來，應(yīng)采用細(xì)而均勻的載體，這樣有助于提高柱效。毛細(xì)管無填料，A＝0。2）分子擴(kuò)散（moleculardiffusion）。又稱縱向擴(kuò)散。由于進(jìn)樣后溶質(zhì)分子在柱內(nèi)存在濃度梯度，導(dǎo)致軸向擴(kuò)散而引起的峰展寬。分子擴(kuò)散項(xiàng)B/u＝2γDm/u。u為流動(dòng)相線速度，分子在柱內(nèi)的滯留時(shí)間越長（u?。箤捲絿?yán)重。在低流速時(shí)，它對峰形的影響較大。Dm為分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)，由于液相的Dm很小，通常僅為氣相的10-4~10-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的話，這一項(xiàng)可以忽略不計(jì)。γ是考慮到填料的存在使溶質(zhì)分子不能自由地軸向擴(kuò)散，而引入的柱參數(shù)，用以對Dm進(jìn)行校正。γ一般在0.6~0.7左右，毛細(xì)管柱的γ＝1。3）傳質(zhì)阻抗（masstransferresistance）。由于溶質(zhì)分子在流動(dòng)相、靜態(tài)流動(dòng)相和固定相中的傳質(zhì)過程而導(dǎo)致的峰展寬。溶質(zhì)分子在流動(dòng)相和固定相中的擴(kuò)散、分配、轉(zhuǎn)移的過程并不是瞬間達(dá)到平衡，實(shí)際傳質(zhì)速度是有限的，這一時(shí)間上的滯后使色譜柱總是在非平衡狀態(tài)下工作，從而產(chǎn)生峰展寬。液相色譜的傳質(zhì)阻抗項(xiàng)Cu又分為三項(xiàng)。

①流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗Hm＝Cmd2pu/Dm，Cm為常數(shù)。這是由于在一個(gè)流路中流路中心和邊緣的流速不等所致?？拷畛漕w粒的流動(dòng)相流速較慢，而中心較快，處于中心的分子還未來得及與固定相達(dá)到分配平衡就隨流動(dòng)相前移，因而產(chǎn)生峰展寬。

②靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗Hsm＝Csmd2pu/Dm，Csm為常數(shù)。這是由于溶質(zhì)分子進(jìn)入處于固定相孔穴內(nèi)的靜止流動(dòng)相中，晚回到流路中而引起峰展寬。Hsm對峰展寬的影響在整個(gè)傳質(zhì)過程中起著主要作用。固定相的顆粒越小，微孔孔徑越大，傳質(zhì)阻力就越小，傳質(zhì)速率越高。所以改進(jìn)固定相結(jié)構(gòu)，減小靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻力，是提高液相色譜柱效的關(guān)鍵。

Hm和Hsm都與固定相的粒徑平方d2p成正比，與擴(kuò)散系數(shù)Dm成反比。因此應(yīng)采用低粒度固定相和低粘度流動(dòng)相。高柱溫可以增大Dm，但用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相時(shí)，易產(chǎn)生氣泡，因此一般采用室溫。

③固定相傳質(zhì)阻抗Hs＝Csd2fu/Ds（液液分配色譜），Cs為常數(shù)，df為固定液的液膜厚度，Ds為分子在固定液中的擴(kuò)散系數(shù)。在分配色譜中Hs與df的平方成正比，在吸附色譜中Hs與吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂層固定液、深孔離子交換樹脂或解吸速度慢的吸附色譜中，Hs才有明顯影響。采用單分子層的化學(xué)鍵合固定相時(shí)Hs可以忽略。

從速率方程式可以看出，要獲得高效能的色譜分析，一般可采用以下措施：①進(jìn)樣時(shí)間要短。②填料粒度要小。③改善傳質(zhì)過程。過高的吸附作用力可導(dǎo)致嚴(yán)重的峰展寬和拖尾，甚至不可逆吸附。④適當(dāng)?shù)牧魉佟Ｒ訦對u作圖，則有一最佳線速度uopt，在此線速度時(shí)，H最小。一般在液相色譜中，uopt很小（大約0.03~0.1mm/s），在這樣的線速度下分析樣品需要很長時(shí)間，一般來說都選在1mm/s的條件下操作。⑤較小的檢測器死體積。3．柱外效應(yīng)

