第十五章流式細(xì)胞技術(shù)與流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!概述流式細(xì)胞儀的定義:流式細(xì)胞儀是以激光為光源，集流體力學(xué)技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、計算機(jī)技術(shù)以及細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技儀器。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!流式細(xì)胞術(shù)的定義:應(yīng)用流式細(xì)胞儀對于處在快速直線流動狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行快速的、多參數(shù)的定量分析和分選的技術(shù)稱為流式細(xì)胞術(shù)。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!1934年Moldavan使懸浮的血紅細(xì)胞從一個毛細(xì)玻璃管中流過，每個通過的細(xì)胞可被一個光電裝置記錄下來，這可謂流式細(xì)胞儀的最初模型。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!1967年VanDilla和LosAlamos采用了Crosland-Taylor設(shè)計的層流流動室和氬離子激光器開發(fā)出了液流束、照明光軸，檢測系統(tǒng)三者互相垂直的流式細(xì)胞儀，成為目前各種流式細(xì)胞測量儀的基礎(chǔ)。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!80年代以來，流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)采集、存儲、顯示、分析日趨完善，隨著樣品制備方法的增多，新的熒光染料和細(xì)胞標(biāo)記物的出現(xiàn)，流式細(xì)胞儀的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!節(jié)流式細(xì)胞儀的工作原理一、生物學(xué)顆粒分析原理流式細(xì)胞技術(shù)是在單細(xì)胞水平上，對于處在快速直線流動狀態(tài)中的大量細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速的定量分析和分選的技術(shù)，現(xiàn)已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究最先進(jìn)的分析技術(shù)之一。應(yīng)用流式細(xì)胞儀對于處在快速直線流動狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行快速的、多參數(shù)的定量分析和分選的技術(shù)稱為流式細(xì)胞技術(shù)。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!

將懸浮分散的單細(xì)胞懸液，經(jīng)特異熒光染料染色后，放人樣品管。在氣體壓力的作用下，懸浮在樣品管中的單細(xì)胞懸液形成樣品流垂直進(jìn)入流式細(xì)胞儀的流動室，染色的細(xì)胞受激光照射后發(fā)出熒光，同時產(chǎn)生光散射。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!1.樣品的進(jìn)入流動室：將懸浮分散的單細(xì)胞懸液，經(jīng)特異熒光染料染色后，放人樣品管。在氣體壓力的作用下，懸浮在樣品管中的單細(xì)胞懸液形成樣品流垂直進(jìn)入流式細(xì)胞儀的流動室，沿流動室的軸心向下流動。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!3.信號的產(chǎn)生與接收：染色的細(xì)胞在測量區(qū)受激光照射后發(fā)出熒光，同時產(chǎn)生光散射。這些信號分別被光電倍增管和光電二極管接收，經(jīng)過計算機(jī)儲存、計算、分析這些數(shù)字化信息，就可得細(xì)胞的大小和核酸含量等指標(biāo)。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!

當(dāng)某類細(xì)胞的特性與要分選的細(xì)胞相同時，流式細(xì)胞儀就會在這類細(xì)胞形成液滴時給含有這類細(xì)胞的液滴充以特定的電荷，帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板間的靜電場時，依所帶電荷的符號分別向左偏轉(zhuǎn)或向右偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器內(nèi)。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!第二節(jié)流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)一、流式細(xì)胞儀的分類流式細(xì)胞儀根據(jù)功能不同可分為臨床型和科研型。臨床型只有分析功能，沒有分選功能，操作簡便，易學(xué)易掌握。科研型既有分析功能又有分選功能，可快速將所感興趣的細(xì)胞分選出來。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!狹縫掃描流式細(xì)胞儀被檢細(xì)胞直徑大于激光光斑直徑，細(xì)胞通過光束時各部分被依次掃描。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!（一）流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng)流動室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央開一個孔，供細(xì)胞單個流過，檢測區(qū)在該孔的中心，流動室內(nèi)充滿了鞘液,鞘液的作用是將樣品流環(huán)包。樣品流在鞘流的環(huán)包下形成聚焦，保證每個細(xì)胞通過激光照射區(qū)的時間相等，從而得到準(zhǔn)確的細(xì)胞熒光信息。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!（二）激光光源與光束成形系統(tǒng)激光是一種相干光源，它能提供單波長、高強度及穩(wěn)定性高的光照。由于細(xì)胞的快速流動，每個細(xì)胞經(jīng)過光照區(qū)的時間僅為1μs左右，且細(xì)胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號強弱，與被照射的時間和激發(fā)光的強度有關(guān)，因此細(xì)胞必須達(dá)到足夠的光照強度。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!（三）光學(xué)系統(tǒng)FCM的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片和小孔組成。濾光片主要分為：1.長通濾光片長通濾光片使特定波長以上的光通過。2.短通濾光片特定波長以下的光通過。3.帶通濾光片帶通濾光片允許一定波長范圍內(nèi)的光通過流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!1.散射光信號

