關于微生物發酵產酶第一頁，共一百零八頁，2022年，8月28日酶的生產方法提取分離法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化學合成(chemicalsynthesis)SOD-bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea……organ/tissue/cellAmylasefromBacillusProteasefromBacillusPhosphatasefromBacillusGlucoamylasefromAspergillus……PlantcellcultureAnimalcellcultureFewexample第二頁，共一百零八頁，2022年，8月28日一酶生物合成過程（一）中心法則-CentralDogma（二）RNA的生物合成-Transcription（三）蛋白質的生物合成-Translation（四）酶生物合成的調節-Regulation第三頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（一）中心法則-CentralDogmaReversetranscription第四頁，共一百零八頁，2022年，8月28日Replication復制：親代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成與親代相同的子代DNA或RNA的過程。Transcription轉錄：以DNA為模板，按照堿基配對原則將其所含的遺傳信息傳給RNA，形成一條與DNA鏈互補的RNA的過程。Translation翻譯：亦叫轉譯，以mRNA為模板，將mRNA的密碼解讀成蛋白質的AA順序的過程。Reversetranslation逆轉錄：以RNA為模板，在逆轉錄酶的作用下，生成DNA的過程。（一）中心法則-CentralDogma第五頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（二）RNA的生物合成-Transcription細胞內RNA的生物功能(1)某些RNA病毒，其所含的雙鏈RNA作為遺傳信息的載體。(2)在蛋白質生物合成過程中，各種RNA起著重要的作用。其中，tRNA作為氨基酸載體，并由其上的反密碼子識別mRNA分子上的密碼子；mRNA作為蛋白質合成的模板，由其分子上的三聯體密碼控制蛋白質分子中氨基酸的排列順序；rRNA與蛋白質一起組成核糖核蛋白體（核糖體），作為蛋白質生物合成的場所。(3)某些RNA具有生物催化活性，屬于核酸類酶，在一定條件下，可以催化有關的生化反應。(4)各小分子RNA在分子修飾和代謝調節等方面有重要作用。第六頁，共一百零八頁，2022年，8月28日轉錄過程起始位點的識別recognition轉錄起始initiation鏈的延伸elongation轉錄終止termination轉錄后加工modification第七頁，共一百零八頁，2022年，8月28日TheE.coliRNApolymeraseholoenzymeconsistsofsixsubunits:a2bb’s.PossiblecatalyticsubunitsPromoterspecificityEnzymeassembly,promoterrecognition,activatorbindingRoleunknown(notneededinvitro)36.5kDa15115511kDa(32-90kDa)第八頁，共一百零八頁，2022年，8月28日第九頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（三）蛋白質的生物合成-Translation翻譯:以RNA中mRNA為模板，按照其核苷酸順序所組成的密碼指導蛋白質的合成的過程。mRNA蛋白質翻譯

各種信息

各種蛋白質（核苷酸排列順序）

（氨基酸排列順序）第十頁，共一百零八頁，2022年，8月28日蛋白質合成的幾個要素-mRNA(模板，template)mRNA是帶有DNA遺傳信息指導蛋白質合成的直接模板。以mRNA為模板，合成一定結構的多肽鏈的過程(翻譯)，就是將mRNA分子中的核苷酸排列順序轉變成蛋白質分子中的氨基酸排列順序。第十一頁，共一百零八頁，2022年，8月28日蛋白質合成的幾個要素-遺傳密碼,nucleotidetripletcodonmRNA分子中，每三個相鄰的核苷酸組成的三聯體代表某種氨基酸或其它信息，稱為密碼子或三聯密碼。四種核苷酸編成三聯體可形成64個密碼子。其中：一個起始密碼:AUG三個終止密碼:UAAUGAUAG多數氨基酸擁有2-4個密碼第十二頁，共一百零八頁，2022年，8月28日第十三頁，共一百零八頁，2022年，8月28日蛋白質合成的幾個要素-轉運RNA(transporter)tRNA是氨基酸的轉運工具，攜帶活化的氨基酸到核蛋白體。tRNA有特異性，至少有20種。每種tRNA的反密碼環頂端均有由三個核苷酸組成的反密碼，能與mRNA上相應的密碼互補結合。第十四頁，共一百零八頁，2022年，8月28日酪5’5’AUGGUUUACACA酪氨酰-tRNA反密碼mRNA密碼(codon)與反密碼(anticodon)的堿基配對第十五頁，共一百零八頁，2022年，8月28日核糖體（或稱核糖核蛋白體）由蛋白質和rRNA組成。是存在于細胞質內的微小顆粒。蛋白質合成的幾個要素-核糖體，ribosome第十六頁，共一百零八頁，2022年，8月28日其他輔助因子工具酶蛋白質合成的幾個要素-其他因子和酶第十七頁，共一百零八頁，2022年，8月28日蛋白質的合成過程肽鏈合成的起始initiation肽鏈合成的延伸elongation肽鏈合成的終止與釋放terminationandrelease合成多肽的輸送和加工transportandmodification蛋白質分子的折疊folding第十八頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（四）酶生物合成的調節-Regulation基因水平的表達控制酶含量的調節操縱子（operon）：是一組功能上相關，受同一調控區控制的基因組成的一個遺傳單位。第十九頁，共一百零八頁，2022年，8月28日基因操縱子調節系統示意圖