速率理論研究的是柱內(nèi)峰展寬因素，實(shí)際在柱外還存在引起峰展寬的因素，即柱外效應(yīng)（色譜峰在柱外死空間里的擴(kuò)展效應(yīng)）。色譜峰展寬的總方差等于各方差之和，即：

σ2＝σ2柱內(nèi)＋σ2柱外＋σ2其它柱外效應(yīng)主要由低劣的進(jìn)樣技術(shù)、從進(jìn)樣點(diǎn)到檢測池之間除柱子本身以外的所有死體積所引起。為了減少柱外效應(yīng)，首先應(yīng)盡可能減少柱外死體積，如使用"零死體積接頭"連接各部件，管道對接宜呈流線形，檢測器的內(nèi)腔體積應(yīng)盡可能小。研究表明柱外死體積之和應(yīng)＜VR/。其次，希望將樣品直接進(jìn)在柱頭的中心部位，但是由于進(jìn)樣閥與柱間有接頭，柱外效應(yīng)總是存在的。此外，要求進(jìn)樣體積≤VR/2。

柱外效應(yīng)的直觀標(biāo)志是容量因子k小的組分（如k＜2）峰形拖尾和峰寬增加得更為明顯；k大的組分影響不顯著。由于HPLC的特殊條件，當(dāng)柱子本身效率越高（N越大），柱尺寸越小時(shí)，柱外效應(yīng)越顯得突出。而在經(jīng)典LC中則影響相對較小。

III．HPLC系統(tǒng)

HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關(guān)鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、預(yù)柱或保護(hù)柱、柱溫控制器等，現(xiàn)代HPLC儀還有微機(jī)控制系統(tǒng)，進(jìn)行自動(dòng)化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。制備型HPLC儀還備有自動(dòng)餾分收集裝置。

最早的液相色譜儀由粗糙的高壓泵、低效的柱、固定波長的檢測器、繪圖儀，繪出的峰是通過手工測量計(jì)算峰面積。后來的高壓泵精度很高并可編程進(jìn)行梯度洗脫，柱填料從單一品種發(fā)展至幾百種類型，檢測器從單波長至可變波長檢測器、可得三維色譜圖的二極管陣列檢測器、可確證物質(zhì)結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜檢測器。數(shù)據(jù)處理不再用繪圖儀，逐漸取而代之的是最簡單的積分儀、計(jì)算機(jī)、工作站及網(wǎng)絡(luò)處理系統(tǒng)。

目前常見的HPLC儀生產(chǎn)廠家國外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、島津公司等，國內(nèi)有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。一、輸液泵1．泵的構(gòu)造和性能

輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性。輸液泵應(yīng)具備如下性能：①流量穩(wěn)定，其RSD應(yīng)＜0.5%，這對定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要；②流量范圍寬，分析型應(yīng)在0.1~10ml/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型應(yīng)能達(dá)到100ml/min；③輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到150~300kg/cm2；④液缸容積??；⑤密封性能好，耐腐蝕。

泵的種類很多，按輸液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵。恒流泵按結(jié)構(gòu)又可分為螺旋注射泵、柱塞往復(fù)泵和隔膜往復(fù)泵。恒壓泵受柱阻影響，流量不穩(wěn)定；螺旋泵缸體太大，這兩種泵已被淘汰。目前應(yīng)用最多的是柱塞往復(fù)泵。柱塞往復(fù)泵的液缸容積小，可至0.1ml，因此易于清洗和更換流動(dòng)相，特別適合于再循環(huán)和梯度洗脫；改變電機(jī)轉(zhuǎn)速能方便地調(diào)節(jié)流量，流量不受柱阻影響；泵壓可達(dá)400kg/cm2。其主要缺點(diǎn)是輸出的脈沖性較大，現(xiàn)多采用雙泵系統(tǒng)來克服。雙泵按連接方式可分為并聯(lián)式和串聯(lián)式，一般說來并聯(lián)泵的流量重現(xiàn)性較好（RSD為0.1%左右，串聯(lián)泵為0.2~0.3%），但出故障的機(jī)會(huì)較多（因多一單向閥），價(jià)格也較貴。各品牌輸液泵的基本參數(shù)：項(xiàng)目Waters515型HP1100型LC-10ATvp型EliteP200II型檢定要求流速范圍0.001~100.001~100.001~9.9990.01~4.99