射光分為前向角散射和側(cè)向角散射，散射光不依賴任何細(xì)胞樣品的制備技術(shù)(如染色)，稱為細(xì)胞的物理參數(shù)（或稱固有參數(shù)）。（1）前向角散射前向角散射與被測細(xì)胞的大小有關(guān)（2）側(cè)向角散射側(cè)向散射光可提供細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!2.熒光信號

（1）熒光信號線性測量和對數(shù)測量線性放大器的輸出與輸入是線性關(guān)系，細(xì)胞DNA含量、RNA含量、總蛋白質(zhì)含量等的測量一般選用線性放大測量。在細(xì)胞膜表面抗原等的熒光檢測時通常使用對數(shù)放大器。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!（3）光譜重疊的校正當(dāng)細(xì)胞攜帶兩種熒光受激光激發(fā)而發(fā)射兩種不同波長的熒光時，理論上可選擇濾片使每種熒光僅被相應(yīng)的檢測器檢測，但由于目前所使用的各種熒光染料都是寬發(fā)射譜性質(zhì)，雖然它們之間發(fā)射峰值各不相同，但發(fā)射譜范圍有一定的重疊。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!圖中點A通過透鏡f成像在A’處，而點B通過透鏡f成像在B’處。在光電倍增管前放上一小孔，作為空間濾波器，排除其它雜散光信號，從而確保了A點光源進(jìn)不了B’點處，B點光源也進(jìn)不了A’點處。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁!2．邏輯電路

為了分選細(xì)胞，需要細(xì)胞在經(jīng)過測量區(qū)時判斷出哪個細(xì)胞滿足了分選的條件，并產(chǎn)生一個邏輯信號，此信號驅(qū)動充電脈沖發(fā)生器，使之產(chǎn)生充電脈沖。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁!（六）FCM測量數(shù)據(jù)的存貯、顯示與分析目前FCM數(shù)據(jù)的存貯的方式均采用列表排隊(ListMode)方式。目前FCM所采用的都是多參數(shù)指標(biāo)，熒光標(biāo)記物參數(shù)數(shù)量在逐漸增多。采用ListMode方式可大量節(jié)約內(nèi)存和磁盤容量。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁!第三節(jié)流式細(xì)胞儀的主要性能指標(biāo)一、熒光測量靈敏度靈敏度的高低是衡量儀器檢測微弱熒光信號的重要指標(biāo)。一般以能檢測到單個微球上最少標(biāo)有FITC或PE熒光分子數(shù)目來表示，現(xiàn)在的FCM均可達(dá)到檢測小于100個熒光分子的指標(biāo)。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁!三、前向角散射光檢測靈敏度前向角散射光檢測靈敏度是指能夠檢測到的最小顆粒大小，一般目前商品化的FCM可以測量到0.2～0.5μm左右。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁!五、FCM分選指標(biāo)分選指標(biāo)主要包括分選速度、分選純度和分選收獲率。分選速度指每秒可提取所要細(xì)胞的個數(shù)。分選純度指要分選的目的細(xì)胞占分選出細(xì)胞的百分比。分選收獲率指被分出的細(xì)胞與原來溶液中該細(xì)胞的百分比。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁!一、檢測樣品制備的重要性因為流式細(xì)胞儀測量的是每個細(xì)胞所產(chǎn)生的散射光和熒光信號，如果兩個或多個細(xì)胞間粘連重疊或細(xì)胞碎片過多，都會影響信號的收集及所收集信號的真實性，所以制備單細(xì)胞懸液是進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析最關(guān)鍵的步。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁!焦寧Y與異硫氰酸熒光素（FITC，530nm）分別是RNA與蛋白質(zhì)的特異性染料；碘化丙啶（PI，620nm）與FITC雙染可測知單個細(xì)胞內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)量的變化；丫啶橙（AO，488nm）染色法不僅可測定單個細(xì)胞DNA與RNA含量，還可區(qū)分出G0與G1期細(xì)胞；若丹明123（rhodamin123）是線粒體特殊染料。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁!1．光路與流路校正主要目的在于確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，使儀器檢測時的變異減少到最小，從而控制儀器的CV值。在流路校正物中，有標(biāo)準(zhǔn)大小的熒光微球，其物理性質(zhì)、生物學(xué)特性和化學(xué)特性均經(jīng)過標(biāo)定。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁!3．絕對計數(shù)的校準(zhǔn)

