第二章流式細胞術的應用第一節流式細胞周期與DNA倍體分析1．細胞周期和倍體的概念

(1)細胞周期:

從一次細胞分裂結束開始，經過物質積累，到下一次細胞分裂結束為止，稱為一個細胞周期細胞周期和倍體G1期(DNA合成前期):

如果誘導細胞分裂，細胞首先進入G1期，在這一期間，細胞內RNA含量增加，合成細胞所需的蛋白質,此時細胞不合成DNA。S期(DNA合成期):一旦細胞開始合成新的DNA，細胞則進入了S期。G2期(分裂前期):DNA復制完成到有絲分裂開始的時間區間，即細胞DNA倍增結束，細胞開始進入G2期，又稱為DNA合成后期。M期(分裂期):

隨后細胞進入分裂期，即M期。時間區間指從有絲分裂開始到結束。G0期(靜止期):

有些細胞會暫時離開細胞周期，停止細胞分裂，去執行一些功能，稱為G0期細胞。細胞周期和倍體

(3)流式細胞術測量DNA含量的變化與倍體關系

1)G0期（靜止期）細胞:DNA含量為恒定的2倍（2C）;2)G1期細胞:DNA合成前期，細胞為進入S期做物質準備，合成大量的蛋白質和RNA。DNA含量與G0期相同，(2C);3)S期細胞:DNA合成期，當細胞進入S期后DNA含量逐漸增加，從2C～4C;4)G2期與M期細胞:DNA合成后期和分裂期。S期后細胞DNA含量倍增，細胞進入G2期，爾后最終進入M期；在M期分裂成兩個子細胞之前，G2和M期細胞的DNA含量均為恒定的4C。細胞周期和倍體當進行DNA染色時，熒光染料（如PI）與細胞DNA分子特異性結合，而且有一定的量效關系：1）DNA含量的多少與熒光染料結合成正比；2）熒光強度與熒光染料分子多少成正比；3）熒光強度與直方圖中的通道數值(C)成正比。因此，在用FCM分析一個群體細胞峰DNA倍體與細胞周期時，熒光的道數直接與DNA含量有關。細胞周期和倍體CV值（變異系數）：實測DNA含量直方圖的G0/G1期峰為正態分布，測定過程存在一定的漂移，為精確解釋這種漂移現象，在FCM分析DNA含量中引入了變異系數（CV值）。實測結果的CV值包括儀器的CV值和實驗樣品的CV值。在實驗過程中，一個生物細胞的CV值在5％以下的精度就足夠了。細胞周期和倍體100％均為二倍體細胞（DIPLOID)。其中G0/G1占99%,無G2/M期細胞,S期細胞0.01%,G0/G1細胞峰CV值為2.94％。正常人血淋巴細胞DNA分析二倍體細胞占58.86%；G0/G1細胞峰CV值為3.39％。可見一個異倍體細胞峰為亞二倍體，占41.14％。DNA指數為0.81%。急性T淋巴細胞白血病骨髓細胞DNA分析多發性骨髓瘤骨髓細胞DNA分析二倍體細胞占69.88%,G0/G1細胞峰CV值為3.08％。可見一個異倍體細胞峰為亞二倍體，占30.12％。DNA指數為0.83%。第二節:流式細胞術在細胞凋亡檢測方面的應用流式細胞術在科研與臨床上的應用一、概述：

細胞凋亡（apoptosis）又稱細胞的程序性死亡(programmedcelldeath)，是細胞在一定生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結束其生命的過程，它是一個主動的、高度有序的、基因控制的一系列酶參與的過程。細胞凋亡在形態上和生化上有其明顯的特征。細胞凋亡檢測凋亡細胞在正常細胞的G0/G1峰前出現一個亞二倍體峰細胞凋亡的分析細胞凋亡檢測細胞凋亡的主要表現細胞內水解酶改變：如Caspase-3活化細胞膜不對稱性改變，磷脂酰絲氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：AnnexinV/PI細胞核DNA的斷裂改變：TUNNEL實驗（APO-BRDU，APO-DIRECT）凋亡相關蛋白：FasBcl-2細胞凋亡——Caspases-3ANNEXIN-V/PI檢測流式細胞儀檢測細胞凋亡——AnnexinV/PI雙染色法基本原理

目前細胞凋亡早期識別仍有困難。早期改變發生在細胞膜表面，其改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞膜內轉移到細胞膜外，使PS暴露在細胞膜外表面。這些細胞膜表面的PS是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內面，在細胞發生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。結果判斷

凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細胞則不能。細胞膜有損傷的細胞的DNA可被PI著染產生紅色熒光，而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產生。因此，在細胞凋亡的早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號。正常活細胞與此相似。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為凋亡細胞，顯現（FITC+/PI-）。第三節:流式細胞術在淋巴細胞免疫表型分析的應用流式細胞術在科研與臨床上的應用一、概述：

正常機體內淋巴細胞是不均一的細胞群體。根據其表面標志及功能特點，可分為不同的亞群。從體液免疫及細胞免疫功能分，淋巴細胞可分為B淋巴細胞與T淋巴細胞兩大類。此外，有一種大顆粒淋巴細胞，由于缺乏T和B細胞的獨特的標志（TCR、BCR）故稱為第三類淋巴細胞即：（NK）細胞。再根據細胞表面分化抗原（clusterofdifferentiation;

CD）的表達可將他們進一步分成許多的亞類。淋巴細胞免疫表型（二）可歸入T細胞組的CD有：CD3、CD4、CD8、CD11a/CD18、CD49/CD29、CD28、CD2、CD45、CD5、CD44等。

其中，CD3與CD2（還有TCR）分子是外周血成熟T淋巴細胞各亞群共有的表面標志。而CD4、CD8表達是成熟T細胞不同亞群的表面標志。淋巴細胞免疫表型CD4在T細胞活化中有兩個主要功能：一是作為細胞間的粘附分子，與MHCII類分子的2功能區結合以穩定T細胞與APC細胞結合；另一功能是CD4分子的胞漿區與蛋白酪氨酸激酶p56lck相連。從而激活T細胞作用。

因此其主要功能為T輔助作用（Thelper,

Th）細胞）或稱T誘導作用（inducelymphcytes,

Ti）。淋巴細胞免疫表型CD8在T細胞活化中也有兩個主要功能：一是作為細胞間的粘附分子，與MHCI類分子結合以穩定T細胞與靶細胞結合。為抑制性（殺傷性）T淋巴細胞；

另一功能是CD8分子也與蛋白酪氨酸激酶p56lck激活相關。參與T細胞的信號轉導。就其主要功能稱為抑制性T淋巴細胞（Tsuppressor,TS）或稱為（殺傷性/細胞毒性）T細胞（Tcytotoxiclymphocyte,TC）。淋巴細胞免疫表型（三）

NK細胞：是一類具有自發細胞毒活性的細胞，故屬于先天性免疫，不具有免疫記憶功能，以非MHC形式殺傷靶細胞。故稱之為自然殺傷細胞（naturalkillercells,

NKcells）。NK細胞表面沒有特有的標志，可歸入NK細胞表面的相對標志在人類是CD16和CD56（NKH－1），小鼠為NK1.1和NK2.1。淋巴細胞免疫表型二、血液淋巴細胞免疫表型分析（一）分析原理

血液經熒光素標記的單克隆抗體免疫熒光染色后，用FCM分析淋巴細胞膜上白細胞分化抗原（CD分子）的表達，由此計算淋巴細胞各亞群的百分比。目前常用的有雙色和三色免疫熒光分析法。淋巴細胞免疫表型

雙色（FITC/PE）免疫熒光染色分析淋巴細胞免疫表型管號雙色熒光標記的單抗染色目的與染色細胞1CD45

FITC/CD14PE

設定淋巴細胞門2MouseIgG1FITC/MouseIgG2aPE陰性對照3CD3FITC/CD19PE總T和總B淋巴細胞4CD3FITC/CD4PET輔助細胞5CD3FITC/CD8PET抑制細胞6CD3FITC/CD16+56PENK細胞注:參考CD45/CD14

散點圖,由FSC/SSC設定淋巴細胞門。淋巴細胞免疫表型

三色(FITC/PE/PerCP)免疫熒光染色分析淋巴細胞免疫表型管號三色熒光標記的單抗染色目的與染色細胞

1

MouseIgG1FITC/MouseIgG1PE/陰性對照

CD45PerCP2CD3FITC/CD19PE/CD45PerCP總T和總B淋巴細胞3CD3FITC/CD4PE/CD45PerCPT輔助細胞4CD3FITC/CD8PE/CD45PerCPT抑制細胞5CD3FITC/CD16+56PE/CD45PerCPNK細胞注:用SSC/CD45PerCP設定淋巴細胞門。淋巴細胞免疫表型

