應用二維電泳、液相色譜串聯質譜技術篩選前列腺癌骨轉移相關血清蛋白碩士學位論文答辯導師:李鳴學生:程志強2009年5月26日恩師:李鳴1992德國美茵茲大學醫學博士1998-2001美國休士頓MDAnderson腫瘤中心工作學習2001年任美國休士頓Baylor醫學院助理教授2003-2007年任北京大學泌尿外科研究所副所長2007.7-現在北京腫瘤醫院泌尿外科主任中華醫學會泌尿外科分會腫瘤學組副組長兼秘書長，《中國前列腺癌診斷治療指南》主編

，中國前列腺癌協作組組長程志強簡歷1991-1996北華大學醫學院臨床醫學本科

預備黨員、通過英語CET-4、體育部長…1996-2006吉林油田職工醫院住院醫師主治醫師2006-2007北京大學醫學部碩士研究生2007-2009北京大學腫瘤醫院泌尿外科碩士研究生《腫瘤防治研究》發表論著一篇前列腺癌流行病學世界范圍內第二常見惡性腫瘤明顯地理和種族差異:亞洲低,歐美高黑人高我國2002年標化發病率為1.6/10萬,發病率逐年升高:上海1973-19751.8/10萬1997-19995.5/10萬發病率上升的原因疾病危險因素的真正增加(見后)PSA篩查,前列腺穿刺活檢及經尿道前列腺電切術(TUR-P)發現臨床潛伏前列腺癌前列腺癌的危險因素

RiskFactors尚未確定的危險因素高動物脂肪飲食雄激素受體維生素D受體谷胱甘肽轉硫酶M1…前列腺癌的治療

和目前的難題內分泌治療手術去勢:切除雙側睪丸藥物去勢:黃體生成素釋放激素:LHRH-a抗雄激素藥物:氟他胺比卡魯胺原理:前列腺癌細胞的增殖依賴于雄激素受體的的激活去勢治療：降低血中雄激素水平抗雄激素藥物：抑制雙氫睪酮與雄激素受體的結合前列腺癌骨轉移前列腺癌細胞與骨質微環境之間存在著特異性的相互作用,雖然前列腺癌細胞可以向全身器官組織轉移,但骨質局部環境中產生的細胞因子會增加其對骨髓基質細胞的趨向和粘附能力,從而使之更容易形成轉移灶。

前列腺癌骨轉移腫瘤骨轉移可以分為溶骨型和成骨型。前列腺癌骨轉移絕大多數表現為成骨型。事實上,在前列腺癌的骨轉移病灶中,溶骨性和成骨性過程都是活躍的。從細胞水平來看,轉移的前列腺癌細胞首先與破骨細胞反應,產生溶骨現象,為以后的成骨提供了必要的空間、營養物質和鈣離子。同時,前列腺癌細胞又與成骨細胞作用產生骨硬化。從組織形態學來看,溶骨性病變有繼發的骨形成,而成骨性病變中也觀察到溶解現象。只是由于骨塑性過程中成骨性病變占主導地位,而最終導致骨硬化。前列腺癌骨轉移前列腺癌經多途徑轉移,其中35%為血源傳播。傳統的是經下腔靜脈轉移到血管豐富的承重骨,如長骨近端、脊椎、骨盆,以及肋骨等紅骨髓豐富的部位。另外,椎靜脈叢系統具有壓力低、容積大,與肋間靜脈、肺靜脈、腔靜脈、門靜脈廣泛相互交通等特點。有證據表明,某些一過性暫時性腹壓增高,會促進前列腺癌細胞通過椎靜脈叢向腔靜脈內搏動性釋放,故可形成脊椎和其他內臟轉移。前列腺癌骨轉移前列腺癌是歐美國家最為常見的泌尿系惡性腫瘤,在我國發病率有逐年升高的趨勢,且發現時多已達進展期。遠處轉移是前列腺癌患者最主要的死亡原因,超過80%的患者會發生骨轉移，并可以引發許多并發癥,如疼痛、病理性骨折、高鈣血癥、脊髓壓迫及其他神經壓迫綜合征等，這些骨轉移相關事件既影響前列腺癌患者的生活質量，又加速了前列腺癌患者的死亡。本課題的立論依據