為保證儀器在計數(shù)時的準(zhǔn)確性，儀器應(yīng)采用絕對計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品建立絕對計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)品是經(jīng)標(biāo)定的，如以計算1000個細(xì)胞為1ml，作為設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)。在樣本測定時，以此為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行絕對計數(shù)，從而獲得絕對計數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)值。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第29頁!故障信息引起故障的原因解決方法清洗液高度錯誤清洗液少了加清洗液清洗液高度警示清洗液傳感器失靈與公司聯(lián)系數(shù)據(jù)處理速率錯誤數(shù)據(jù)太大，難以處理稀釋樣品文件名錯誤輸入的文件名與系統(tǒng)沖突輸入另一個文件名二、常見故障及排除流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第30頁!故障信息引起故障的原因解決方法激光器開啟錯誤激光器門打開關(guān)激光器門參數(shù)太多選擇的參數(shù)應(yīng)小于8個取消某些參數(shù)，重新選擇參數(shù)不存在程序中無此參數(shù)重新建立程序流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第31頁!第六節(jié)流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用一、流式細(xì)胞儀在免疫學(xué)中的應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)廣泛地應(yīng)用于免疫理論研究及其臨床實踐，所以有人稱之為現(xiàn)代免疫技術(shù)基石之一。尤其同單克隆抗體的結(jié)合應(yīng)用，在淋巴細(xì)胞及其亞群分析、淋巴細(xì)胞功能分析、免疫分型、分選、腫瘤細(xì)胞的免疫檢測、研究細(xì)胞周期等方面都起著相當(dāng)重要的作用。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第32頁!利用流式細(xì)胞儀，采用多色熒光標(biāo)記的單克隆抗體，分析黏附性T細(xì)胞表面CD3＋CD4＋或CD8＋CD19－CD16－CD45RO＋CD62＋CD27＋CD57抗原，從而對LFA-1-adhesiveT細(xì)胞快速準(zhǔn)確地測定。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第33頁!血小板膜表面受體檢測血小板膜上有豐富的糖蛋白受體，是血小板發(fā)揮其功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，靜止期和活化期的血小板膜糖蛋白受體的種類、含量、結(jié)構(gòu)和功能顯著不同。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測血小板膜上受體，主要是對血小板特異性膜糖蛋白和活化標(biāo)志物進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，結(jié)合單克隆抗體和免疫熒光技術(shù)，用不同的抗血小板單克隆抗體，可以從分子水平上診斷血小板功能和數(shù)量的異常。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第34頁!二、流式細(xì)胞儀在血液學(xué)中的應(yīng)用血液病多為腫瘤性、免疫性和遺傳性疾病，惡性血液病約占其總數(shù)一半以上。FCM在血液細(xì)胞的分類、分型，造血細(xì)胞分化的研究，血細(xì)胞中各種酶的定量分析，如過氧化物酶、非特異性酯酶等方面應(yīng)用廣泛。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第35頁!三、流式細(xì)胞儀在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)研究中，應(yīng)用最頻繁也最普通的是細(xì)胞周期分析，研究細(xì)胞周期或DNA倍體與細(xì)胞表面受體及抗原表達(dá)的關(guān)系，包括細(xì)胞周期各時相的百分比和細(xì)胞周期動力學(xué)參數(shù)的測定等內(nèi)容。對同一細(xì)胞的參數(shù)測定技術(shù)則導(dǎo)致了對細(xì)胞周期的一些新發(fā)現(xiàn)，典型的方法是吖啶橙雙染色技術(shù)。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第36頁!五、FCM對自身免疫性疾病HLA抗原的分析利用FCM可以進(jìn)行HLA-B27／HLA-B7雙標(biāo)記抗體檢測HLA-B27陽性細(xì)胞，同時又可排出交叉反應(yīng)。通常58％～97％的強直性脊柱炎患者可檢出這種抗原，而正常人僅2％～7％可檢出這種抗原。FCM檢測HLA-B27快速、特異、敏感，為強制性脊柱炎的臨床診斷提供了有力的幫助。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第37頁!1965年Kamentsky用紫外吸收和可見光散射兩個參數(shù)同時測量未染色的細(xì)胞，給出了細(xì)胞中核酸的含量和細(xì)胞大小，奠定了多參數(shù)流式細(xì)胞測量的基礎(chǔ)。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第38頁!1969年Fulwyler利用Sweet的靜電墨水噴射液滴偏轉(zhuǎn)技術(shù)，建立了流式細(xì)胞分選術(shù)。Ehrlich和Wheeless利用飛點掃描技術(shù)和縫掃描技術(shù)使零分辨率的流式細(xì)胞儀變成了低分辨率的流式細(xì)胞儀。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第39頁!