調節基因

啟動基因操縱基因結構基因

DNA

轉錄

（-）

RNA聚合酶（+）轉錄

翻譯

mRNA

翻譯

阻遏蛋白

蛋白質

誘導劑

控制區信息區操縱子第二十頁，共一百零八頁，2022年，8月28日ABEX底物水平的調節酶水平的調節

酶活性的調節酶含量的調節酶的定位調節輔助因子調節生長發育的不同時期外界環境變化酶合成與分解速度的變化（基因表達調控）產物調節細胞內酶的調控模式第二十一頁，共一百零八頁，2022年，8月28日酶在細胞內的含量取決于酶的合成速度和分解速度。細胞根據自身活動需要，嚴格控制細胞內各種酶的合理含量，從而對各種生物化學過程進行調控。酶濃度調節的化學本質是基因表達的調節。在細胞內，所合成的酶的種類及數量是由特殊的基因信息決定的。DNA所攜帶的酶蛋白遺傳信息，需要通過轉錄和翻譯而合成酶蛋白。在細胞內進行的轉錄或翻譯過程都有特定的調節控制機制，其中轉錄的調控占主導地位。因此，基因表達的調控主要在轉錄水平上進行。第二十二頁，共一百零八頁，2022年，8月28日

酶合成調節的類型①誘導(induction)

組成酶：細胞固有的酶類。誘導酶：是細胞為適應外來底物或其結構類似物而臨時合成的一類酶。②阻遏(repression)分解代謝物阻遏(cataboliterepression)反饋阻遏(feedbackrepression)第二十三頁，共一百零八頁，2022年，8月28日3酶合成的調節機制

①酶合成的誘導加進某種物質，使酶生物合成開始或加速進行。酶合成誘導的現象：已知分解利用乳糖的酶有：

-半乳糖苷酶；-半乳糖苷透過酶；硫代半乳糖苷轉乙酰酶。實驗：（1）大腸桿菌生長在葡萄糖培養基上時，細胞內無上述三種酶合成；（2）大腸桿菌生長在乳糖培養基上時，細胞內有上述三種酶合成；（3）表明菌體生物合成的經濟原則：需要時才合成。第二十四頁，共一百零八頁，2022年，8月28日調節基因操縱基因乳糖結構基因PLacZLacYLacamRNA

阻遏蛋白（有活性）基因關閉啟動子ORPLacZLacYLaca調節基因操縱基因乳糖結構基因啟動子ORmRNAZmRNAYmRNAa

阻遏蛋白（無活性）基因表達mRNAA、乳糖操縱子的結構

B、乳糖酶的誘導

乳糖

阻遏蛋白（有活性）誘導第二十五頁，共一百零八頁，2022年，8月28日②末端產物阻遏

由某代謝途徑末端產物的過量累積引起的阻遏。

酶合成阻遏的現象：

實驗：

（1）大腸桿菌生長在無機鹽和葡萄糖的培養基上時，檢測到細胞內有色氨酸合成酶的存在；

（2）在上述培養基中加入色氨酸，檢測發現細胞內色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。

（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現了菌體生長的經濟原則:不需要就不合成。第二十六頁，共一百零八頁，2022年，8月28日

色氨酸操縱子——酶的阻遏調節基因操縱基因結構基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結合，結構基因表達調節基因操縱基因結構基因輔阻遏物代謝產物與阻遏蛋白結合，使之構象發生變化與操縱基因結合，結構基因不能表達第二十七頁，共一百零八頁，2022年，8月28日酶的誘導和阻遏操縱子模型B.有活性阻遏蛋白加誘導劑A.有活性阻遏蛋白C.無活性阻遏蛋白D.無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑操縱基因啟動基因調節基因結構基因

阻遏蛋白(有活性)阻遏蛋白阻擋操縱基因結構基因不表達誘導物誘導物與阻遏蛋白結合,使阻遏蛋白不能起到阻擋操縱基因的作用,結構基因可以表達酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操縱基因結合,結構基因可以表達阻遏蛋白(無活性)酶蛋白mRNA代謝產物與阻遏蛋白結合,從而使阻遏蛋白能夠阻擋操縱基因,結構基因不表達代謝產物第二十八頁，共一百零八頁，2022年，8月28日調控方式阻遏蛋白添加物與操縱基因結合阻遏效應舉例酶的誘導有活性－＋不轉錄，繼而不翻譯誘導物－轉錄，繼而翻譯乳糖操縱子酶的阻遏無活性－阻遏物＋不轉錄，繼而不翻譯色氨酸操縱子酶合成的誘導與阻遏操縱子模型調控作用對比第二十九頁，共一百零八頁，2022年，8月28日③分解代謝物阻遏指細胞內同時有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時，利用快的那種分解底物會阻遏利用慢的底物的有關酶合成的現象。分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的結果，而是通過甲碳源（或氮源等）在其分解過程中所產生的中間代謝物所引起的阻遏作用。第三十頁，共一百零八頁，2022年，8月28日分解代謝物阻遏現象：實驗：細菌在含有葡萄糖和乳糖的培養基上生長，優先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖，產生了兩個對數生長期中間隔開一個生長延滯期的“二次生長現象”(diauxie或biphasicgrowth）。