調(diào)節(jié)精度0.0010.0010.0010.01

流量精密度RSD0.1%0.15%（<0.3%）0.3%0.5%1.5%流量準(zhǔn)確度

±2.0%

最高壓力4000Psi40MPa39.2MPa40.0MPa

密封圈壽命

流動(dòng)相的脈沖

2．泵的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)

為了延長泵的使用壽命和維持其輸液的穩(wěn)定性，必須按照下列注意事項(xiàng)進(jìn)行操作：

①防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，因?yàn)閴m埃或其它任何雜質(zhì)微粒都會(huì)磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥，因此應(yīng)預(yù)先除去流動(dòng)相中的任何固體微粒。流動(dòng)相最好在玻璃容器內(nèi)蒸餾，而常用的方法是濾過，可采用Millipore濾膜（0.2µm或0.45µm）等濾器。泵的入口都應(yīng)連接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或更換。

②流動(dòng)相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動(dòng)相不應(yīng)保留在泵內(nèi)，尤其是在停泵過夜或更長時(shí)間的情況下。如果將含緩沖液的流動(dòng)相留在泵內(nèi)，由于蒸發(fā)或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細(xì)晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護(hù)的溶劑（對于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。

③泵工作時(shí)要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動(dòng)相被用完，否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)也會(huì)磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液。

④輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會(huì)使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。

⑤流動(dòng)相應(yīng)該先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。如果輸液泵產(chǎn)生故障，須查明原因，采取相應(yīng)措施排除故障：

①?zèng)]有流動(dòng)相流出，又無壓力指示。原因可能是泵內(nèi)有大量氣體，這時(shí)可打開泄壓閥，使泵在較大流量（如5ml/min）下運(yùn)轉(zhuǎn)，將氣泡排盡，也可用一個(gè)50ml針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個(gè)可能原因是密封環(huán)磨損，需更換。

②壓力和流量不穩(wěn)。原因可能是氣泡，需要排除；或者是單向閥內(nèi)有異物，可卸下單向閥，浸入丙酮內(nèi)超聲清洗。有時(shí)可能是砂濾棒內(nèi)有氣泡，或被鹽的微細(xì)晶粒或滋生的微生物部分堵塞，這時(shí)，可卸下砂濾棒浸入流動(dòng)相內(nèi)超聲除氣泡，或?qū)⑸盀V棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）內(nèi)迅速除去微生物，或?qū)Ⅺ}溶解，再立即清洗。

③壓力過高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時(shí)應(yīng)逐段進(jìn)行。3．梯度洗脫

HPLC有等強(qiáng)度(isocratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式。等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動(dòng)相組成保持恒定，適合于組分?jǐn)?shù)目較少，性質(zhì)差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個(gè)分析周期內(nèi)程序控制流動(dòng)相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度和pH值等，用于分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)差異較大的復(fù)雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時(shí)間，提高分離度，改善峰形，提高檢測靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。

梯度洗脫有兩種實(shí)現(xiàn)方式：低壓梯度（外梯度）和高壓梯度（內(nèi)梯度）。

兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合，即有多種洗脫曲線：線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性梯度最常用，尤其適合于在反相柱上進(jìn)行梯度洗脫。

在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來一些特殊問題，必須充分重視：

①要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相。有些溶劑在一定比例內(nèi)混溶，超出范圍后就不互溶，使用時(shí)更要引起注意。當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖液混合時(shí)，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時(shí)需特別小心。

②梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰，因?yàn)槿跞軇┲械碾s質(zhì)富集在色譜柱頭后會(huì)被強(qiáng)溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時(shí)產(chǎn)生氣泡。