進(jìn)入90年代，標(biāo)本制備儀和自動進(jìn)樣器的問世，以及適合臨床應(yīng)用的單克隆抗體的增加，使流式細(xì)胞儀不僅出現(xiàn)在大專院校和科研單位，它也逐漸進(jìn)入醫(yī)院的中心實驗室和檢驗科。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第40頁!生物學(xué)顆粒包括大的免疫復(fù)合物、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、病毒顆粒、脂質(zhì)體、細(xì)胞器、細(xì)菌、霉菌、染色體、真核細(xì)胞、雜交細(xì)胞、聚集細(xì)胞等，所檢測的生物顆粒的理化性質(zhì)包括細(xì)胞大小、細(xì)胞形態(tài)、胞漿顆粒化程度、DNA含量、總蛋白質(zhì)含量、細(xì)胞膜完整性和酶活性等。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第41頁!鞘液和樣品流在噴嘴附近組成一個圓柱流束，與水平方向的激光束垂直相交，染色的細(xì)胞受激光照射后發(fā)出熒光，這些信號分別被光電倍增管熒光檢測器和光電二極管散射光檢測器接收，經(jīng)過計算機(jī)儲存、計算、分析這些數(shù)字化信息，就可得到細(xì)胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性質(zhì)等物理和生化指標(biāo)。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第42頁!2.鞘液的作用：流動室軸心至外壁的鞘液也向下流動，形成包繞細(xì)胞懸液的鞘液流，鞘液和樣品流在噴嘴附近組成一個圓柱流束，自噴嘴的圓形孔噴出，與水平方向的激光束垂直相交，相交點稱為測量區(qū)。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第43頁!在壓電晶體上加上頻率為30kHz的信號，使液柱斷裂成一連串均勻的液滴。當(dāng)某類細(xì)胞的特性與要分選的細(xì)胞相同時，流式細(xì)胞儀就會在這類細(xì)胞形成液滴時給含有這類細(xì)胞的液滴充以特定的電荷，帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板間的靜電場時，依所帶電荷的符號分別向左偏轉(zhuǎn)或向右偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器內(nèi)，從而達(dá)到細(xì)胞分類收集的目的。二、流式細(xì)胞儀細(xì)胞分選原理流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第44頁!流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第45頁!流式細(xì)胞儀根據(jù)其結(jié)構(gòu)不同又可分為一般流式細(xì)胞儀和狹縫掃描流式細(xì)胞儀。前者的光斑直徑大于被檢細(xì)胞體積，只能提供細(xì)胞內(nèi)某種生物化學(xué)成分的參數(shù)。狹縫掃描流式細(xì)胞儀被檢細(xì)胞直徑大于激光光斑直徑，可計算出細(xì)胞直徑大小、核直徑大小、核漿比例等一系列的形態(tài)學(xué)信息的定量資料。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第46頁!

