1動物疫病采樣、保存、送樣技術

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隨著畜牧業的發展、科技進步以及國際貿易的日益頻繁，動物傳染病也在發生變化。有些傳染病臨床癥狀和剖檢變化越來越不典型；有些傳染病的臨床癥狀和剖檢變化比較相似；有的傳染病也不能僅憑特征性病變確診。3

同時由于人們觀念的轉變，衡量免疫狀況，制定合理免疫程序、進行疫病監控、掌握疫病動態等都要根據監測數據來確定。

獸醫實驗室的工作顯得越來越重要。而在動物疫病診斷、監測中，采樣方法、采樣部位、采樣數量和樣品質量直接決定診斷監測結果的準確性和監測結論的科學性。因此，對采樣人員采樣方法、技術都有特定的要求。4主要內容采樣一般原則采樣器械物品的準備實驗采樣時機、部位和數量采樣方法采樣時注意事項采樣實例運輸保存采樣和運輸過程中生物安全5采樣一般原則（1）1.凡是血液凝固不良、鼻孔流血的病、死動物，應耳尖采血涂片，首先排除炭疽，炭疽病死的動物嚴禁剖檢。2.采樣時應從胸腔到腹腔，先采實質器官做到無菌，避免外源性的污染，最后采污染的組織，如胃腸組織、糞便等。3.采取的病料必須有代表性，采取的組織器官應病變部位明顯。采取病料時應根據不同的疫病或檢驗目的，采其相應血樣、活體組織、臟器、腸內容物、分泌物、排泄物或其他材料。病因不明時，應系統采集病料。6采樣一般原則（2）4.病料應在使用治療藥物前采取，用藥后會影響病料中微生物的檢出。死亡動物的內臟病料采取，最遲不超過死后6小時(尤其在夏季)，否則，尸體腐敗，難以采到合格的病料。5.血液樣品在采集前一般禁食8小時。采集血樣時，應根據采樣對象、檢驗目的及所需血量確定采血方法與采血部位。6.采樣時應對環境的影響，防止污染環境和疫病傳播，做好環境消毒和廢棄物的處理，同時做好個人防護，預防人畜共患病感染。7采樣器械物品的準備（1）（一）器械1.采樣箱、保溫箱或保溫瓶、解剖刀、剪刀、鑷子、酒精燈、酒精棉、碘酒棉、一次性注射器等。2.樣品容器包括小瓶、玻片、平皿、離心管及易封口樣品袋、塑料包裝袋等。3.試管架、鋁盒、瓶塞、無菌棉拭子、膠布、封口膜、封條、冰袋等。4.個人防護用品口罩、防護鏡、一次性防護服、手套、鞋套、帽子等注意：采樣刀剪等器具和樣品容器須無菌。

8采樣器械物品的準備（2）（二）采樣記錄用品不干膠標簽、簽字筆、記號筆、采樣單等。（三）保存液阿氏液(A1severs)、30％甘油鹽水緩沖液、肉湯、PBS液、雙抗。9采樣時機和數量

根據實驗目的采取不同的樣本類型，如組織、血清等；送檢的樣本數應滿足送檢目的的需要；采集的樣本應具有一定的代表性。

1.診斷時樣本最好發病初期（未用藥），臨床癥狀明顯期采集5只(頭)以上病死和發病動物的有病變的器官組織、血清和抗凝血各10份。10采樣時機和數量2.免疫效果監測時動物免疫后14-20天，隨機采集同群動物血清樣品30份。

