脂肪酶活檢測(cè)原理及實(shí)際方法：一、原理以及標(biāo)準(zhǔn)曲線做法.對(duì)硝基苯酚酯(4-Nitrophenylester)是脂肪酶水解活力測(cè)定中運(yùn)用最為廣泛的一種底物，脂肪酶水解其產(chǎn)生pNP(對(duì)硝基苯酚)在堿性條件下顯黃色，在410nm下有吸光值，且靈敏度很高。.所需試劑有：CAS 碳鏈長(zhǎng)度 出830-03-5C2N8130-1G2635-54-9C41956-10-1C821742-1G-F830-03-5C2N8130-1G2635-54-9C41956-10-1C821742-1G-F￥462對(duì)硝基苯乙酸酯N9876-1G￥570 對(duì)硝基苯丁酸酯￥435￥379對(duì)硝基苯月桂酸酯

對(duì)硝基苯棕櫚酸酯￥435￥379對(duì)硝基苯月桂酸酯

對(duì)硝基苯棕櫚酸酯1956-11-2 C1261716-1G1492-30-4C16 N2752-1G全部為色譜解試劑,基苯購(gòu)脂sigma公司.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:a.標(biāo)準(zhǔn)對(duì)硝基苯酚母液(2mM,2mmol/L):稱取的對(duì)硝基苯酚(p-NP)溶于100ml的溶液B(即不同pH的緩沖液)，置于棕色試劑瓶?jī)?nèi),b.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別取,，，，，的對(duì)硝基苯酚母液(2mM),用溶液B(即不同pH的緩沖液)稀釋至4ml,分別測(cè)定在410nm處的吸收值。以對(duì)硝基苯酚濃度x(對(duì)應(yīng)濃度分別是,，，，，，單位：mM)為橫坐標(biāo)，吸光值y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。方法二：全部對(duì)硝基苯酚經(jīng)過(guò)與測(cè)酶活相同的處理，獲得吸光度。b?標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

分別取0、、、、15、、30、45分別取0、、、、15、、30、45PL的對(duì)硝基苯酚分別加入、、、55、、40、、PL的異丙醇和（全部都是）的溶液B,40℃15min,95%乙醇，10000r/min,3min,測(cè)出標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.0mMpNP（jiL）異丙葬底物緩沖液（風(fēng)）95%乙薛（國(guó)力0 L375 3/75 7.5 15 225 306i.5 60.6255S.75 53 47-5 4。 323562.5 562.5 562.5 562.5 562.5 562.5 562,5M匕水浴耦內(nèi)處理15min500 500 500 500 500 500 50010,000r/mm離心3min一線性（系列。D.8D.6D.4D.2y-14.474x+0.0272