和課題設計縮寫

2-DE

：two-dimensionalgelelectrophoresis

二維電泳CapLC

：capillaryliquidchromatography毛細管液相色譜MS/MS串聯質譜立論依據2-DE技術半定量分析不同的蛋白質組,即對不同狀態樣品所表達蛋白質的動態差異分析,如正常和惡化細胞、細胞對藥物的反應、生物體不同的特殊發展階段等。而應用質譜(massspectrometry,MS)分析可進行蛋白質鑒定和序列測定，樣品分子離子化后，根據不同離子之間的質荷比的差異來分離并確定不同蛋白質或多肽的相對質量得到肽質量指紋圖（peptide-massfingerprinting，PMF）結合經色譜、串聯質譜聯機測定得到的肽序列標簽（peptidesequencetagging，PST）查詢蛋白質數據庫確定蛋白質。實驗樣品的選擇本實驗所有樣本均取自北京大學第一醫院泌尿外科研究所2006年2月至2007年8月間住院患者。其中前列腺癌骨轉移患者12例，無骨轉移患者15例，年齡54~81歲，平均年齡70.2±7.6歲。所有患者均有前列腺穿刺活檢診斷證據，骨轉移患者經MRI和同位素骨掃描診斷。患者入選標準為無心腦血管疾病、糖尿病、高血脂、高血壓、嚴重肝腎疾病、甲狀腺疾病及其他良、惡性腫瘤。27例患者均為初診。所有患者均在治療前采取清晨空腹靜脈血，經促凝、離心、分離血清、分裝、-80°C冰箱保存備用。

國內相關研究情況利用雙向凝膠電泳和質譜技術進行前列腺癌差異蛋白質組學研究方法培養前列腺癌雄激素依賴型(LNCaP)和非依賴型(DU145)細胞系,分別提取兩種細胞系的總蛋白,進行等電點聚焦和SDS2聚丙烯酰胺凝膠電泳,對所得膠圖利用ImageMaster4.01軟件進行分析,選取差異點進行質譜分析,對分析結果進行數據庫檢索。結論在前列腺癌激素依賴型和激素非依賴型細胞系中存在差異表達蛋白質,并可以利用雙向凝膠電泳技術進行分離,為進一步研究前列腺癌的蛋白質組學和發病機制提供了線索。

山西醫科大學學報2008年4月。

國外相關研究情況SerumLevelsofanIsoformofApolipoproteinA-IIasaPotentialMarkerforProstateCancerProstatecancerandbenignprostatehyperplasiaserum

gelelectrophoresis

liquidchromatography,

tandemmassspectroscopy

immunoassayResultsApoA-IIisspecificallyoverexpressedinserumfromindividualswithprostatecancer.ApoA-IIwasalsooverexpressedintheserumofindividualswithprostatecancerwhohavenormalprostate-specificantigen(0-4.0ng/mL).DepartmentofPathology,UniversityofAlabamaatBirmingham,Alabama.ClinicalCancerResearch.February1,2005.國外相關研究情況IdentificationofSerumAmyloidAasaBiomarkertoDistinguishProstateCancerPatientswithBoneLesions.serafromprostatecancerpatients(n=

38)withandwithoutbonemetastases.two-dimensionalgelelectrophoresisSELDI-TOFMSELISA.Results:TheclusterofuniqueproteinsintheseraofpatientswithbonemetastaseswasidentifiedasisoformsofserumamyloidA.Conclusions:SELDI-TOFMSproteinprofilingincombinationwithotherproteomicapproachesmayprovidediagnostictoolswithpotentialclinicalapplicationsandserveastoolstoaidinthediscoveryofbiomarkersassociatedwithvariousdiseases.