③混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時(shí)常出現(xiàn)壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當(dāng)二者以相近比例混合時(shí)粘度增大很多，此時(shí)的柱壓大約是甲醇或水為流動(dòng)相時(shí)的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。

④每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進(jìn)行再生處理，使其恢復(fù)到初始狀態(tài)。需讓10~30倍柱容積的初始流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動(dòng)相達(dá)到完全平衡。二、進(jìn)樣器

早期使用隔膜和停流進(jìn)樣器，裝在色譜柱入口處?，F(xiàn)在大都使用六通進(jìn)樣閥或自動(dòng)進(jìn)樣器。進(jìn)樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)對色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。HPLC進(jìn)樣方式可分為：隔膜進(jìn)樣、停流進(jìn)樣、閥進(jìn)樣、自動(dòng)進(jìn)樣。1．隔膜進(jìn)樣。用微量注射器將樣品注入專門設(shè)計(jì)的與色譜柱相連的進(jìn)樣頭內(nèi)，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，可以獲得最佳的柱效，且價(jià)格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用（如10MPa以上）；此外隔膜容易吸附樣品產(chǎn)生記憶效應(yīng)，使進(jìn)樣重復(fù)性只能達(dá)到1~2%；加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規(guī)分析使用受到限制。2．停流進(jìn)樣?？杀苊庠诟邏合逻M(jìn)樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動(dòng)時(shí)往往會(huì)出現(xiàn)"鬼峰"；另一缺點(diǎn)是保留時(shí)間不準(zhǔn)。在以峰的始末信號(hào)控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。3．閥進(jìn)樣。一般HPLC分析常用六通進(jìn)樣閥（以美國Rheodyne公司的7725和7725i型最常見），其關(guān)鍵部件由圓形密封墊（轉(zhuǎn)子）和固定底座（定子）組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進(jìn)樣（約下降5~10%左右），但耐高壓（35~40MPa），進(jìn)樣量準(zhǔn)確，重復(fù)性好（0.5%），操作方便。

六通閥的進(jìn)樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。①用部分裝液法進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量應(yīng)不大于定量環(huán)體積的50%（最多75％），并要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同。此法進(jìn)樣的準(zhǔn)確度和重復(fù)性決定于注射器取樣的熟練程度，而且易產(chǎn)生由進(jìn)樣引起的峰展寬。②用完全裝液法進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量應(yīng)不小于定量環(huán)體積的5~10倍（最少3倍），這樣才能完全置換定量環(huán)內(nèi)的流動(dòng)相，消除管壁效應(yīng)，確保進(jìn)樣的準(zhǔn)確度及重復(fù)性。

六通閥使用和維護(hù)注意事項(xiàng)：①樣品溶液進(jìn)樣前必須用0.45µm濾膜過濾，以減少微粒對進(jìn)樣閥的磨損。②轉(zhuǎn)動(dòng)閥芯時(shí)不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動(dòng)相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增，甚至超過泵的最大壓力；再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位時(shí)，過高的壓力將使柱頭損壞。③為防止緩沖鹽和樣品殘留在進(jìn)樣閥中，每次分析結(jié)束后應(yīng)沖洗進(jìn)樣閥。通?？捎盟疀_洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。4．自動(dòng)進(jìn)樣。用于大量樣品的常規(guī)分析。三、色譜柱

色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機(jī)聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10μm等，柱效理論值可達(dá)5~16萬/米。對于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效；對于同系物分析，只要500即可；對于較難分離物質(zhì)對則可采用高達(dá)2萬的柱子，因此一般10~30cm左右的柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要。

柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達(dá)到最佳效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結(jié)構(gòu)（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術(shù)。即使最好的裝填技術(shù)，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應(yīng)對柱效的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于管壁效應(yīng)。1．柱的構(gòu)造

色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70kg/cm2時(shí)，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應(yīng)，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光。也有人在不銹鋼柱內(nèi)壁涂敷氟塑料以提高內(nèi)壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細(xì)管柱。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金，孔徑0.2~20µm(5~10µm)，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。

