實驗三、細胞的傳代與凍存2021/7/18星期日1醫(yī)學資料3貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同共19頁，您現在瀏覽的是第1頁!1.細胞培養(yǎng)中為什么添加血清？2.使用血清需注意哪些方面？3.消化液胰酶的濃度是多少？4.使用小濾器過濾要注意哪些？2021/7/18星期日2醫(yī)學資料3貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同共19頁，您現在瀏覽的是第2頁!

針頭濾器使用應注意的問題

1.擰緊濾器

2.注射器吸液體

3.注射器插好濾器

4.對著燒杯慢推壓針芯看是否漏

5.如不漏對小瓶過濾。

6.濾器放在小瓶瓶口上，取下針頭再吸液體，反復多次，濾完。

7.檢查濾器濾膜是否完好。2021/7/18星期日3醫(yī)學資料3貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同共19頁，您現在瀏覽的是第3頁!一、實驗原理

細胞貼壁過程2021/7/18星期日4醫(yī)學資料3貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同共19頁，您現在瀏覽的是第4頁!

什么時候傳代？

2021/7/18星期日5醫(yī)學資料3貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同共19頁，您現在瀏覽的是第5頁!

細胞消化的最佳程度2021/7/18星期日6醫(yī)學資料3貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同共19頁，您現在瀏覽的是第6頁!二、實驗目的掌握無菌操作技術。掌握傳代細胞的培養(yǎng)的一般方法與步驟。掌握培養(yǎng)細胞的消化方法。了解在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)和生長狀況。2021/7/18星期日7醫(yī)學資料3貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同共19頁，您現在瀏覽的是第7頁!四、實驗步驟1.準備：超凈工作臺紫外線處理30分鐘,用肥皂洗手,穿鞋套，用新潔爾滅溶液拭擦雙手消毒。2.倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，確定細胞是否需要傳代及細胞需要稀釋的倍數。將培養(yǎng)用液置室溫下預熱。3．關閉超凈臺紫外燈,打開可見光燈開關,打開抽風機清潔空氣，除去臭氧。用75%酒精擦雙手消毒。

4.正確擺放超凈臺內的實驗用品：酒精燈、酒精棉球、新潔爾滅紗布、試管架、滴管筒（頭）、吸管筒（頭）、廢液缸等。點燃酒精燈，準備好實驗試劑：DMEM培養(yǎng)基（其中血清含量10%）、血清、胰酶等。2021/7/18星期日8醫(yī)學資料3貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同共19頁，您現在瀏覽的是第8頁!5.點燃酒精燈；取出無菌試管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮頭；過酒精燈火焰略燒后插在無菌試管內。6.將培養(yǎng)用液（90mL)瓶口用75%酒精消毒，過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。7.打開血清（10.5mL)瓶，瓶口過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。8.無菌吸取10mL血清加入到培養(yǎng)液（90mL)中，用微量移液器加入雙抗100μL輕輕混勻，配置完全培養(yǎng)基。9.在血清中（剩余0.5mL)加入4mL完全培養(yǎng)基輕輕混勻，加入0.5mLDMSO（凍存保護劑），輕輕混勻即為凍存液。2021/7/18星期日9醫(yī)學資料3貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同共19頁，您現在瀏覽的是第9頁!10.細胞瓶口靠近火焰打開瓶蓋并在酒精燈上燒口消毒，倒掉或吸出培養(yǎng)基（對于小口的培養(yǎng)瓶可采用傾倒方法,對于培養(yǎng)皿,必須用吸管吸出）11.加一滴管胰酶輕輕漂洗一下細胞，棄胰酶，再加入一滴管或兩滴管胰酶（以蓋住細胞量為準，轉動培養(yǎng)瓶，使其濕潤整個細胞層，蓋好瓶蓋。12.顯微鏡下觀察細胞的消化狀態(tài)，待細胞大部分收縮、突起、一半變圓，細胞邊界清晰時，即可立起或翻轉培養(yǎng)瓶停止消化，在超凈臺內靠近火焰處棄胰酶2021/7/18星期日10醫(yī)學資料3貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同共19頁，您現在瀏覽的是第10頁!把握好傳代時機，80-90%匯合度階段最好，過早細胞產量少，過晚細胞健康狀態(tài)不佳消化時間要適度，過短細胞不易脫落，過長細胞可脫落流失。消化液濃度要適宜，過濃時消化作用強烈，細胞反應快，所需消化時間短，掌握不好，細胞易流失。不同細胞對消化反應不同。貼壁不牢—直接吹下—細胞損傷注意事項2021/7/18星期日11醫(yī)學資料3貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同共19頁，您現在瀏覽的是第11頁!培養(yǎng)細胞一代生長過程2021/7/18星期日12醫(yī)學資料3貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同共19頁，您現在瀏覽的是第12頁!2021/7/18星期日13醫(yī)學資料3貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同共19頁，您現在瀏覽的是第13頁!

細胞凍存要求凍存條件操作要點

2021/7/18星期日14醫(yī)學資料3貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同共19頁，您現在瀏覽的是第14頁!三、實驗材料及設備

1.細胞人宮頸癌HeLa細胞人胃癌BGC-823細胞2.試劑胰酶、DMEM培養(yǎng)基、血清、DMSO、抗生素3.儀器超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡4.其它用品：

培養(yǎng)瓶，試管，移液管，巴斯德吸管，廢液缸，75％酒精棉球，酒精燈

2021/7/18星期日15醫(yī)學資料3貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同共19頁，您現在瀏覽的是第15頁!2021/7/18星期日16醫(yī)學資料3貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同共19頁，您現在瀏覽的是第16頁!2021/7/18星期日17醫(yī)學資料3貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同共19頁，您現在瀏覽的是第17頁!13.加兩滴管（約1.8-2mL）凍存液既全面吹打細胞瓶壁,吹打均勻，細胞濃度宜大，3×106個/mL左右。將細胞懸液吸至凍存管中，擰好蓋，封好膠布，并標記好細胞種類，凍存時間，保存條件以及凍存者姓名等（懸浮細胞凍存將細胞離心后再加凍存液）在培養(yǎng)瓶(殘余少量細胞）中加入5mL完全培養(yǎng)及，蓋好瓶蓋（擰緊后并旋回半圈）。做好記錄，倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。凍存管在4度以下存放30min，轉放到－20度1.5－2h，再轉到－70度4－12h后即可轉移到液氮內，注意做好凍存記錄。2021/7/18星期日18醫(yī)學資料3貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同共19頁，您現在瀏覽的是第18頁!1.試述傳代培養(yǎng)的步驟和注意事項，