關于多糖的分離純化第一頁，共十五頁，2022年，8月28日第二頁，共十五頁，2022年，8月28日研究背景實驗步驟與結果總結與展望目錄第三頁，共十五頁，2022年，8月28日研究背景1第四頁，共十五頁，2022年，8月28日莼菜睡蓮科，多年生水生草本植物，又名馬蹄草，有調節免疫、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌、降血糖、降血脂等功效，含酸性多糖、多酚、蛋白質、氨基酸、維生素、組胺及微量元素，多糖在莼菜干品中所占的比例最高，主要分布于葉底部、莖周圍的黏液質中，是莼菜發揮藥效的主要物質基礎。第五頁，共十五頁，2022年，8月28日方法流程采用堿提醇沉工藝，經除蛋白、除色素得到莼菜多糖(BSP)再經DEAE纖維素DE-52柱SepharoseCL-6B瓊脂糖凝膠柱對BSP進行分級精制采用高效凝膠過濾色譜(HPGFC)測定BSP各組分的分子量第六頁，共十五頁，2022年，8月28日儀器與材料Agilent1200HPLC色譜儀AE240分析天平UV-2102PC紫外可見分光光度計FD-1C-55凍干機旋轉蒸發儀超濾儀DZG-6020減壓干燥箱莼菜嫩葉；無水乙醇；NaOH；鹽酸；木瓜蛋白酶；聚酰胺樹脂；DEAE纖維素DE-52；瓊脂糖凝膠SepharoseCL-6B；透析袋；蒽酮、硫酸；純化水第七頁，共十五頁，2022年，8月28日粗多糖的提取莼菜粗多糖

加40倍0.3mol/LNaOH溶液，70℃加熱攪拌提取2h，加鹽酸中和，過濾，濾液濃縮，加入無水乙醇至67%，4℃靜置過夜，4500r/min離心20min，80%乙醇洗滌3次，沉淀減壓干燥，得83g莼菜粗多糖。除去脂溶性成分

取250g莼菜噴干粉，加無水乙醇2.5L，60℃旋轉回流提取2h，過濾，重復操作1次，除去脂溶性成分，濾渣烘干。莼菜噴干粉

新鮮莼菜嫩葉，經清水淋洗、均漿機剪切、噴霧干燥得莼菜噴干粉。第八頁，共十五頁，2022年，8月28日粗多糖純化01020304酶解滅活脫蛋白粗多糖用2.5L純化水復溶，加入木瓜蛋白酶，63℃酶解6h，滅活過濾除去不溶物，濾液進行第2次酶解滅活脫蛋白。聚酰胺層析濾液流經預處理的聚酰胺層析柱脫色，濾液與聚酰胺濕填料的體積之比為1∶1，純化水洗脫，共收集洗脫液8L。濾膜過濾濃縮再用微孔濾膜過濾，濾液用超濾膜超濾濃縮至800mL后加入無水乙醇至67%，4℃靜置過夜后離心，80%乙醇洗滌3次，減壓干燥。得到BSP

獲得灰白色膠狀莼菜多糖(BSP)22g，收率為8.8%。第九頁，共十五頁，2022年，8月28日BSP含有量測定010203葡萄糖標準曲線制作BSP純度測定精密稱取干燥至恒重的BSP24.72mg至500mL量瓶，純化水溶解并定容，搖勻，測定樣品吸光度為0.521，計算可知BSP的純度為61.89%。

紫外檢測粗多糖經木瓜蛋白酶脫蛋白、聚酰胺脫色素等處理后，紫外全波長掃描顯示在260、280nm處其吸光度接近于零，表明已除去蛋白質、核酸等雜質。利用蒽酮硫酸法：以葡萄糖質量濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(A)得曲線方程A=17.294X－0.0076(Ｒ2=0.9994)。第十頁，共十五頁，2022年，8月28日BSP精制取10gBSP，200mL純化水充分溶解后過DEDA纖維素DE-52離子交換柱(60mm×950mm)，依次用0～1.0mol/LNaCl溶液梯度洗脫，分管收集洗脫液，采用“2.2”項下方法，以洗脫管數為橫坐標，多糖濃度為縱坐標繪制洗脫曲線。BSP經DEAE纖維素DE-52分離后，可得3個峰(圖1)，透析(截留分子量8000～14000)、濃縮、凍干各峰組分，得到BSP-1、BSP-2、BSP-3。第十一頁，共十五頁，2022年，8月28日BSP精制對2個主要組分BSP-1、BSP-3用瓊脂糖凝膠柱SepharoseCL-6B進一步的分離純化，用純化水洗脫，蒽酮-硫酸顯色法測定多糖含有量。洗脫曲線(圖2)表明，莼菜精制多糖BSP-1、BSP-3組分均一，分別濃縮、凍干。第十二頁，共十五頁，2022年，8月28日分子量測定

色譜條件:色譜柱TSKgelG5000PWxl(10)、G4000PWxl(10)、G3000PWxl(7)(7.8mm×300mm)串聯;保護柱TSKPWxlGuardcolumn;Agilent1260示差折光檢測器;流動相為純化水;體積流量0.4mL/min;進樣量30μL;柱溫30℃;檢測器溫度35℃;環境溫度25℃。

稱取葡聚糖對照品、莼菜多糖各組分樣品（BSP1、BSP2、BSP3），分別用純水溶解并配制成2mg/mL的溶液，過0.22μm微孔濾膜，取續濾液，將圖譜數據導入GPC軟件，建立分子量分布標準曲線，得到分子量對數logMW與洗脫體積VR的線性回歸方程logMW=10.513－0.2377VＲ(r=0.9962)，

第十三頁，共十五頁，2022年，8月28日將莼菜多糖各組分導入GPC軟件，調用標準曲線，得出莼菜多糖各組分的Mw、Mn和D等，結果見表1，莼菜多糖的分子量分布為(1.0507～1.