CD45和CD14在白細胞上有著不同的表達，固它們可用來在光散射坐標上區分淋巴細胞群體或其它細胞（如粒細胞，單核細胞等）。

CD45與CD14在白細胞的表達情況：淋巴細胞免疫表型

1.所有白細胞都表達CD45，它是一個白細胞共同抗原（又名T200）。其中淋巴細胞與嗜酸性粒細胞表達最高（4＋），單核細胞中等表達（3＋），中性粒細胞表達弱（2＋）。而紅細胞、血小板和非血細胞都不表達CD45。所以CD45染色可排出白細胞以外的所有細胞成分。并將不同白細胞大致分開。2.因為所有的白細胞都表達CD45,所以不能僅用一固定的陰性標準來區分淋巴細胞、單核細胞和粒細胞。3.CD14在單核細胞上高表達,在成熟粒細胞弱表達。而淋巴細胞CD14陰性。淋巴細胞免疫表型

此時聯合使用CD45與CD14和光散射參數，就能在外周血中區分出各類型的細胞甚至幼稚細胞（如白血病）。淋巴細胞高表達CD45，并極少或不表達CD14，同時這些細胞的前向或側向散射光信號弱。粒細胞弱表達CD45和CD14，（很容易與淋巴細胞相區分）。同時這些細胞的前向、側向散射光信號強。單核細胞中等表達CD45，其側向散射光信號強，前向散射光信號較粒細胞弱。淋巴細胞免疫表型圖示FSC/SSC及CD45/CD14散點圖：1）由于不同白細胞的CD45/CD14表達不同，故可在右側散點圖中分出不同區域。R1為淋巴細胞群（紅色）；R2為中性粒細胞（綠色）；R3為嗜酸性粒細胞（品紅）；R4為單核細胞（天藍）；R5為細胞碎片（深黃色）。2）通過R1~R5設置，在FSC/SSC散點圖中即可映射出各種細胞的分布區域。將淋巴細胞射門為R6，其中淋巴細胞占95％以上。運用CD3/CD19進行熒光補償調節

CD3是T淋巴細胞特異性抗原，CD19則可用來識別B細胞。如運用CD3/CD19雙標記試劑染色，應沒有CD3和CD19雙陽性細胞群體存在。因此當運用CD3/CD19雙染色時，只會出現單陽性細胞。據此進行熒光補償調節。淋巴細胞免疫表型12％76％B細胞T細胞淋巴細胞：T細胞與B細胞的區分淋巴細胞免疫表型運用CD3/CD4來鑒定CD4＋T淋巴細胞

如同其它許多單克隆抗體一樣，抗CD4抗體并不是完全只與輔助/誘導性T淋巴細胞發生反應,它還會與單核細胞結合。因此如要鑒別CD4＋的輔助/誘導性T淋巴細胞，則需要加入CD3抗體。

CD3為全部T細胞表達，所以CD3/CD4雙陽性細胞才是真正的輔助/誘導性T淋巴細胞。（HIV感染時，此淋巴細胞數量明顯下降）。此外，CD3-/CD4+細胞群體是由單核細胞組成。淋巴細胞免疫表型輔助/誘導性T淋巴細胞（CD3/CD4雙陽性細胞）49％淋巴細胞免疫表型運用CD3/CD8來鑒定CD8＋T淋巴細胞

CD8的表達不只限于細胞毒/抑制性T淋巴細胞表達，這種抗原在部分NK細胞上也能檢測到，故CD8必須與CD3一起來鑒定細胞毒/抑制性T淋巴細胞。

CD3為全部T細胞表達，所以CD3/CD8雙陽性細胞才是真正的細胞毒/抑制性T淋巴細胞。

CD3-/CD8+細胞包括一部分NK細胞和少數粒細胞,但由于它們不表達CD3,易于與CD3+/CD8+的細胞毒/抑制性T淋巴細胞區別開來。淋巴細胞免疫表型

細胞毒/抑制性T淋巴細胞（CD3/CD8雙陽性細胞）26％NK細胞

CD16表達于大多NK細胞上，但也表達于中性粒細胞上，這種抗原在NK細胞的表達比較弱，并在NK細胞活化時丟失。

CD56表達于大多數NK細胞上，也表達于一些T淋巴細胞上，當與CD3聯合使用，就可以區分CD3+/CD56+T淋巴細胞和CD3-/CD56+NK細胞。如果聯合使用三種單抗就能完全的鑒定所有的NK細胞，因為NK細胞或表達CD16，或表達CD56，而不表達CD3。CD16和CD56聯合使用，根據熒光強度可將NK從雙陰性細胞中區分出來。運用這組試劑，NK細胞可形成獨立的群體與其它細胞相區分。淋巴細胞免疫表型NK細胞（CD16＋CD56＋CD3-）11％正常人淋巴細胞免疫表型(雙色免疫熒光染色):總T淋