基因工程轉基因生物基因工程又叫基因拼接技術或DNA重組技術。該技術是在生物體外，通過對DNA分子進行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進行改造和重新組合，然后導入受體細胞內，使重組基因在受體細胞內表達，產生出人類所需要的基因產物。什么是基因工程？練習：基因工程的基本操作程序1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構建3、將目的基因導入受體細胞4、目的基因的檢測與鑒定1.1DNA重組技術的基本工具準確切割DNA的工具（“分子手術刀”）——限制性內切酶DNA片段的連接工具（“分子縫合針”）——DNA連接酶基因轉移工具（“分子運輸車”）——運載體概述：切割DNA的工具是限制性核酸內切酶，又稱限制酶。這類酶主要是從原核生物中分離純化出來的。現在已分離出約4000種限制酶。限制酶能識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列。一、限制性核酸內切酶—“分子手術刀”一、限制性核酸內切酶—“分子手術刀”特點：限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且在特定的位點切割DNA分子。（專一性）例如：大腸桿菌(E.coli)的EcoRⅠ限制酶能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。黏性末端黏性末端回文序列如何切割DNA分子呢？DNA分子磷酸二酯鍵切割DNA分子實質是斷開兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。一、限制性核酸內切酶—“分子手術刀”思考：（1）在一個DNA分子片段中，含有

個游離的磷酸基團，如果是環狀DNA分子呢？切割DNA分子后形成什么呢？產物：

黏性末端（在中軸線兩側切割DNA）平末端（在中軸線處切割DNA）一、限制性核酸內切酶—“分子手術刀”小結：（1）限制酶的種類、分布、特點、作用部位、作用結果；（2）練習1.酶的的種類：：二、DNA連接接酶—““分子縫縫合針””（1）E·coliDNA連連接酶只只能將雙雙鏈DNA片段段互補的的黏性末端端之間連接接起來。。（2）T4DNA連連接酶（（噬菌體體）兩種酶的的區別：：（1）E·coliDNA連連接酶（（大腸桿桿菌）（2）T4DNA連連接酶都都能連接接黏性末端端和平末端，，但連接平平末端之之間的效效率比較較低。2.酶的的作用：：將雙鏈DNA分分子片段段“縫合合”起來來，恢復復兩個核核苷酸之之間的磷酸二酯酯鍵。二、DNA連接接酶—““分子縫縫合針””思考：比比較(考點一一)限制性內內切酶與與DNA連接酶酶跟蹤演練練：AATTGCCTTAAG磷酸二酯酯鍵磷酸二酯酯鍵DNA復制思考：比比較DNA連連接酶和和DNA聚酶？？DNA聚聚合酶只只能將單個核苷苷酸加到已有有的單鏈核苷酸片片段的末末端，形形成磷酸酸二酯鍵鍵,需要要摸板。。DNA連接酶酶是連接接兩個雙鏈鏈DNA片段的末端，，形成磷磷酸二酯酯鍵,不不需要摸摸板。要讓一個個從甲生物細胞胞內取出出來的基基因在乙生物體內內進行表表達，首首先得將將這個基基因送到到乙生物物的細胞胞內去。。能將外外源基因因送入細細胞的工工具就是是運載體。常用的的載體是是質粒，還還有λ噬菌體體的衍生生物、動動植物病病毒等。三、基因因進入受受體細胞胞的載體體—“分分子運輸輸車”作為基因因工程運運載體的的條件①能夠在在宿主細細胞中復制并穩定地保存。②具多種限制制酶切點點，以便與與外源基基因連接接。③具有某某些標記基因因，便于進進行篩選。④載體是是安全的的，不能能對受體體細胞有有害。⑤載體DNA分分子大小小應合適適，以便便提取和和在體外外進行操操作。。。（2009高考考-理綜綜山東東）35.人人類在在預防與與診療傳傳染性疾疾病過程程中，經經常使用用疫苗和抗抗體。已知某某傳染性性疾病的的病原體體為RNA病毒毒，該病病毒表面面的A蛋蛋白為主主要抗原原，且疾苗生產產和抗體體制備的流程之之一如下下圖：四、典型型例題解解讀———基因工工程與細細胞工程程請回答：：（1）過過程①代代表的是是。（2）過過程②構構建A基因表過過載體時，必須須使用和兩種工具酶。