流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)可分為流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)；激光光源及光束成形系統(tǒng)；光學(xué)系統(tǒng)；信號檢測與存貯、顯示、分析系統(tǒng)；細(xì)胞分選系統(tǒng)等五個部分。二、流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第47頁!

由右圖可知，空氣泵產(chǎn)生壓縮空氣，通過鞘流壓力調(diào)節(jié)器加在鞘液上一恒定的壓力，這樣鞘液以勻速運動流過流動室，在整個系統(tǒng)運行中流速是不變的。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第48頁!

由于激光焦點處能量分布為正態(tài)分布（見圖），中心處能量最高。因此，當(dāng)樣本速率選擇高速時，處在樣本流不同位置的細(xì)胞或顆粒，受激光照射的能量不一樣，從而被激發(fā)出的熒光強度也不相同。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第49頁!（四）信號檢測與分析當(dāng)細(xì)胞攜帶熒光素標(biāo)記物，通過激光照射區(qū)時，細(xì)胞內(nèi)不同物質(zhì)產(chǎn)生不同波長的熒光信號。這些信號以細(xì)胞為中心，向空間360度立體角發(fā)射，產(chǎn)生散射光和熒光信號。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第50頁!2.熒光信號當(dāng)激光光束與細(xì)胞正交時，一般會產(chǎn)生兩種熒光信號。一種是細(xì)胞自身在激光照射下發(fā)出微弱的熒光信號，稱為細(xì)胞自發(fā)熒光；另一種是經(jīng)過特異熒光素標(biāo)記細(xì)胞后，受激發(fā)照射得到的熒光信號，通過對這類熒光信號的檢測和定量分析能了解所研究細(xì)胞的性質(zhì)和數(shù)量。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第51頁!（2）熒光信號的面積和寬度熒光信號的面積是采用對熒光光通量進(jìn)行積分測量，一般對DNA倍體測量時采用面積，這是因為熒光脈沖的面積比熒光脈沖的高度更能準(zhǔn)確反映DNA的含量。熒光信號的寬度常用來區(qū)分雙連體細(xì)胞。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第52頁!

從右圖中可以看出，陰影為探測器檢測光譜的范圍，F(xiàn)ITC探測器會探測到少量的PE光譜，而PE探測器則檢測到較多的FITC光譜。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第53頁!（五）細(xì)胞分選器1．小水滴的形成壓電晶體帶動流動室振動，液流形成水滴。噴嘴的振動頻率即每秒鐘產(chǎn)生水滴的數(shù)目。當(dāng)噴嘴直徑為50μm時，信號頻率為40kHz，則每秒鐘產(chǎn)生4萬個水滴。若每秒鐘流出的細(xì)胞是1000個，則平均每40個水滴中只有一個水滴是有細(xì)胞的，其他皆為空白。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第54頁!3．水滴的充電與偏轉(zhuǎn)

當(dāng)水滴從流束上將要斷開時給整個流束充電，則水滴從流束上斷開后便帶有同極性的多余表面電荷。下落的水滴通過一對平行板電極形成的靜電場時，帶正電荷的水滴向帶負(fù)電的電極板偏轉(zhuǎn)，這樣就可用容器收集水滴。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第55頁!流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第56頁!二、儀器的分辨率分辨率是衡量儀器測量精度的指標(biāo)，通常用變異系數(shù)CV(CoefficientofVariation)值表示：(δ是分布的標(biāo)準(zhǔn)誤差，μ是分布的平均值)或流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第57頁!四、FCM分析速度分析速度以每秒分析的細(xì)胞數(shù)來表示。當(dāng)細(xì)胞流過光束的速度超過FCM儀器響應(yīng)速度時，細(xì)胞產(chǎn)生的熒光信號就會丟失，這段時間稱為儀器的死時間。死時間越短，儀器處理數(shù)據(jù)越快，一般可達(dá)到3000～6000個/秒左右。大型機(jī)已達(dá)到每秒幾萬個細(xì)胞。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第58頁!第四節(jié)流式細(xì)胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求