這一現象又稱葡萄糖效應，產生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此調節基因的產物是環腺苷酸受體蛋白（CRP）,亦稱降解物基因活化蛋白（CAP）。第三十一頁，共一百零八頁，2022年，8月28日分解代謝物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基因表達CAP基因結構基因TCAPOCAP結合部位RNA聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖分解代謝產物腺苷酸環化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物與cAMP的關系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（catabolicgeneactivationprotein）降低cAMP濃度使CAP呈失活狀態第三十二頁，共一百零八頁，2022年，8月28日二常見產酶微生物（一）基本要求：不是致病菌發酵周期短,產酶量高不易變異退化最好是產生胞外酶的菌種,利于分離。對醫藥和食品用酶,還應考慮安全性：凡從可食部分或食品加工中傳統使用的微生物生產的酶,安全!由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性實驗。非常見微生物制取酶,需做廣泛毒性實驗,包括慢性中毒實驗。第三十三頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（二）常見產酶微生物1.大腸埃希氏桿菌2.醋酸桿菌（Acetobacter）3.枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）4.根霉（Rhizopus）5.曲霉（Aspergillus）第三十四頁，共一百零八頁，2022年，8月28日1.大腸埃希氏桿菌簡稱大腸桿菌，是最為著名的原核生物。Escherich屬菌株和大多數大腸桿菌是無害，但也有些大腸桿菌是致病的，會引起腹瀉和尿路感染。大腸桿菌：易在實驗室操作、生長迅速，而且營養要求低。應用：作為宿主供大量細菌病毒生長繁殖是最早用作基因工程的宿主菌生產谷氨酸脫羧酶、天冬酰胺酶和制備天冬氨酸、蘇氨酸及纈氨酸。第三十五頁，共一百零八頁，2022年，8月28日2.醋酸桿菌（Acetobacter）應用：有機酸(食醋等）；葡萄糖異構酶(高果糖漿)；山梨糖(維C中間體）。菌體從橢圓至桿狀，單個、成對或成鏈，革蘭氏陰性，運動（周毛）或不運動，不生芽孢。好氣。在含糖、乙醇和酵母膏的培養基上生長良好。第三十六頁，共一百零八頁，2022年，8月28日3.枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）直狀、近直狀的桿菌，周生或側生鞭毛，革蘭氏陽性，無莢膜，芽孢0.5×1.51.8m，中生或近中生。枯草芽孢桿菌是工業發酵的重要菌種之一。生產淀粉酶、蛋白酶、5’-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。第三十七頁，共一百零八頁，2022年，8月28日4.根霉（Rhizopus）因有假根（Rhizoid）而得名。分布于土壤、空氣中，常見于淀粉食品上，可引起霉腐變質和水果、蔬菜的腐爛。應用：根霉能產生一些酶類，如淀粉酶、果膠酶、脂肪酶等；在釀酒工業上常用做糖化菌；有些能產生乳酸、延胡索酸等有機酸。第三十八頁，共一百零八頁，2022年，8月28日5.曲霉（Aspergillus）分布：廣泛分布于土壤、空氣和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐變質，有的產生致癌性黃曲霉毒素。代表種：黑曲霉Asp.Niger、黃曲霉Asp.flavus應用：是制醬、釀酒、制醋的主要菌種；是生產酶制劑（蛋白酶、淀粉酶、果膠酶）的菌種；生產有機酸（如檸檬酸、葡萄糖酸等）；用作生產糖化飼料的菌種。第三十九頁，共一百零八頁，2022年，8月28日酵母(1)啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)啤酒酵母是啤酒工業上廣泛應用的酵母。細胞由圓形、卵形、橢圓形到臘腸形。在麥芽汁培養基上，菌落為白色，有光澤，平滑，邊緣整齊。營養細胞可以直接變為子囊，每個子囊含有1～4個圓形光亮的子囊孢子。啤酒酵母除了主要用于啤酒、酒類的生產外，還可以用于轉化酶、丙酮酸脫羧酶、醇脫氫酶等的生產。(2)假絲酵母(Candida)假絲酵母的細胞圓形，卵形或長形。無性繁殖為多邊芽殖，形成假菌絲，也有真菌絲，可生成無節孢子、子囊孢子、冬孢子或擲孢子。不產生色素。在麥芽汁瓊脂培養基上，菌落呈乳白色或奶油色。假絲酵母可以用于生產脂肪酶、尿酸酶、尿囊素酶、轉化酶、醇脫氫酶等。具有較強的17-羥基化酶，可以用于甾體轉化。第四十頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（三）產酶微生物的分離和篩選樣品的采集:從富含該酶作用底物的場所采集樣品富集培養:投其所好，取其所抗分離：獲得微生物的純培養（pureculture）。初篩：選出產酶菌種，以多為主。復篩：選出產酶水平相對較高的菌株，以質為主。1.方法：第四十一頁，共一百零八頁，2022年，8月28日第四十二頁，共一百零八頁，2022年，8月28日2.產酶微生物優良菌種的選育