3.疫情監測或流行病學調查時采集血清、各種拭子、體液、糞尿或皮毛樣品等，采樣數量可根據動物年齡、季節、周邊疫情情況估算其感染率，然后計算應采樣品數量。11采集方法及技術要求12禽的采樣方法1.翅靜脈采血：在翅下靜脈處消毒，手持采血針，從無血管處向翅靜脈叢刺入，見有血液回流，即把針芯向外拉使血液流入采血針。采血完畢用干棉球按壓止血。2.家禽喉拭子和泄殖腔拭子采集方法取無菌棉簽，插入雞喉頭內或泄殖腔轉動3圈，取出，插入離心管中(雙抗PBS)，蓋緊瓶蓋，做好標記。密封低溫保存。13禽的采樣方法3.羽毛采集方法拔取受檢雞含羽髓豐滿的翅羽或身上其他部位大羽，將含有羽髓的羽根部分按編號分別剪下收集于小試管內，于每管內滴加蒸餾水2～3滴(羽髓豐滿時也可不加)，用玻璃棒將羽根擠壓于試管底，使羽髓浸出液流至管口，用滴管將其吸出。14豬的采血方法1.耳緣靜脈采血2.前腔靜脈采血(1)站立保定：保定器保定讓豬頭仰起，露出右腋窩，從右側向心臟方向刺人，回抽見有回血時，即把針芯向外拉使血液流入采血針。(2)仰臥保定：把前肢向后方拉直。一般用裝有20號針頭的注射器采血，其穿刺部位在胸骨端與耳基部連線上胸骨端旁開2厘米的凹陷處，向后內方與地面呈60度角。角刺入2～3厘米，當進入約2厘米時可一邊刺入一邊回抽針管內芯；刺人血管時即可見血進入針管內，采血完畢，局部消毒。15豬活體的樣品采集1.扁桃體采取方法從活體采取扁桃體樣品時，應使用專用扁桃體采集器：先用開口器開口，可以看到突起的扁桃體，把采樣鉤放在扁桃體上，快速扣動扳機取出扁桃體放離心管中，冷藏送檢。2.鼻腔拭子、咽拭子采集方法應用滅菌的棉拭子采集鼻腔、咽喉的分泌物，蘸取分泌物后，立即將拭子浸入保存液中，密封低溫保存。一般每支拭子需保存液1毫升。16豬活體的樣品采集3.肛拭子采集方法用滅菌棉拭子插入肛門或泄殖腔內采集其內容物和分泌物后，立即將拭子浸入保存液中，密封低溫保存。一般每支拭子需保存液1毫升。17牛、羊采血方法

牛、羊頸靜脈采血將動物保定，稍抬頭頸，于頸靜脈溝上1／3與中1／3交界部剪毛消毒，一手拇指按壓采血部位下方頸靜脈溝血管，促使頸靜脈怒張，另一手執針頭，與皮膚呈45度角。角由下向上方刺入，血液順器壁流人容器內，防止氣泡產生。待血量達到要求后，拔下針頭，用消毒棉球按壓針眼，輕按止血。18膿汁

做病原菌檢驗的，應在藥物未治療前采取。采集已破口膿灶膿汁，宜用棉拭子蘸取，剪去露出部分，蓋緊瓶蓋，做好標記；未破口膿灶，用注射器抽取膿汁，密封低溫保存。19乳汁

乳房先用消毒藥水洗凈(取乳者的手亦應事先消毒)，并把乳房附近的毛刷濕，最初所擠的3～4把乳汁棄去，然后再采集10毫升左右乳汁于滅菌試管中。進行血清學檢驗的乳汁不應凍結、加熱或強烈震動。20糞便樣品的采集（1）

1.用于病毒檢驗樣品分離病毒的糞便必須新鮮。少量采集時，以滅菌的棉拭子從直腸深處或泄殖腔黏膜上蘸取糞便，并立即投入滅菌的試管內密封，或在試管內加入少量pH7.4的保護液再密封；須采集較多量的糞便時，可將動物肛門周圍消毒后，用器械或用戴上膠手套的手伸入直腸內取糞便，也可用壓舌板插入直腸，輕輕用力下壓，刺激排糞，收集糞便。所收集的糞便裝入滅菌的容器內，經密封并貼上標簽，立即冷藏或冷凍送實驗室。21糞便樣品的采集（2）2.用于細菌檢驗的糞便樣品采集做細菌檢驗的糞便，最好是在動物使用抗菌藥物之前，從直腸或泄殖腔內采集新鮮糞便。采樣方法與供病毒檢驗的方法相同。糞便樣品較少時，可投入無菌緩沖鹽水或肉湯試管內；較多量的糞便則可裝入滅菌容器內，貼上標簽后冷藏送實驗室。22糞便樣品的采集（3）3.用于寄生蟲檢驗的糞便樣品采集糞便樣品應選自新排出的糞便或直接從直腸內采得，以保持蟲體或蟲體節片及蟲卵的固有形態，一般寄生蟲檢驗所用糞便量較多，需采取5～19克新鮮糞便，大家畜一般不少于60克，并應從糞便的內外各層采取。糞便樣品以冷藏不凍結狀態保存。23采樣注意事項（1）采集前應準備好經消毒的器械和容器。死因不明的動物尸體，在解剖前，必須做血液涂片，染色鏡檢，排除炭疽后方能解剖取樣。病料的采取，須于動物死后6小時以內進行。采樣時必須做到無菌操作采取，病料要盡可能齊全，除了內臟、血清、淋巴結和局部病變組織外，還應采取腦組織。盡快冷凍保存。注意事項24采樣注意事項（2）天氣炎熱或不能馬上送檢的用作細菌檢驗的材料，可用30%甘油緩沖鹽水保存；作病毒檢驗的材料，可用50%甘油緩沖鹽水保存，并做到低溫保存傳遞。注意個人衛生防護，在采樣中必須穿戴工作服和手套。采樣后要及時對尸體進行無害化處理，被污染的場地進行徹底消毒。注意事項25采樣實例26口蹄疫采樣（1）樣品的選擇用于病毒分離、鑒定的樣品以發病動物(牛、羊或豬)未破裂的水泡皮和水泡液為最好。樣品的采集和保存樣品采集部位可用清水清洗(切忌使用酒精、碘酒等消毒劑消毒、擦拭)，剪取病畜的新鮮水泡皮3—5克放入滅菌小瓶中，加適量50％甘油／磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，加蓋密封；也可采用無菌器具采集水泡液至少1毫升，裝入滅菌小瓶中(可加適量抗菌素)，加蓋密封。盡快冷凍保存。27口蹄疫采樣（2）

