RNA干擾抗乙肝病毒感染，離臨床應用還有多遠？RNA干擾抗乙肝病毒感染，離臨床應用還有多遠？1摘要1.RNA感染嚴重影響公眾健康。2.通過RNA干擾活化劑可使核酸安全持續地沉默，從而治療慢性HBV感染3.合成的短鏈干擾RNAs可以通過非病毒載體在胞質中傳遞到合適的位點，從而實現基因沉默。4.雖然這種技術已取得令人矚目的成就，但實現其臨床應用還面臨挑戰。摘要1.RNA感染嚴重影響公眾健康。2引言世界衛生組織估計世界已經有20億人感染了乙肝病毒，其中3億5000萬人已經發展為慢性，持續的感染增加了肝細胞癌和肝硬化的風險。肝細胞癌在世界上最常見癌癥中排行第六，并且在導致死亡的癌癥中排行第四。

引言世界衛生組織估計世界已經有20億人感染了乙肝病毒，其中33乙肝疫苗對于慢性攜帶者在預防感染和肝細胞癌方面卻幾乎沒有任何治療效果。可行的HBV治療方案包括核苷類似物和免疫調節劑，但是也僅有有限的功效，并且代價很高，包括相關的副作用和耐藥性發生。通過RNA干擾的途徑來抑制感染的方法依然占據主導地位乙肝疫苗對于慢性攜帶者在預防感染和肝細胞癌方面卻幾乎沒有任何4乙肝病毒基因結構乙肝病毒的基因組包含部分開環的雙鏈DNA(rcDNA),該核酸被衣殼包裹，同時被具有傳染性的乙肝病毒顆粒所包裹。負鏈DNA大約有3.2KB長，該鏈包含了整個HBV的基因組。正短鏈DNA更短并且在長度上更具有可變性。正鏈位于5’和3’負鏈的末端以維持rcDNA的圓形結構。乙肝病毒基因結構乙肝病毒的基因組包含部分開環的雙鏈DNA(r5肝細胞感染后rcDNA被釋放，同時在胞核被修復以形成共價閉合環狀DNA，它也作為模板轉錄乙型肝炎病毒的RNA。共價閉合環狀DNA的四重疊ORFs能編碼產生七種病毒蛋白。其中包括表面蛋白、酶、核心和e抗原。四種病毒激活子和兩個增強調控序列，大于3.5Kb基因組長度的前基因組RNA以及2.4kb、2.1kb和0.9kb亞基因組mRNA的生成。前基因組RNA的逆轉錄導致乙型肝炎病毒的基因組rcRNA形成。肝細胞感染后rcDNA被釋放，同時在胞核被修復以形成共價閉合6RNA干擾抗乙肝病毒課件7RNAi機制RNAi的機制是高度保守的轉錄后基因沉默，它被雙鏈RNA觸發，由22個核苷酸序列構成的小分子核苷酸。RNAi機制RNAi的機制是高度保守的轉錄后基因沉默，它被雙8

RNA聚合酶II促進因子初始小分子RNA前體小分子RNA加帽RNA誘導沉默復合物RNA聚合酶II促進因子初始小分子RNA前體加帽RNA誘9RNA誘導的沉默復合物在5’端熱力學穩定性很差，故被選擇為成熟miRNA的向導。miRNA向導與mRNA3‘端未翻譯區域結合實現基因沉默。即與同源靶向mRNA之間完整互補，從而使mRNA降解。RNA誘導的沉默復合物在5’端熱力學穩定性很差，故被選擇為成10外源性RNA干擾活化劑合成的小片段RNA是由21-25核苷酸長并帶有特征性的2個核苷酸3’末端的雙鏈組成。這些合成的siRNA有效的表達抗病毒序列使乙肝病毒在體內外的復制沉默，從而達到治療慢性乙肝病毒感染的目的。外源性RNA干擾活化劑合成的小片段RNA是由21-25核苷酸11為了能有效的在肝細胞內表達，表達基因盒通常合并為重組病毒載體，而siRNA通常使用合成物或非病毒載體來轉導。為了能有效的在肝細胞內表達，表達基因盒通常合并為重組病毒載體12抗乙肝病毒RNA干擾藥物的開發階段首先要解決RNAi能否有效的釋放到已經被乙肝病毒感染的肝細胞內，其次是實現持續的病毒復制沉默。分析評估療效通常使用分步法，包括有效的選擇抗HBV活化劑，融合于一個合適的載體里，同時測量抗病毒活性以及描述非目標效應。抗乙肝病毒RNA干擾藥物的開發階段首先要解決RNAi能否有效13RNA干擾活化劑的優化首先需要考慮的是有效性和安全性避免錯誤的細胞內mRNA的沉默確定有效沉默所需要的最低濃度防止病毒逃逸藥物同時減少源于先天免疫應答誘導以及細胞內mRNA錯誤沉默所造成的毒性。RNA干擾活化劑的優化首先需要考慮的是有效性和安全性14人工合成RNAi活化劑