誘變育種原生質體融合育種基因工程育種第四十三頁，共一百零八頁，2022年，8月28日3.微生物發酵產酶方法（1）固體培養:特別適合于霉菌培養（2）液體培養:目前酶發酵生產的主要方式（3）固定化細胞:需要特殊的固定化細胞反應器第四十四頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（四）微生物酶的類型1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、果膠酶），是微生物為了利用環境中的大分子而釋放到細胞外的，即使胞外濃度很高，胞內也能維持較低水平，受到的調節控制少。

2.胞內酶：指合成后仍留在細胞內發揮作用的酶，酶活性和濃度受到中間產物和終產物的調控。第四十五頁，共一百零八頁，2022年，8月28日

植物、動物、微生物細胞的特性比較細胞種類植物細胞微生物細胞動物細胞細胞大小/um200～3001～1010～100倍增時間/h﹥120.3-6﹥15營養要求簡單簡單復雜光照要求大多數要求不要求不要求對剪切力敏感大多數不敏感非常敏感主要產物色素、藥物、香精、酶等醇、有機酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等疫苗、激素、單克隆抗體、酶等第四十六頁，共一百零八頁，2022年，8月28日三酶的發酵工藝條件及控制第四十七頁，共一百零八頁，2022年，8月28日三酶的發酵工藝條件及控制（一）培養基（二）發酵條件及控制（三）提高產酶的措施第四十八頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（一）培養基第四十九頁，共一百零八頁，2022年，8月28日1.培養基的設計原則選擇適宜的營養物質，營養物的濃度及配比合適物理、化學條件適宜，經濟節約精心設計、試驗比較培養不同的微生物必須采用不同的培養條件；培養目的不同，原料的選擇和配比不同；不同階段，培養條件也有所差異。第五十頁，共一百零八頁，2022年，8月28日任何培養基都應該具備微生物生長所需要五大營養要求；培養基（medium）是人工配制的，適合微生物生長繁殖或產生代謝產物的營養基質。培養基幾乎是一切對微生物進行研究和利用工作的基礎；五大要素：碳源、氮源、無機鹽、生長因子、水。1.培養基的設計原則第五十一頁，共一百零八頁，2022年，8月28日水是微生物最基本的組成分（70%~95%）水是微生物體內和體外的溶劑（吸收營養成分和代謝廢物）水是細胞質組分，直接參與各種代謝活動調節細胞溫度和保持環境溫度的穩定（比熱高，傳熱快）水第五十二頁，共一百零八頁，2022年，8月28日常用碳源：糖類、醇類、脂類、有機酸、烴類、蛋白質及其降解物異養微生物：糖類是最好碳源（葡萄糖最為通用）碳源選擇合適碳源，以適應目的酶的合成調節機制對于一些特殊的產酶菌需要特殊的碳源，如利用黃青霉生產葡萄糖氧化酶，以甜菜作碳源就達不到產酶目的，而以蔗糖為碳源時產酶量顯著提高；第五十三頁，共一百零八頁，2022年，8月28日構成細胞物質和代謝產物中氮素（不能用作能源）氮源有機氮源蛋白胨、酵母膏、牛肉膏無機氮源銨鹽、硝酸鹽氮源需要注意合適的碳氮比一般生產蛋白酶、淀粉酶多用豆餅、花生餅等有機氮源，原因是高分子氮對酶的誘導作用；而生產纖維素酶時多用無機氮源，因為有機氮會促進菌體的生長繁殖，對產酶不利。第五十四頁，共一百零八頁，2022年，8月28日不同的細胞對氮源有不同的要求。應當根據細胞的營養要求進行選擇和配置。一般說來，動物細胞要求有機氮源；植物細胞主要使用無機氮源；微生物細胞中，異養型細胞要求有機氮源，自養型細胞可以采用無機氮源。碳和氮兩者的比例，即碳氮比（C/N），對酶的產量有顯著影響。