血清樣品在發病和撲殺時均應無菌操作采集10份以上的血清，每頭血清不少于1mL。無菌分離血清裝入1.5mL離心管中，加蓋密封后冷藏保存，通過檢測抗體，做出追溯性診斷。28口蹄疫采樣（3）

牛、羊O-P液(咽食道分泌物)的采集方法被檢動物在采樣前禁食(可飲少量水)12小時，以免胃內容物反流污染O-P液。采樣探杯在使用前經裝有0.2％檸檬酸或2％氫氧化鈉溶液的塑料桶中浸泡5分鐘，再用與動物體溫一致的清水沖洗探杯后使用，每采完一頭動物，探杯要重復進行消毒并充分清洗。29口蹄疫采樣（4）

牛、羊O-P液(咽食道分泌物)的采集方法采樣時動物應站立保定，將探杯隨吞咽動作送人食道上部10～15厘米處，輕輕來回抽動2～3次，然后將探杯拉出。取出8～10毫升O-P液，倒入含有等量細胞培養液(0.5％水解乳蛋白-Earle液)或磷酸緩沖液(0.04摩／升、pH7.4)的滅菌廣口瓶中，充分搖勻加蓋封口，放冷藏箱及時送檢，未能及時送檢應置于-30℃冷凍保存。30禽流感采樣（1）組織樣品應采集組織樣品。取死亡不久的5只病死禽采樣，病死禽數不足5只時，取發病禽補齊5只。每只禽采集腸管及腸內容物

1份；肺和氣管樣品1份；肝、脾、腎、腦等各1份并分別采集。上述每個樣品取樣重量為15g-20g，放于樣品袋或平皿中，如果重量不夠可取全部臟器（如脾臟）。不同禽只臟器不能混樣，同一禽只不同臟器不應混樣。31禽流感采樣（2)拭子樣品取5只病禽采樣，每只采集泄殖腔拭子和喉氣管拭子各1個，將樣品端剪下分別置于含有抗生素PBS的（加1.0mL-1.3mLPBS）小塑料離心管中，封好口，貼好標簽。喉氣管拭子采集方法：將棉拭子插入口腔至咽的后部直達喉氣管，輕輕擦拭并慢慢旋轉，沾上氣管分泌物。泄殖腔拭子采集方法：將棉拭子插入泄殖腔約1.5-2cm,旋轉后沾上糞便。32禽流感采樣(3）

糞便樣品小珍禽采泄殖腔拭子容易造成傷害，可只采集5個新鮮糞便樣品（每個樣品1g-2g），置于內含有抗生素PBS（加1mL-1.5mLPBS）的離心管中，封好口，貼好標簽。保存糞便和泄殖腔拭子的PBS中抗生素濃度提高5倍。33禽流感采樣（4）

血清樣品采集10只病禽的血樣，心臟或翅靜脈采血，每只病禽采血樣2mL-3mL，盛于西林瓶中或10mL離心管中，經離心或自然放置析出血清后，將血清移到1.5ml小塑料離心管中，蓋緊瓶塞，封好口，貼好標簽。不同禽只的血樣不能混合。34高致病性豬蘭耳病采樣實質臟器樣品：無菌采集瀕死豬扁桃體、肺、腦、心、肝、脾、腎、淋巴結及其他可見病變的組織10-20克以上，放入無菌容器內。每塊組織最好單獨放在1個容器內（也可置于自封袋中），用記號筆注明日期、組織臟器和動物名稱。注意防止組織間相互污染，及時置于低溫條件下保存。血清樣品：采集的血液2-5mL，在室溫下靜置2h-4h（防止曝曬），待血液凝固后分離血清。若需長時間保存，則將血清置-20℃以下保存，但要盡量避免反復凍融。胚胎樣本：選取完整、無腐敗的胚胎送檢動物主要疫病病原監測取樣樣品.doc35做好樣本記錄