首選方法是使用位于子區域的核苷酸的化學修飾引導化學合成的小干擾RNA進入細胞內涵體，這些siRNA常被視為異己，從而導致先天免疫應答的激活。人工合成RNAi活化劑

首選方法是使用位于子區域的核苷酸的化15表達RNAi活化劑理想情況下，表達的活化劑應該是專門針對乙肝病毒的，因此應該有一個偏移以利于誘導引導鏈抗乙肝shRNA盒的另一種途徑涉及到前體miRNA往返序列的利用。由于它經常出現多順反子，使往返序列多聚化，因此可以同步沉默多個目標HBV。表達RNAi活化劑理想情況下，表達的活化劑應該是專門針對乙肝16病毒復制模型中RNAi激活劑的功效和毒性測試乙肝病毒復制模型的一個重要缺點是它們不模擬乙肝病毒生命周期自然初始感染步驟。模型中的復制只是暫時的，并且這個過程本身就有肝毒性。液體注射和轉基因小鼠模型的一個重要限制是CCCDNA不在這些動物肝細胞中形成。病毒復制模型中RNAi激活劑的功效和毒性測試乙肝病毒復制模型17鴨乙肝病毒和土撥鼠肝炎病毒與HBV高度相似，故也已被用來模擬人類乙肝病毒感染。黑猩猩可能適合RNAi激活劑藥物的療效評估，但也有很大局限性鴨乙肝病毒和土撥鼠肝炎病毒與HBV高度相似，故也已被用來模擬18提供乙肝病毒載體的RNA干擾活化劑載體能夠高效安全的轉導抗病毒藥物，并且適合大規模制備，并且可以實現重復給藥。包括病毒載體和非病毒載體提供乙肝病毒載體的RNA干擾活化劑載體能夠高效安全的轉導抗病19病毒載體重組腺病毒：具有天然的肝臟親和性，能夠實現外源性基因在體內持久的表達。聚乙二醇化的重組腺病毒載體中的聚乙二醇由于減弱了免疫刺激和肝毒性，同時改進了重復給藥后的沉默，故以成為主流基因治療載體。病毒載體重組腺病毒：具有天然的肝臟親和性，能夠實現外源性基因20重組慢病毒載體也可用于RNAi抗乙肝病毒治療，優點：在細胞周期G1階段感染增強前病毒DNA穩定整合使RNAi表達延長重組慢病毒載體也可用于RNAi抗乙肝病毒治療，優點：21慢病毒載體能夠實現體外肝細胞轉導，優勢：選擇性肝細胞修飾消除免疫刺激導致的抗原呈遞細胞載體轉導減弱有系統的全身給藥所帶來的全身毒性或炎癥反應。慢病毒載體能夠實現體外肝細胞轉導，優勢：22面臨的問題：如何獲得足夠的移植細胞以供轉導乙肝病毒耐藥肝細胞的選擇優勢實現長期轉基因治療的表達避免插入突變避免植入轉導的干細胞具有的潛在致癌性面臨的問題：23非病毒載體包括陽離子脂質核酸復合物，脂質，核酸聚合物以及修飾的脂質復合物NVVs能被濃縮以及中和核酸的負電荷以形成統一的直徑小于100納米的小顆粒，從而有利于與有窗孔的肝毛細管交聯。siRNA有效負載的保護和避免與宿主蛋白的相互作用是其優點。非病毒載體包括陽離子脂質核酸復合物，脂質，核酸聚合物以及修飾24優勢：能夠被化學修飾可以實現大規模的合成與siRNA能夠良好的兼容免疫原性可以隨著配方的不同而變化優勢：25結論以RNAi為基礎的抗HBV藥物尚未達到臨床測試的階段。RNAi有效和特異性HBV復制比例通常大于90%，對于治療以足夠，但由合成間接siRNARNAi激活劑造成短暫的失效需要重復給藥。結論以RNAi為基礎的抗HBV藥物尚未達到臨床測試的階段。26抗病毒沉默的脫靶效應引起潛在的副作用免疫刺激作用和錯誤的細胞信使RNA沉默也是急需解決的問題合成和表達的RNAi活化劑的劑量調節仍然是個難題。帶有固有缺陷的替代模型的使用不能完全模擬HBV感染的人體抗病毒沉默的脫靶效應引起潛在的副作用27謝謝你的閱讀知識就是財富豐富你的人生謝謝你的閱讀知識就是財富28RNA干擾抗乙肝病毒感染，離臨床應用還有多遠？RNA干擾抗乙肝病毒感染，離臨床應用還有多遠？29摘要1.RNA感染嚴重影響公眾健康。2.通過RNA干擾活化劑可使核酸安全持續地沉默，從而治療慢性HBV感染3.合成的短鏈干擾RNAs可以通過非病毒載體在胞質中傳遞到合適的位點，從而實現基因沉默。4.雖然這種技術已取得令人矚目的成就，但實現其臨床應用還面臨挑戰。摘要1.RNA感染嚴重影響公眾健康。30引言世界衛生組織估計世界已經有20億人感染了乙肝病毒，其中3億5000萬人已經發展為慢性，持續的感染增加了肝細胞癌和肝硬化的風險。肝細胞癌在世界上最常見癌癥中排行第六，并且在導致死亡的癌癥中排行第四。