所謂碳氮比一般是指培養基中碳元素（C）的總量與氮元素（N）總量之比。第五十五頁，共一百零八頁，2022年，8月28日參與酶的組成、構成酶活性基團、激活酶活性維持細胞結構的穩定性，調節細胞滲透壓控制細胞的氧化還原電位有時可作某些微生物生長的能源物質常用：硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物及鉀、鈉、鈣、鎂、鐵等元素的化合物。無機鹽一般的無機鹽在低濃度情況下有利于酶產量的提高，而高濃度對產酶有抑制作用第五十六頁，共一百零八頁，2022年，8月28日生長因子生長因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物質進行合成，而必須另外加入少量的生長需求的有機物質。分類：依據化學結構分成維生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及衍生物和類脂成分等四類。功能：以輔酶與輔基的形式參與代謝中的酶促反應實驗室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作為各種生長因子的需要，麥芽汁、米曲汁等天然培養基中本身含有各種生長因子。第五十七頁，共一百零八頁，2022年，8月28日在酶的發酵生產中，一般在培養基中添加含有多種生長因素的天然原料的水解物，如酵母膏、玉米漿、麥芽汁、麩皮水解液等，以提供細胞所需的各種生長因素。也可以加入某種或某幾種提純的有機化合物，以滿足細胞生長繁殖之需。第五十八頁，共一百零八頁，2022年，8月28日細菌：牛肉膏蛋白胨培養基（或簡稱普通肉湯培養基）；放線菌：高氏1號合成培養基培養；酵母菌：麥芽汁培養基；霉菌：查氏合成培養基；2.實驗室的常用培養基第五十九頁，共一百零八頁，2022年，8月28日例如枯草芽孢桿菌：一般培養：肉湯培養基或LB培養基；自然轉化：基礎培養基；觀察芽孢：生孢子培養基；產蛋白酶：以玉米粉、黃豆餅粉為主的產酶培養基；2.實驗室的常用培養基第六十頁，共一百零八頁，2022年，8月28日枯草桿菌BF7658α-淀粉酶發酵培養基：玉米粉8%，豆餅粉4%，磷酸氫二鈉0.8%，硫酸銨0.4%，氯化鈣0.2%，氯化按0.15%（自然pH）。枯草桿菌AS1.398中性蛋白酶發酵培養基：玉米粉4%，豆餅粉3%，麩皮3.2%,糠1%,磷酸氫二鈉0.4%,磷酸二氫鉀0.03%（自然pH）。黑曲霉糖化酶發酵培養基：玉米粉10%，豆餅粉4%，麩皮1%（pH4.4～5.0）。地衣芽孢桿菌2709堿性蛋白酶發酵培養基：玉米粉5.5%,豆餅4%,磷酸氫二鈉0.4%,磷酸二氫鉀0.03%(pH8.5)。黑曲霉AS3.350酸性蛋白酶發酵培養基:玉米粉6%,豆餅粉4%,玉米漿0.6%,氯化鈣0.5%,氯化銨1%,磷酸氫二鈉0.2%(pH5.5)。2.實驗室的常用培養基第六十一頁，共一百零八頁，2022年，8月28日游動放線菌葡萄糖異構酶發酵培養基：糖蜜2%，豆餅粉2%，磷酸氫二鈉0。1%，硫酸鎂0。05%(pH7.2)。桔青霉磷酸二酯酶發酵培養基：淀粉水解糖5%，蛋白胨0.5%,硫酸鎂0.05%,氯化鈣0.04%,磷酸氫二鈉0.05%,磷酸二氫鉀0.05%(自然pH)。黑曲霉AS3.396果膠酶發酵培養基:麩皮5%,果膠0.3%,硫酸銨2%,磷酸二氫鉀0.25%,硫酸鎂0.05%,硝酸鈉0.02%,硫酸亞鐵0.001%(自然pH)。枯草桿菌AS1.398堿性磷酸酶發酵培養基:葡萄糖0.4%,乳蛋白水解物0.1%,硫酸銨1%,氯化鉀0.1%,氯化鈣0.1mmol/L,氯化鎂1.0mmol/L,磷酸氫二鈉20mol/L(用pH7.4Tris-HCl緩沖液配制)第六十二頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（二）發酵條件及控制培養基的pH必須控制在一定的范圍內，以滿足不同類型微生物的生長繁殖或產生代謝產物。