流式細(xì)胞分析儀器是一項集多學(xué)科知識綜合應(yīng)用的復(fù)雜儀器，除了對儀器各方面性能指標(biāo)有嚴(yán)格的要求以外，在實驗設(shè)計與樣品處理方面也需要有豐富的基礎(chǔ)理論及操作經(jīng)驗。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第59頁!二、常用的熒光染料與標(biāo)記染色

散射光信號是激光照在細(xì)胞上所產(chǎn)生的前向光和側(cè)向光信號。熒光信號來自于細(xì)胞的自發(fā)熒光或被分析細(xì)胞經(jīng)特異性熒光標(biāo)記染色后通過激光束激發(fā)后所產(chǎn)生的。因此，被分析細(xì)胞在制備成單細(xì)胞懸液后，經(jīng)過與熒光染料染色后才能上機(jī)進(jìn)行檢測。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第60頁!三、流式細(xì)胞儀操作技術(shù)的質(zhì)量控制在臨床檢測中，應(yīng)對各個工作環(huán)節(jié)和儀器性能進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制和規(guī)范化操作，以保證各項檢測數(shù)據(jù)和指標(biāo)的可靠性。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第61頁!2．PMT校準(zhǔn)

流式細(xì)胞儀在使用過程中，光電倍增管隨時間的增加，其放大功率會有所改變，對樣品檢測的靈敏度會產(chǎn)生影響。為保證樣品檢測時儀器處于最佳工作狀態(tài)，采用質(zhì)控品進(jìn)行PMT校準(zhǔn)，必要時進(jìn)行電壓補償。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第62頁!第五節(jié)FCM的維護(hù)及常見故障的排除一、儀器的維護(hù)1.激光電源的波動范圍應(yīng)小于±10%。2.冷卻水須用過濾器，并保證壓力和流量。3.室溫在18℃～24℃，相對濕度小于85%。4.安裝單獨的可靠的地線。5.儀器操作必須有經(jīng)過培訓(xùn)的人員操作。6.樣品和鞘液管道每周應(yīng)用漂白粉液清洗。流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第63頁!故障信息引起故障的原因解決方法存取數(shù)據(jù)時發(fā)生錯誤流式細(xì)胞儀不能存取數(shù)據(jù)關(guān)開計算機(jī)重試程序錯誤軟件不能執(zhí)行該程序選擇主菜單上的重建項程序號太大程序號不能大于32取消一些程序，再輸入相應(yīng)號碼沒有激光束激光器關(guān)閉檢查電源，開激光器流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第64頁!故障信息引起故障的原因解決方法樣品壓力錯誤因為樣品管壞了，樣品不能被壓入流動室換一個樣品管建立樣品壓力錯誤流式細(xì)胞儀連接錯誤檢查連接，開關(guān)機(jī)重試鞘液高度錯誤鞘液太少補充鞘液流式細(xì)胞儀概述共71頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第65頁!淋巴細(xì)胞及其亞群分析如當(dāng)人類感染免疫缺陷病病毒(Humanimmuno-deficiencyvirus，HIV)后，HIV主要選擇地侵入人類具有重要免疫功能的T淋巴細(xì)胞亞群中的輔助性T細(xì)胞，即Th細(xì)胞(CD4＋)，使具有重要免疫功能的T細(xì)胞群被破壞，繼而累及全身免疫器官，使機(jī)體免疫功能下降。檢測的免疫指標(biāo)表現(xiàn)為：T淋巴細(xì)胞總數(shù)減少(正常值的65%～81%)；T細(xì)胞亞群比值倒置，即Th/Ts<1.0(正常1.3∶12～2.1∶1)；Th細(xì)胞(CD4＋)絕對計數(shù)<200個/μL(正常值400～1500細(xì)胞/μL)，CD8＋

T細(xì)胞在感染早期增多，后期則下降；Ts細(xì)胞增高，NK細(xì)胞減少或活力下降，B淋巴細(xì)胞群則在正常范圍；CD4＋/CD