R"2D.8D.6D.4D.20 0.02 0.04 0.06 0.08 0二上表是方法一測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線脂肪酶酶活定義:在410nm下測(cè)定吸光值,以1min內(nèi)催化水解底物對(duì)硝基苯棕櫚酸酯（p-NPP）產(chǎn)生1Pmol對(duì)硝基苯酸（p-NP）公式y(tǒng)=+中x是p-NP的濃度（單位：mmol/l）,y是吸光值,、是反應(yīng)系數(shù)，R2是相關(guān)系數(shù)。則，酶活計(jì)算公式為：酶活=1000*n*V*/其中n為稀釋倍數(shù),t為反應(yīng)時(shí)間（單位：min）,V為反應(yīng)體系的總體積（單位：L）、1000是mmol到口mol的比例。二、底物耐堿性測(cè)定及試驗(yàn)液配制.底物耐堿性測(cè)定種底物分別加至pH7,pH8的37℃的PBS緩沖液中（選擇37℃培養(yǎng)箱），每隔5min檢測(cè)一次顏色變化，拍照；種底物分別加至pH8,pH9的Tris-HCl緩沖液中（37℃），每隔5min檢測(cè)一次顏色變化，拍照;c.分別加至pH9，pH10的Gly-NaOH緩沖液。.測(cè)酶活所需要試劑的配制，酶活測(cè)定方法方法一：（96孔板法，粗略，速度快）a,溶液的配制溶液A：溶液A:對(duì)硝基苯棕桐酸脂（p-NPP，Sigma，或者其他底物，mol，即*10-5mol）溶于異丙醇（濃度為*10-3M，或），4c棕色瓶（可以使用包錫箔紙的15ml離心管）保存，每10ml可用于單個(gè)酶500次測(cè)定；溶液B:緩沖液（pH緩沖液，可更改）加入1滴TritonX-100,混勻，4℃保存。96孑L板（220PL）：A液（底物液）：18UL/+酶液（40UL+酶液（40UL）B液（pH緩沖液）:162UL此步驟中，底物再次被稀釋，濃度為。方法二：（吸光度法，精準(zhǔn)，速度慢）a.溶液的配制溶液A:對(duì)硝基苯棕桐酸脂（p-NPP,Sigma,或者其他底物）溶于異丙醇，4℃棕色瓶（可以使用包錫箔紙的15ml離心管）保存，每10ml可用于單個(gè)酶8-10次測(cè)定，或用于8-10個(gè)酶一次測(cè)定，或用于一個(gè)酶4次密精測(cè)定；溶液B:緩沖液（pH緩沖液，可更改）加入1滴TritonX-100,混勻，4℃保存。b,脂肪酶的活力測(cè)定（以單個(gè)酶液做一個(gè)/兩個(gè)對(duì)照為例）①準(zhǔn)備試管30個(gè)，10個(gè)15ml離心管；②取1ml/溶液A加入到9ml/溶液B于離心管中，充分混勻，37℃水浴保溫5min,分裝至3/4個(gè)試管中，每個(gè)，即體系液；③向每個(gè)試管中加入適量酶液（粗酶液加300UL）,對(duì)照組中加入滅活酶液（沸水煮沸5巾防），加入酶液后即為反應(yīng)液；④37℃反應(yīng)10-15巾防，加入95%乙醇終止反應(yīng)，在410nm下測(cè)定吸光值，每個(gè)樣品重復(fù)2/3次，取平均值。三、96孔板裝樣方式：步驟一：溫度不變，定為40℃,以pH和底物為變量，先在EP管內(nèi)反應(yīng)，后加入至96孔板中。其中每個(gè)孔是220UL體系。pH緩沖液分別采取PBS緩沖液（7、8）、Tris-HCl緩沖液（8、9）。a.該方法需要的總酶液量（每個(gè)酶的單次實(shí)驗(yàn)）：40*80=,其中需要滅活的是800UL。以方便計(jì)算以及加樣，取4ml酶液，1ml用來(lái)滅活。b.該方法需要的單個(gè)底物的總量是（每個(gè)酶的單次試驗(yàn)）：18*16=288UL,以方便計(jì)算和加樣，取300UL。c,以三個(gè)酶為例僅做pH和底物交叉實(shí)驗(yàn)為例，需要每個(gè)酶液4ml,每個(gè)底物900UL。

表為96孔加樣模式：C2等代表底物，后面的數(shù)字代表pH,紅色字體表示一個(gè)空白對(duì)照和三個(gè)平行。藍(lán)色字體中，pH8分別用了PBS緩沖液和Tris-HCl緩沖液，以便比較不同緩沖液對(duì)酶活的影響。123456789101112AC27空白C27平行C47空白C47C87空白C87C127空C127C167空C167BC27平行C27平行C47C47C87C87C127C127C167C167CC28空白C28C4空白C48C8空白C88C12空白C128C16空白C168DC28C28C48C48C88C88C128C128C168C168EC28Tri空白C28TriC48Tri空白C48TriC88Tri空白C88TriC128Tri空白C128TriC168Tri空白C168TriFC28TriC28TriC48TriC48TriC88TriC88TriC128TriC128TriC168TriC168TriGC29Tri空白C29TriC49Tri空白C49TriC89Tri空白C89TriC129Tri空白C129TriC169Tri空白C169TriHC29TriC29TriC49TriC49TriC89TriC89TriC129TriC129TriC169TriC169Tri步驟二：pH不變，以溫度和底物為變量，先在EP管內(nèi)反應(yīng)，后加至96孔板中。其中每個(gè)孔是220口L體系。a.該方法需要的總酶液量（每個(gè)酶的單次實(shí)驗(yàn)）：40*60=,其中需要滅活的是600UL。以方便計(jì)算以及加樣，取3ml酶液，750ml用來(lái)滅活。b.該方法需要的單個(gè)底物的總量是（每個(gè)酶的單次試驗(yàn)）：18*12=216UL,以方便計(jì)算和加

樣，取250PL。c,以三個(gè)酶為例僅做pH和底物交叉實(shí)驗(yàn)為例，需要每個(gè)酶液3ml,每個(gè)底物750PL。表為96孔加樣模式其中C2等代表底物，后面的數(shù)字代表溫度，紅色字體表示一個(gè)空白對(duì)照和三個(gè)平行。40℃因已經(jīng)在上個(gè)步驟中做過(guò)，不再重復(fù)。123456789101112AC230空白C230平行C430空白C430C830空白C830C1230空白C1230C1630空白C1630BC230平行C230平行C430C430C830C830C1230C1230C1630C1630CC250空白C250C450空白C450C850空白C850C1250空白C125