（3）過過程③采采用的實實驗技術術是，獲得的的X是。（4）對對健康人人進行該該傳染病病免疫預預防時，，可選用用圖中基因工工程生產產的所制備的的疫苗。。對該傳染病疑疑似患者者確診時時，可以以疑似患患者體內內分離病毒，，與已知知病毒進進行比較；或或用圖中中的進行特異異性結合合檢測。。參考答案案：（1）逆逆轉錄錄（2）限限制性性核酸內內切酶（（限制酶酶\限制制性內切切酶）DNA連連接酶（（兩空可可以互換換）（3）細細胞融融合雜交瘤細細胞（4）A蛋白白核酸（基基因）序序列抗A蛋白白的單克克隆抗體體合成基因組織、器官、細胞基因組DNAcDNA文庫基因文庫目的基因的克隆基因工程程的基本本操作程程序第一步：：目的基因因的獲取取如何建立立?基因組DNA文文庫與cDNA文庫的的比較②基因文庫庫的構建建a.直直接分離離法:②基因文庫庫的構建建a.直直接分離離法:②基因文庫庫的構建建a.直直接分離離法:基因組文文庫的構構建②基因文庫庫的構建建a.直直接分離離法:基因組文文庫的構構建②基因文庫庫的構建建a.直直接分離離法:基因組文文庫的構構建b.反轉轉錄法：：②基因文庫庫的構建建a.直直接分離離法:基因組文文庫的構構建b.反轉轉錄法：：mRNAcDNA(互補DNA)雙鏈DNA反轉錄DNA聚聚合酶②基因文庫庫的構建建a.直直接分離離法:基因組文文庫的構構建b.反轉轉錄法：：mRNAcDNA(互補DNA)雙鏈DNA反轉錄DNA聚聚合酶cDNA文庫的的構建②基因文庫庫的構建建a.直直接分離離法:基因組文文庫的構構建b.反轉轉錄法：：解讀cDNA文文庫的構構建過程程(1)提提取某種種生物發發育某一一時期的的mRNA;(2)mRNA反轉錄錄形成DNA片片段;(3)DNA片片段與載載體連接接后,儲儲存在一一個受體體菌的群群體中。。文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小小大基因中啟動子(具有啟動作用的DNA片段)無有基因中內含子(位于編碼蛋白質序列內的非編碼DNA片段)無有基因多少某種生物的部分基因某種生物的全部基因物種間的基因交流可以部分基因可以cDNA文庫和和基因因組文庫庫的區區別DNA復制PCR技術基因克隆場所細胞核或細胞器生物體外細胞內酶解旋酶、DNA聚合酶耐高溫DNA聚合酶限制酶、連接酶載體不需要不需要需要遵循原則堿基互配對堿基互配對堿基互配對結果形成DNA分子形成DNA分子片段形成DNA分子片段DNA復復制、PCR技技術與基基因克隆隆的比較較三種目的的基因提提取的方方法有何何優缺點點？優點缺點鳥槍法反轉錄法根據已知氨基酸合成DNA法操作簡便便廣泛使使用工作量大大，盲目目，分離離出來的的有時并并非一個個基因專一性強強操作過程程麻煩，，mRNA很不不穩定，，要求的的技術條條件較高高專一性最最強僅限于合合成核苷苷酸對較較少的簡簡單基因因目的基因因轉移轉轉化或感感染合成基因組織、器官、細胞基因組DNAcDNA文庫基因文庫目的基因的克隆基因工程程的基本本操作程程序第二步：：基因表達達載體構構建（二）基因因表達載載體的構構建———核心（二）基因因表達載載體的構構建———核心1.作用用（二）基因因表達載載體的構構建———核心1.作用用（1）使目的基基因在受受體細胞胞中穩定定存在并并遺傳給給子代（二）基因因表達載載體的構構建———核心1.作用用（1）使目的基基因在受受體細胞胞中穩定定存在并并遺傳給給子代（2）同時使目目的基因因能表達達和發揮揮作用（二）基因因表達載載體的構構建———核心1.作用用（1）使目的基基因在受受體細胞胞中穩定定存在并并遺傳給給子代（2）同時使目目的基因因能表達達和發揮揮作用2.組成成（二）基因因表達載載體的構構建———核心1.作用用（1）使目的基基因在受受體細胞胞中穩定定存在并并遺傳給給子代（2）同時使目目的基因因能表達達和發揮揮作用2.組成成（二）基因因表達載載體的構構建———核心1.作用用（1）使目的基基因在受受體細胞胞中穩定定存在并并遺傳給給子代（2）同時使目目的基因因能表達達和發揮揮作用2.組成成目的基因因啟動子終止子標記基因因（二）基因因表達載載體的構構建———核心3.構建建過程（二）基因因表達載載體的構構建———核心3.構建建過程①用一定定的________切割質質粒，使使其出現現一個切口，，露出_________。。