BritishColumbiaCancerAgency,Vancouver,BritishColumbia,Canada.ClinicalChemistry2005.實驗研究二維電泳分別取適量兩組混合血清，用Bradford法進行蛋白定量,再用水化液調整到1μg/μl后上樣，蛋白質上樣量1mg。先做預實驗經PDQUEST2-DE軟件分析發現膠圖分辨率可以接受，遂未做血清高豐度蛋白去除處理。操作嚴格按照Bio-Rad公司雙向電泳實驗操作手冊進行。采用IPG預制膠條17cmpH值3-10。開始電泳，梯度升壓,等電聚焦總伏小時為100kVh。平衡后膠條轉移至12.5%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上進行第2相電泳。16℃恒溫,采用恒定功率電泳,開始時2.5W/gel,1小時;再用15W/gel至溴酚藍到達凝膠的底部邊緣。每組實驗重復三次。毛細管液相色譜-電噴霧離子源-串聯質譜（CapLC-ESI-MS/MS）全自動分析

將經二維電泳分離考馬斯藍染色PDQUEST2-DE軟件確定的差異蛋白質斑點用刀片切下，切成1平方厘米的膠塊，置于Eppendorf管中，用100微升50%乙晴-100mmol/l碳酸氫銨洗2~3次，每次20分鐘，至膠粒完全脫色。脫色后的膠粒置于真空干燥器(SpeedVacSavantInstrumentsUSA)中干燥20分鐘，加入5~10微升10mg/l的胰蛋白酶液（含25mmol/l碳酸氫銨溶液，PH8.0）,置4攝氏度冰箱防治40分鐘，補加10微升25mmol/l碳酸氫銨緩沖液，37攝氏度溫育過夜。50~100微升50%三氟乙酸40攝氏度提取酶切肽段，一小時一次。用相同體積的50%丙烯晴-2.5%三氟乙酸溶液于30攝氏度提取，一小時一次。50微升丙烯晴超聲提取一次。合并3次提取液，用真空干燥器(SpeedVacSavantInstrumentsUSA)進行干燥。用3~5微升0.5%的三氟乙酸溶液溶解干燥后的蛋白樣品，取1.5ml樣品置于CapLC-ESI-MS/MS全自動分析儀的自動進樣管中脫鹽，脫鹽后的樣品進入C18毛細管柱進行肽段分離,分離后的肽段直接進入離子源,對于每一個強度超過閾值的肽段(一般為主峰強度的10%)都自動進行MS/MS測定。測定后的數據經ProteinLynx2.0(Waters)軟件處理，通過Mascot()查詢NCBI數據庫進行蛋白質鑒定。搜索參數設置為：數據庫為NCBInr,酶為胰蛋白酶,允許漏切位點為2，母離子誤差范圍±1.2Dalton,碎片離子±0.5Dalton。酶聯免疫吸附試驗ELISA分析

用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定樣本血清中ApoA-I的含量，嚴格按瑞典MabtechAB公司HumanApoA-IELISAKit說明書進行。用2μg/ml的鼠抗人ApoA-I單克隆抗體包被微孔板，制成固相抗體，再往包被單抗的微孔中依次加入ApoA-I抗原、生物素化的抗人ApoA-I抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的親和素，經過徹底洗滌后用底物四甲基聯苯胺（TMB）顯色。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），同時用試劑盒中提供的標準品制作標準曲線，根據樣品的OD值用標準曲線計算樣品濃度。統計方法采用SPSS10.0軟件兩組均數之間的比較用成組設計資料的t檢驗多組均數之間的比較用單因素方差分析。實驗結果雙向電泳二維電泳共得到6塊膠(G1,G2,G3,G4,G5,G6),G1~3為骨轉移組，G4~6為非骨轉移組膠圖。利用虛擬重建技術分別以蛋白質點較多的G1和G4膠為參考膠,進行虛擬重建,得到兩塊重建膠圖,利用統計學分析軟件SPSS10.0,通過χ2分析對兩組凝膠圖像的蛋白質點進行組內和組間差異性發現,兩組之間χ2=3.168,P=0.046<0.05，差異具有統計學意義,說明兩塊膠圖分辨率好，可以用來比較兩組間差異表達的蛋白質。經PDQUEST2-DE軟件分析,將3倍差異表達定為具有顯著性標準,共檢測出4個差異點，其中第4號蛋白質點在無骨轉移組高表達，第1、2和3號在骨轉移組高表達。雙向電泳