為了維持培養基pH的相對恒定，通常在培養基中加入pH緩沖劑，或在進行工業發酵時補加酸、堿。1.pH值的控制第六十三頁，共一百零八頁，2022年，8月28日通常培養條件：細菌與放線菌：pH7-7.5酵母菌和霉菌：pH4.5-6范圍內生長細胞發酵產酶最適pH與生長最適pH值往往有所不同。細胞生產某種酶的最適pH通常接近于該酶催化反應的最適pH。有些細胞可同時產生若干種酶，在生產過程中，通過控制培養基的pH值，往往可以改變各種酶之間的產量比例。1.pH值的控制第六十四頁，共一百零八頁，2022年，8月28日例如，采用米曲霉發酵生產蛋白酶時，當培養基的pH值為堿性時，主要生產堿性蛋白酶；培養基的pH值為中性時，主要生產中性蛋白酶；而在酸性的條件下，則以生產酸性蛋白酶為主。隨著細胞的生長繁殖和新陳代謝產物的積累,培養基的pH值往往會發生變化。這種變化的情況與細胞特性有關，也與培養基的組成成分以及發酵工藝條件密切相關。第六十五頁，共一百零八頁，2022年，8月28日◆含糖量高的培養基，由于糖代謝產生有機酸，會使pH值向酸性方向移動；◆含蛋白質、氨基酸較多的培養基，經過代謝產生較多的胺類物質，使pH值向堿性方向移動；◆以硫酸銨為氮源時，隨著銨離子被利用，培養基中積累的硫酸根會使pH值降低；◆以尿素為氮源的，隨著尿素被水解生成氨，而使培養基的pH值上升，然后又隨著氨被細胞同化而使pH值下降；◆磷酸鹽的存在，對培養基的pH值變化有一定的緩沖作用。◆在氧氣供應不足時，由于代謝積累有機酸，可使培養基的pH值向酸性方向移動。第六十六頁，共一百零八頁，2022年，8月28日通常在生物學范圍內每升高10℃，生長速度加快一倍，溫度直接影響酶反應，對于微生物來說，溫度直接影響其生長和合成酶。2.溫度的控制有些細胞發酵產酶的最適溫度與細胞生長最適溫度有所不同，而且往往低于生長最適溫度。這是由于在較低的溫度條件下，可以提高酶所對應的mRNA的穩定性，增加酶生物合成的延續時間，從而提高酶的產量。枯草桿菌的最適生長溫度為34～37℃黑曲霉的最適生長溫度為28～32℃第六十七頁，共一百零八頁，2022年，8月28日在細胞生長和發酵產酶過程中，由于細胞的新陳代謝作用，會不斷放出熱量，使培養基的溫度升高，同時，由于熱量的不斷擴散，會使培養基的溫度不斷降低。為此必須經常及時地對溫度進行調節控制，使培養基的溫度維持在適宜的范圍內。◆溫度的調節一般采用熱水升溫、冷水降溫的方法。為了及時地進行溫度的調節控制，在發酵罐或其他生物反應器中，均應設計有足夠傳熱面積的熱交換裝置，如排管、蛇管、夾套、噴淋管等，并且隨時備有冷水和熱水，以滿足溫度調控的需要。第六十八頁，共一百零八頁，2022年，8月28日3.溶解氧的控制在酶的發酵生產過程中，處于不同生長階段的細胞，其細胞濃度和細胞呼吸強度各不相同，致使耗氧速率有很大的差別。因此必須根據耗氧量的不同，不斷供給適量的溶解氧。培養液中溶解氧的量，決定于在一定條件下氧氣的溶解速度。溶氧速率與通氣量、氧氣分壓、氣液接觸時間、氣液接觸面積以及培養液的性質等有密切關系。一般說來，通氣量越大、氧氣分壓越高、氣液接觸時間越長、氣液接觸面積越大，則溶氧速率越大。培養液的性質，主要是黏度、氣泡、以及溫度等對于溶氧速率有明顯影響。第六十九頁，共一百零八頁，2022年，8月28日3.溶解氧的控制調節通氣量調節氧的分壓調節氣液接觸時間調節氣液接觸面積改變培養液的性質控制溶氧方法第七十頁，共一百零八頁，2022年，8月28日調節氣液接觸面積