樣品記錄應伴隨樣品送到實驗室，且應包括以下內容：畜禽主的姓名和養殖場的地址，場（圈、戶）里飼養的畜禽品種及其數量，被感染的畜禽種類，首發和繼發病例的日期及造成的損失；出現臨床癥狀的畜禽只數量、死亡畜禽只數量及其年齡，臨床癥狀及其持續時間，死亡情況和時間，基本病理變化，免疫和用藥情況等；送檢樣品清單和說明，包括病料的種類、保存方法，要求做何種檢測，送檢者的姓名、地址、郵編和電話，送檢日期等。36做好流行病學調查和疫情報告發病的范圍、數量、死亡情況臨床、解剖癥狀發病畜禽的大小、畜別、品種、來源等各種疫苗免疫情況注射時間、劑量，疫苗使用的廠家、批號發病時用藥情況等等盡可能把情況摸的詳細清楚！37

采樣完畢后，應根據不同疫病的要求填寫好采樣登記表、流行病學調查表和疫情報告。

采樣登記表流行病調查表38

運輸及保存（1）

采用正確的送檢及保存方法。根據實驗目的和病原體的特性來選擇保存方法，并做到低溫保存傳遞。天氣炎熱或不能馬上送檢的用作細菌檢驗的材料，可用30%甘油緩沖鹽水保存；作病毒檢驗的材料，可用50%甘油緩沖鹽水保存；用于分離血清的血液材料應放于常溫1-2小時待血清自然析出后，分離血清低溫保存。39

運輸及保存（2）

一般是將所采集的樣品要以最快最直接的途徑送往實驗室。如果樣品能在采集后24小時內送抵實驗室，則可放在4℃左右的容器中運送。在24小時內不能送到實驗室時，可將樣品冷凍，并維持低溫狀態運送；運輸前將樣品玻璃容器裝入金屬套筒中，套筒應填充防震材料，加蓋密封，與采樣記錄一同裝入專用運輸容器中。專用運輸容器應隔熱堅固，內裝適當冷凍劑和防震材料。外包裝上要加貼生物安全警示標志。40生物危害Ⅲ級（圖標）41送樣內外包裝42采樣運輸過程中生物安全獸醫生物安全有二方面的含義。一是減少或消除獸醫工作人員受到感染和污染的可能性，在采樣、運輸過程中，接觸的動物或樣品有可能帶有人畜共患病原，如牛羊布魯氏菌、狂犬病病毒等，時刻威脅著工作人員的健康。如果沒有個人防護知識、必要的防護措施和良好的操作技術規范，很可能造成人員的感染。二是采樣、運輸過程中的廢棄物處理、無害化處理等，保護環境安全，否則都可能引起散毒。因此，必須高度重視動物采樣過程的生物安全工作。

43采樣生物安全隱患1．活體采樣時動物的自身活動可能產生新的危害，如抓咬傷工作人員。2．工作人員操作不小心或正在使用的器材設備等引起，如刀片割破、針頭刺傷等。3．動物中也可能有隱性感染病，可污染環境，工作人員和其他有關人員不知不覺地吸入動物發散的氣溶膠，都有可能造成嚴重后果。4．病死動物所帶病原的復雜性、未知性，解剖采樣過程中可能會對工作人員構成威脅，對環境造成污染(污水、血液)及對周圍的動物構成威脅。44采樣的生物安全措施（1）1．重大動物疫病沒有允許禁止采樣，懷疑炭疽時首先采耳尖血涂片檢查，確診后禁止剖檢。

2．采樣人員必須是獸醫技術人員。具備動物傳染病感染、傳播流行與預防的相關知識，熟練掌握各種動物的保定技術和各種采樣技術。

3．采樣協助人員培訓：當相關工作人員在與動物接觸時，應該學會避免不必要的風險，工作人員應根據其工作地點具有的風險性接受相應的培訓，所有的人員也都必須了解采樣的動物可能帶有疫病與人畜共患病，以及可能的感染與傳播方式。工作過程中出現的異常情況處置，以及個人衛生和其他方面的知識。45采樣的生物安全措施（2）

4．操作規范：可以做為一條規則的是，生物安全是建立在接受過培訓的人員認真