蛋白質放射性碘化標記實驗【目的】掌握最常用的氯胺-T法碘化蛋白的要領學會用柱分離純化碘化蛋白的方法學會標記率、比放射性、放射性化學純度的計算【原理】蛋白質碘化是利用蛋白質分子上的酪氨酸殘基和碘正離子的置換反應，Na125I125I在氧化劑（氯胺-TIodogen、過氧化物酶等）作用下，被氧化成125I2，將酪氨酸殘基中酚基鄰位氫置換下來，即獲得碘化的蛋白質。氯胺-TN-它在水中產生次氯酸，是一溫和的氧化劑。

Na-SO2NCl1616′·16″··116···············22′2″11A1′B1″C11222【試劑與器材】1、試劑：

3.放射紙層析圖（單位：cm）1%BSA（pH7.5 0.05MPD配制）0.4ml10%三氯乙酸（TCA）10ml74KBq/50μl Na50μl50μg/50μl BSA(pH7.5，0.5MPB配制)50μl氯胺T、偏重亞硫酸鈉各10mg臨用前1mlpH7.5,0.5MPB溶解10%KI 250μl0.5MPBpH7.5 50μlMPBpH7.5 100ml葡聚糖凝膠 SephadexG-50 50~101%NaI20ml2、器材：1ml玻璃移液管2支尖頭滴管2支一次性塑料試管80支10μl微量注射器2支200μl微量加樣器2支200μl微量加樣器頭10個青霉素小瓶（帶塞）1個（1小磁棒）分離柱（1×20cm）1個電磁攪拌器1臺18×6cm濾紙（WhatmanI或新華1號）1條1所示做好標記，A、B、C5μl1%NaI稍微吹干。層析缸1個 吹風機1個剪子1把 鑷子1把 γ計數儀1臺4Sephadex柱層析圖【操作步驟】SephadexG-50柱的制備：SephadexG-505~10g,50ml蒸餾水泡過夜或沸水浴中煮40′，傾去上清，沉淀加入pH7.5,0.05MPB50ml混勻使成懸液，裝入清潔的層析柱，如圖2所示，使SephadexG-50均勻沉積20多余的吸出勿使柱干掉加0.4 ml1%BSA飽和柱以減少Sephadex對125I-蛋白質的物理吸附，提高過柱后125I-蛋白質的利用率。在1%BSA通過的同時，用1%TCA檢查BSA流出柱的情況，以供收集15-蛋白峰作參考。1、取裝有磁棒的青霉素小瓶1個，在電磁攪拌機上依次加入下列試劑50ug/50ul BSA 50ul74KBq/50μl Na125I 50μ10mg/ml氯胺-T 50μl電磁攪拌下反應2′10mg/ml偏重亞硫酸鈉100ul終止反應10%KI 250μl500μl5μlA5μl125I的總量。1%BSASephadexG-50250μl10%溶液洗反應瓶，追加上柱，待全部反應液完全進柱后，開pH7.0.05MPB1010（0.5ml，125I-BSA或與標記蛋白無關的動物血清飽和，如凍干馬血清。放射性測量：依次測定各收集管的放射性計數，以計數率為縱坐標，管125I-BSA125I5μlB者存冰箱待用。另取約5μlNa125I滴于濾紙C處，冷風吹干。10%TCA30%。將濾紙在各劃線處剪開，所得各紙條分別置于試管中，測量其計數率?！窘Y果計算】利用裝有樣品紙條各管所得計數率cpm進行計算標記率

蛋白峰放射性原點A計數率加入總放射性

100%A紙條放射性化