為了增大氣液兩相接觸面積，應是通過培養液的空氣盡量分散成小氣泡。

在發酵容器的底部安裝空氣分配管，使氣體分散成小氣泡進入培養液中，是增加氣液接觸面積的主要方法。

裝設攪拌裝置或增設擋板等可以使氣泡進一步打碎和分散，也可以有效地增加氣液接觸面積，從而提高溶氧速率。第七十一頁，共一百零八頁，2022年，8月28日酶發酵生產的一般工藝流程

第七十二頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（三）提高產酶的措施1.添加誘導物對于誘導酶的發酵生產，在發酵過程中的某個適宜的時機，添加適宜的誘導物，可以顯著提高酶的產量。例如，乳糖誘導β-半乳糖苷酶，纖維二糖誘導纖維素酶，蔗糖甘油單棕櫚酸誘導蔗糖酶的生物合成等。誘導物可以分3類：

酶的作用底物：青霉素是青霉素酰化酶的誘導物；

酶的催化反應產物：纖維二糖可誘導纖維素酶的產生；

底物的類似物：IPTG對β-半乳糖苷酶的效果要好于乳糖。第七十三頁，共一百零八頁，2022年，8月28日2.控制阻遏物的濃度據機理不同阻遏作用分為兩種：產物阻遏和分解代謝物阻遏。a.產物阻遏作用是由酶催化作用的產物或者代謝途徑的末端產物引起的阻遏作用。b.分解代謝物阻遏作用是由分解代謝物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物質經過分解代謝而產生的物質）引起的阻遏作用。控制阻遏物的濃度是解除阻遏、提高酶產量的有效措施。例如在β-半乳糖苷酶生產中，只有在培養基中不含有葡萄糖時才能夠大量誘導產酶。第七十四頁，共一百零八頁，2022年，8月28日2.控制阻遏物的濃度為了減少或者解除分解代謝物阻遏作用，應當控制培養基中葡萄糖等容易利用的碳源的濃度。采用其他較難利用的碳源，如淀粉等采用補料、分次流加碳源添加一定量的環腺苷酸（cAMP）對于受代謝途徑末端產物阻遏的酶，可以通過控制末端產物的濃度的方法使阻遏解除。第七十五頁，共一百零八頁，2022年，8月28日3.添加表面活性劑表面活性劑可以與細胞膜相互作用，增加細胞的透過性，有利于胞外酶的分泌，從而提高酶的產量。將適量的非離子型表面活性劑，如吐溫（Tween）、特里頓(Triton)等添加到培養基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的產量增加。如霉菌發酵產纖維素酶時，加1%吐溫可使酶產量提高數倍。由于離子型表面活性劑對細胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性劑（如‘新潔而滅’等）是消毒劑，對細胞的毒性較大，不能在酶的發酵生產中添加到培養基中。第七十六頁，共一百零八頁，2022年，8月28日4.添加產酶促進劑產酶促進劑是指可以促進產酶、但是作用機理未闡明清楚的物質。例如，添加一定量的植酸鈣鎂，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的產量提高1～20倍；添加聚乙烯醇可以提高糖化酶的產量。產酶促進劑對不同細胞、不同酶的作用效果各不相同，現在還沒有規律可循，要通過試驗確定所添加的產酶促進劑的種類和濃度。第七十七頁，共一百零八頁，2022年，8月28日酶生產過程的動力學1、酶生物合成的模式2、酶生產過程中細胞生長動力學3、酶生產過程中產酶動力學GoGoGo本章目錄第七十八頁，共一百零八頁，2022年，8月28日1、酶生物合成的模式細胞在一定條件下培養生長，其生長過程一般經歷調整期、生長期、平衡期和衰退期等4個階段通過分析比較細胞生長與酶產生的關系,可以把酶生物合成的模式分為4種類型。即同步合成型，延續合成型，中期合成型和滯后合成型。

第七十九頁，共一百零八頁，2022年，8月28日同步合成型

酶的生物合成與細胞生長同步進行的一種酶生物合成模式。該類型酶的生物合成速度與細胞生長速度緊密聯系，又稱為生長偶聯型。屬于該合成型的酶，其生物合成伴隨著細胞的生長而開始；在細胞進入旺盛生長期時，酶大量生成；當細胞生長進入平衡期后，酶的合成隨著停止。

大部分組成酶的生物合成屬于同步合成型，有部分誘導酶也按照此種模式進行生物合成。例如米曲霉在含有單寧或者沒食子酸的培養基中生長，在單寧或沒食子酸的誘導作用下，合成單寧酶（）。細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml總細胞濃度活細胞濃度胞外酶濃度胞內酶濃度第八十頁，共一百零八頁，2022年，8月28日延續合成型

酶的生物合成在細胞的生長階段開始，在細胞生長進入平衡期后，酶還可以延續合成一段較長時間。屬于該類型的酶可以是組成酶，也可以是誘導酶。例如，在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果膠為單一碳源的培養基中培養，可以誘導聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，）的生物合成。細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml以半乳糖醛酸為誘導物以含有葡萄糖的果膠為誘導物第八十一頁，共一百零八頁，2022年，8月28日中期合成型

該類型的酶在細胞生長一段時間以后才開始，而在細胞生長進入平衡期以后，酶的生物合成也隨著停止。例如，枯草桿菌堿性磷酸酶（Alkalinephophatase，EC3.1.3.1)的生物合成模式屬于中期合成型。這是由于該酶的合成受到其反應產物無機磷酸的反饋阻遏，而磷又是細胞生長所必不可缺的營養物質，培養基中必須有磷的存在。這樣，在細胞生長的開始階段,培養基中的磷阻遏堿性磷酸酶的合成，只有當細胞生長一段時間，培養基中的磷幾乎被細胞用完（低于0.01mmol/L）以后，該酶才開始大量生成。又由于堿性磷酸酶所對應的mRNA不穩定，其壽命只有30min左右，所以當細胞進入平衡期后，酶的生物合成隨著停止。細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml第八十二頁，共一百零八頁，2022年，8月28日滯后合成型