引言世界衛生組織估計世界已經有20億人感染了乙肝病毒，其中331乙肝疫苗對于慢性攜帶者在預防感染和肝細胞癌方面卻幾乎沒有任何治療效果?？尚械腍BV治療方案包括核苷類似物和免疫調節劑，但是也僅有有限的功效，并且代價很高，包括相關的副作用和耐藥性發生。通過RNA干擾的途徑來抑制感染的方法依然占據主導地位乙肝疫苗對于慢性攜帶者在預防感染和肝細胞癌方面卻幾乎沒有任何32乙肝病毒基因結構乙肝病毒的基因組包含部分開環的雙鏈DNA(rcDNA),該核酸被衣殼包裹，同時被具有傳染性的乙肝病毒顆粒所包裹。負鏈DNA大約有3.2KB長，該鏈包含了整個HBV的基因組。正短鏈DNA更短并且在長度上更具有可變性。正鏈位于5’和3’負鏈的末端以維持rcDNA的圓形結構。乙肝病毒基因結構乙肝病毒的基因組包含部分開環的雙鏈DNA(r33肝細胞感染后rcDNA被釋放，同時在胞核被修復以形成共價閉合環狀DNA，它也作為模板轉錄乙型肝炎病毒的RNA。共價閉合環狀DNA的四重疊ORFs能編碼產生七種病毒蛋白。其中包括表面蛋白、酶、核心和e抗原。四種病毒激活子和兩個增強調控序列，大于3.5Kb基因組長度的前基因組RNA以及2.4kb、2.1kb和0.9kb亞基因組mRNA的生成。前基因組RNA的逆轉錄導致乙型肝炎病毒的基因組rcRNA形成。肝細胞感染后rcDNA被釋放，同時在胞核被修復以形成共價閉合34RNA干擾抗乙肝病毒課件35RNAi機制RNAi的機制是高度保守的轉錄后基因沉默，它被雙鏈RNA觸發，由22個核苷酸序列構成的小分子核苷酸。RNAi機制RNAi的機制是高度保守的轉錄后基因沉默，它被雙36