②用____________切斷斷目的基基因，使使其產生生_________________。③將切下下的目的的基因片片段插入入質粒的的______處，再加加入適量量____________，形成成了一個個重組DNA分子子（重組組質粒））（二）基因因表達載載體的構構建———核心3.構建建過程①用一定定的________切割質質粒，使使其出現現一個切口，，露出_________。。②用____________切斷斷目的基基因，使使其產生生_________________。③將切下下的目的的基因片片段插入入質粒的的______處，再加加入適量量____________，形成成了一個個重組DNA分子子（重組組質粒））限制酶黏性末端端（二）基因因表達載載體的構構建———核心3.構建建過程①用一定定的________切割質質粒，使使其出現現一個切口，，露出_________。。②用____________切斷斷目的基基因，使使其產生生_________________。③將切下下的目的的基因片片段插入入質粒的的______處，再加加入適量量____________，形成成了一個個重組DNA分子子（重組組質粒））限制酶黏性末端端同一種限限制酶相同的黏黏性末端端（二）基因因表達載載體的構構建———核心3.構建建過程①用一定定的________切割質質粒，使使其出現現一個切口，，露出_________。。②用____________切斷斷目的基基因，使使其產生生_________________。③將切下下的目的的基因片片段插入入質粒的的______處，再加加入適量量____________，形成成了一個個重組DNA分子子（重組組質粒））限制酶黏性末端端同一種限限制酶相同的黏黏性末端端切口DNA連連接酶人胰島素素基因與與質粒結結合形成成重組質粒粒質粒DNA分分子一種限制制酶處處理一個切口口兩個黏性性末端兩個切切口獲得目目的基基因DNA連接接酶重組DNA分子子(重重組質質粒)你知道道雙酶酶切法法嗎？？例1（（10年江江蘇高高考））下表表中列列出了了幾種種限制制酶識識別序序列及及其切切割位位點，，圖1、圖圖2中中箭頭頭表示示相關關限制制酶的的酶切切位點點。與只使使用EcoRⅠ相相比較較，使使用BamHⅠ和和HindⅢ兩兩種限限制酶酶同時時處理理質粒粒、外外源DNA的優優點在在于可可以防防止___________________。×√√√原核細胞表達真核細胞表達植物中表達動物中表達人體表達發酵工程轉基因植物動物器官發生器轉基因動物基因治療目的基基因轉轉移轉轉化化或感感染合成基因組織、器官、細胞基因組DNAcDNA文庫基因文庫目的基因的克隆基因工工程的的基本本操作作程序序第三步步：將目的的基因因導入入受體體細胞胞第四步步：目的基基因的的檢測測與鑒鑒定3、將將目的的基因因導入入受體體細胞胞方法：：將目的的基因因導入入植物物細胞胞：農桿菌菌轉化化法（雙子葉葉植物物和祼祼子植植物）、基因因槍法法（單子葉葉植物物）、花粉粉管通通道法法將目的的基因因導入入動物物細胞胞顯微注注射法法將目的的基因因導入入微生生物細細胞感受態態細胞胞將目的的基因因導入入植物物細胞胞農桿菌菌轉化化法類型步驟檢測內容方法結果顯示分子水平檢測第一步目的基因是否插入受體細胞DNADNA分子雜交是否顯示雜交帶第二步目的基因是否轉錄出mRNADNA與mRNA分子雜交是否顯示雜交帶第三步目的基因是否翻譯出蛋白質抗原—抗體雜交是否顯示雜交帶個體水平鑒定包括做抗蟲，抗病的接種實驗，以確定是否有抗性以及抗性的程度；對基因工程產品與天然產品的功能進行活性比較，以確定功能是否相同。4.目目的基基因的的檢測測與鑒鑒定4、目目的基基因的的檢測測與鑒鑒定鑒定：：（個個體水水平））抗蟲鑒鑒定、、抗病病鑒定定、活活性鑒鑒定等等4、目目的基基因的的檢測測與鑒鑒定將每個個受體體細胞胞單獨獨培養養形成成菌落落，檢檢測菌菌落中中是否否有目目的基基因的的表達達產物物。淘淘汰無無表達達產物物的菌菌落，，保留留有表表達產產物的的進一一步培培養、、研究究。無表達產物無表達產物有表達產物無表達產物1、例22、課課時作作業：：1、、2、、3、、6、、7、、8、、9、10、11思考：：跟蹤演演練2四、典典型例例題解解讀———基因工工程操操作過過程3、（（2008