此類型酶是在細胞生長一段時間或者進入平衡期以后才開始其生物合成并大量積累。又稱為非生長偶聯型。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。屬于滯后合成型的酶，之所以要在細胞生長一段時間甚至進入平衡期以后才開始合成，主要原因是由于受到培養基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有隨著細胞的生長，阻遏物幾乎被細胞用完而使阻遏解除后，酶才開始大量合成。若培養基中不存在阻遏物，該酶的合成可以轉為延續合成型。該類型酶所對應的mRNA穩定性很好，可以在細胞生長進入平衡期后的相當長的一段時間內，繼續進行酶的生物合成。黑曲霉羧基蛋白酶生物合成放線菌素D對產酶的影響細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml酶濃度U/ml酶濃度U/ml30℃22℃不加加入不加加入第八十三頁，共一百零八頁，2022年，8月28日理想的酶合成模式酶所對應的mRNA的穩定性以及培養基中阻遏物的存在是影響酶生物合成模式的主要因素。其中，mRNA穩定性好的，可以在細胞生長進入平衡期以后，繼續合成其所對應的酶；mRNA穩定性差的，就隨著細胞生長進入平衡期而停止酶的生物合成；不受培養基中存在的某些物質阻遏的，可以伴隨著細胞生長而開始酶的合成；受到培養基中某些物質阻遏的，則要在細胞生長一段時間甚至在平衡期后，酶才開始合成并大量積累。在酶的發酵生產中，為了提高產酶率和縮短發酵周期，最理想的合成模式應是延續合成型。因為屬于延續合成型的酶，在發酵過程中沒有生長期和產酶期的明顯差別。細胞一開始生長就有酶產生，直至細胞生長進入平衡期以后，酶還可以繼續合成一段較長的時間。對于其他合成模式的酶，可以通過基因工程\細胞工程等先進技術,選育得到優良的菌株,并通過工藝條件的優化控制,使他們的生物合成模式更加接近于延續合成型。其中對于同步合成型的酶，要盡量提高其對應的mRNA的穩定性，為此適當降低發酵溫度是可取的措施；對于滯后合成型的酶，要設法降低培養基中阻遏物的濃度，盡量減少甚至解除產物阻遏或分解代謝物阻遏作用，使酶的生物合成提早開始；而對于中期合成型的酶，則要在提高mRNA的穩定性以及解除阻遏兩方面下功夫，使其生物合成的開始時間提前，并盡量延遲其生物合成停止的時間。回本節第八十四頁，共一百零八頁，2022年，8月28日2、酶生產過程中細胞生長動力學細胞在控制一定條件的培養基中生長的過程中,其生長速度受到細胞內外各種因素的影響,變化比較復雜，情況各不相同。細胞生長動力學主要研究細胞生長速度以及外界環境因素對細胞生長速度影響的規律。1950年，法國的莫諾德(Monod)首先提出了表述微生物細胞生長的動力學方程。在培養過程中，細胞生長速率與細胞濃度成正比假設培養基中只有一種限制性基質，而不存在其他生長限制因素時，μ為這種限制性基質濃度的函數。KS

為莫諾德常數，是指比生長速率達到最大比生長速率一半時的限制性基質濃度。第八十五頁，共一百零八頁，2022年，8月28日回本節限制性基質的物料平衡式莫諾德方程是基本的細胞生長動力學方程。在發酵過程優化以及發酵過程控制方面具有重要的應用價值。不少學者從不同的情況出發或運用不同的方法，對莫諾德方程進行了修正，得出了適用于不同情況的各種動力學模型。連續培養時的方程變化形式第八十六頁，共一百零八頁，2022年，8月28日3、產酶動力學

產酶動力學主要研究細胞產酶速率以及各種環境因素對產酶速率的影響規律。產酶動力學的研究可以從整個發酵系統著眼，研究群體細胞的產酶速率及其影響因素，這稱為宏觀產酶動力學或這稱為非結構動力學。也可以從細胞內部著眼，研究細胞中酶合成速率及其影響因素，這謂之微觀產酶動力學或稱為結構動力學。第八十七頁，共一百零八頁，2022年，8月28日在酶的發酵生產中，酶的產量高低，是發酵系統中群體細胞產酶的集中體現，宏觀產酶動力學的研究表明，產酶速率與細胞比生長速率、細胞濃度以及細胞產酶模式有關。

與生長相關與生長部分相關與生長無關第八十八頁，共一百零八頁，2022年，8月28日回本節常用的幾種模型第八十九頁，共一百零八頁，2022年，8月28日五動、植物細胞培養產酶與微生物細胞相比，動物細胞和植物細胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培養工藝。

第九十頁，共一百零八頁，2022年，8月28日動物細胞模式圖第九十一頁，共一百零八頁，2022年，8月28日植物細胞結構第九十二頁，共一百零八頁，2022年，8月28日

植物、動物、微生物細胞的特性比較細胞種類植物細胞微生物細胞動物細胞細胞大小/um200～3001～1010～100倍增時間/h﹥120.3-6﹥15營養要求簡單簡單復雜光照要求大多數要求不要求不要求對剪切力敏感大多數不敏感非常敏感主要產物色素、藥物、香精、酶等醇、有機酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等疫苗、激素、單克隆抗體、酶等第九十三頁，共一百零八頁，2022年，8月28日三者之間的差異主要有：植物細胞>動物細胞>微生物細胞。動物細胞、植物細胞的生產周期比微生物長。植物細胞和微生物細胞的營養要求較簡單。植物細胞的生長以及次級代謝物的生產要求一定的光