色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規(guī)格也不同：①常規(guī)分析柱（常量柱），內(nèi)徑2~5mm（常用4.6mm，國內(nèi)有4mm和5mm），柱長10~30cm；②窄徑柱（narrowbore，又稱細(xì)管徑柱、半微柱semi-microcolumn），內(nèi)徑1~2mm，柱長10~20cm；③毛細(xì)管柱（又稱微柱microcolumn），內(nèi)徑0.2~0.5mm；④半制備柱，內(nèi)徑＞5mm；⑤實(shí)驗(yàn)室制備柱，內(nèi)徑20~40mm，柱長10~30cm；⑥生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應(yīng)。2．柱的發(fā)展方向因強(qiáng)調(diào)分析速度而發(fā)展出短柱，柱長3~10cm，填料粒徑2~3µm。為提高分析靈敏度，與質(zhì)譜(MS)聯(lián)接，而發(fā)展出窄徑柱、毛細(xì)管柱和內(nèi)徑小于0.2mm的微徑柱（microbore）。細(xì)管徑柱的優(yōu)點(diǎn)是：①節(jié)省流動(dòng)相；②靈敏度增加；③樣品量少；④能使用長柱達(dá)到高分離度；⑤容易控制柱溫；⑥易于實(shí)現(xiàn)LC-MS聯(lián)用。但由于柱體積越來越小，柱外效應(yīng)的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器（甚至采用柱上檢測），更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設(shè)備應(yīng)具備如下性能：輸液泵能精密輸出1~100µl/min的低流量，進(jìn)樣閥能準(zhǔn)確、重復(fù)地進(jìn)樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測器，電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜儀在這方面具有突出優(yōu)點(diǎn)。3．柱的填充和性能評價(jià)

色譜柱的性能除了與固定相性能有關(guān)外，還與填充技術(shù)有關(guān)。在正常條件下，填料粒度＞20µm時(shí)，干法填充制備柱較為合適；顆粒＜20µm時(shí)，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種：①高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；②徑向加壓法，Waters專利；③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；④干法。柱填充的技術(shù)性很強(qiáng)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商品柱。必須指出，高效液相色譜柱的獲得，裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié)，但根本問題還在于填料本身性能的優(yōu)劣，以及配套的色譜儀系統(tǒng)的的結(jié)構(gòu)是否合理。

無論是自己裝填的還是購買的色譜柱，使用前都要對其性能進(jìn)行考察，使用期間或放置一段時(shí)間后也要重新檢查。柱性能指標(biāo)包括在一定實(shí)驗(yàn)條件下（樣品、流動(dòng)相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復(fù)性在±5%或±10%以內(nèi)。進(jìn)行柱效比較時(shí)，還要注意柱外效應(yīng)是否有變化。一份合格的色譜柱評價(jià)報(bào)告應(yīng)給出柱的基本參數(shù)，如柱長、內(nèi)徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。4．柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護(hù)色譜柱。①避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過緩（如前所述）。②應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬粗嗳?。③一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。④選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠"飽和"，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。⑤避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。⑥經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí)，對流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50~75ml。

下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴(yán)格脫水。甲醇能洗去殘留的強(qiáng)極性雜質(zhì)，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動(dòng)相不含緩沖液，那么可以省略最后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質(zhì)，在甲醇（乙腈）沖洗時(shí)重復(fù)注射100~200µl四氫呋喃數(shù)次有助于除去強(qiáng)疏水性雜質(zhì)。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時(shí)也注射二甲亞砜數(shù)次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質(zhì)污染。陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強(qiáng)的鹽，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機(jī)物）、甲醇、水依次沖洗。

⑦保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時(shí)間。⑧色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。

在后兩種情況發(fā)生時(shí)，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內(nèi)填料整平。然后用適當(dāng)溶劑濕潤的固定相（與柱內(nèi)相同）填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復(fù)到新柱的水平。

柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保護(hù)、延長柱壽命的作用。采用保護(hù)柱會(huì)損失一定的柱效，這是值得的。

通常色譜柱壽命在正確使用時(shí)可達(dá)2年以上。以硅膠為基質(zhì)的填料，只能在pH2~9范圍內(nèi)使用。柱子使用一段時(shí)間后，可能有一些吸附作用