前列腺癌骨轉移組與非骨轉移組患者血清蛋白二維電泳圖及部分差異點

The2-Delectrophoretogramandpartsofdisparatepointsoftheserumofpatientofprostatecancerwithandwithoutosseousmetastasis

CapLC-ESI-MS/MS分析結果

差異蛋白點經CapLC-ESI-MS/MS分析后利用Mascot查詢NCBI數據庫，4個差異蛋白點共鑒定得到3種差異蛋白質（蛋白2和蛋白3為同一種蛋白）。其中第1號點為CK10、第2號點和第3號點同為SAA、第4號點為ApoA-I。這些蛋白中SAA和CK10在骨轉移患者中相對高表達，而ApoA-I在骨轉移患者相對低表達。CapLC-ESI-MS/MS分析結果前列腺癌骨轉移組與非骨轉移組患者血清中差異表達的蛋白質的鑒定結果Theoutcomesofidentificationofthedifferentialexpressionproteinsoftheserumofpatientofprostatecancerwithandwithoutosseousmetastasis

ELISA結果

ELISA測定所有27例樣本后經統計分析發現ApoA-I在這兩組患者之間的表達有差異（P<0.001）,有骨轉移的患者血清中ApoA-I的濃度低于無骨轉移的前列腺癌患者。有骨轉移前列腺癌患者血清中ApoA-I的濃度為324.3±6.9ng/ml;無骨轉移前列腺癌患者血清中ApoA-I的濃度為343.6±6.6ng/ml。ELISA結果ELISA測定的ApoA-I在前列腺癌骨轉移和非骨轉移組患者血清中濃度的統計分析ThestatisticalanalysisofthedensityoftheApoA-Iinthepatientsofprostatecancerwithandwithoutosseousmetastasis研究結論本實驗利用二維凝膠電泳及串聯質譜技術鑒定出了在前列腺癌有骨轉移患者和前列腺癌無骨轉移患者血清中表達量有差異的3個蛋白，這3個蛋白質分別為：ApoA-I、SAA及CK10，其中SAA和CK10在骨轉移患者組相對高表達，而ApoA1在骨轉移患者組相對低表達。ELISA實驗證實了ApoA-I在前列腺癌無骨轉移患者血清中含量升高。載脂蛋白A-I、SAA和CK10與前列腺癌骨轉移相關,可能作為前列腺癌骨轉移的診斷或預測標志物。

討論ApoA-I是高密度脂蛋白(High-densitylipoprotein,HDL)的主要蛋白質組分，是一種急性時相反應蛋白,具有結合磷脂、多種血漿因子及細胞膜受體、激活卵磷脂-膽固醇酰基轉移酶(Lecithin-cholesterolacyltransferase,LCAT)以及抑制炎癥細胞因子釋放[1]和延緩動脈粥樣硬化（artherosclerosis;AS）發生發展的作用。2008年劉桂芝等人報道ApoA-I在人I期肺癌組織及正常癌旁組織中具有差異表達。國外關于ApoA-I與前列腺癌相關性的報道最近的為2004年Zhang等人的研究，結果顯示前列腺癌患者血清載脂蛋白A-I濃度較正常對照者顯著降低。2005年Malik等人還報道HDL的另一個載脂蛋白成分載脂蛋白A-II（ApoA-II）在前列腺癌患者血清中濃度較正常對照者顯著升高。討論

SAA也是一