RNA聚合酶II促進因子初始小分子RNA前體小分子RNA加帽RNA誘導沉默復合物RNA聚合酶II促進因子初始小分子RNA前體加帽RNA誘37RNA誘導的沉默復合物在5’端熱力學穩定性很差，故被選擇為成熟miRNA的向導。miRNA向導與mRNA3‘端未翻譯區域結合實現基因沉默。即與同源靶向mRNA之間完整互補，從而使mRNA降解。RNA誘導的沉默復合物在5’端熱力學穩定性很差，故被選擇為成38外源性RNA干擾活化劑合成的小片段RNA是由21-25核苷酸長并帶有特征性的2個核苷酸3’末端的雙鏈組成。這些合成的siRNA有效的表達抗病毒序列使乙肝病毒在體內外的復制沉默，從而達到治療慢性乙肝病毒感染的目的。外源性RNA干擾活化劑合成的小片段RNA是由21-25核苷酸39為了能有效的在肝細胞內表達，表達基因盒通常合并為重組病毒載體，而siRNA通常使用合成物或非病毒載體來轉導。為了能有效的在肝細胞內表達，表達基因盒通常合并為重組病毒載體40抗乙肝病毒RNA干擾藥物的開發階段首先要解決RNAi能否有效的釋放到已經被乙肝病毒感染的肝細胞內，其次是實現持續的病毒復制沉默。分析評估療效通常使用分步法，包括有效的選擇抗HBV活化劑，融合于一個合適的載體里，同時測量抗病毒活性以及描述非目標效應。抗乙肝病毒RNA干擾藥物的開發階段首先要解決RNAi能否有效41RNA干擾活化劑的優化首先需要考慮的是有效性和安全性避免錯誤的細胞內mRNA的沉默確定有效沉默所需要的最低濃度防止病毒逃逸藥物同時減少源于先天免疫應答誘導以及細胞內mRNA錯誤沉默所造成的毒性。RNA干擾活化劑的優化首先需要考慮的是有效性和安全性42人工合成RNAi活化劑

首選方法是使用位于子區域的核苷酸的化學修飾引導化學合成的小干擾RNA進入細胞內涵體，這些siRNA常被視為異己，從而導致先天免疫應答的激活。人工合成RNAi活化劑

首選方法是使用位于子區域的核苷酸的化43表達RNAi活化劑理想情況下，表達的活化劑應該是專門針對乙肝病毒的，因此應該有一個偏移以利于誘導引導鏈抗乙肝shRNA盒的另一種途徑涉及到前體miRNA往返序列的利用。由于它經常出現多順反子，使往返序列多聚化，因此可以同步沉默多個目標HBV。表達RNAi活化劑理想情況下，表達的活化劑應該是專門針對乙肝44病毒復制模型中RNAi激活劑的功效和毒性測試乙肝病毒復制模型的一個重要缺點是它們不模擬乙肝病毒生命周期自然初始感染步驟。模型中的復制只是暫時的，并且這個過程本身就有肝毒性。液體注射和轉基因小鼠模型的一個重要限制是CCCDNA不在這些動物肝細胞中形成。病毒復制模型中RNAi激活劑的功效和毒性測試乙肝病毒復制模型45鴨乙肝病毒和土撥鼠肝炎病毒與HBV高度相似，故也已被用來模擬人類乙肝病毒感染。黑猩猩可能適合RNAi激活劑藥物的療效評估，但也有很大局限性鴨乙肝病毒和土撥鼠肝炎病毒與HBV高度相似，故也已被用來模擬46提供乙肝病毒載體的RNA干擾活化劑載體能夠高效安全的轉導抗病毒藥物，并且適合大規模制備，并且可以實現重復給藥。包括病毒載體和非病毒載體提供乙肝病毒載體的RNA干擾活化劑載體能夠高效安全的轉導抗病47病毒載體重組腺病毒：具有天然的肝臟親和性，能夠實現外源性基因在體內持久的表達。聚乙二醇化的重組腺病毒載體中的聚乙二醇由于減弱了免疫刺激和肝毒性，同時改進了重復給藥后的沉默，故以成為主流基因治療載體。病毒載體重組腺病毒：具有天然的肝臟親和性，能夠實現外源性基因48重組慢病毒載體也可用于RNAi抗乙肝病毒治療，優點：在細胞周期G1階段感染增強前病毒DNA穩定整合使RNAi表達延長重組慢病毒載體也可用于RNAi抗乙肝病毒治療，優點：49慢病毒載體能夠實現體外肝細胞轉導，優勢：選擇性肝細胞修飾消