第一頁，共六十八頁。環境生物技術講座北大第二頁，共六十八頁。

傳統的基于微生物培養和純種分離的技術在研究微生物生態、描述微生物群落的結構和多樣性時存在諸多局限性，主要表現為：（1）對微生物類群進行描述之前必須首先進行培養，然而自然生境中的微生物，其大部分種類至今為止是不可培養的。（2）現有微生物分類標準具有主觀性。即使某些新發現的微生物種可以被培養，但往往與現行的分類標準體系不相符，而已有的對各種微生物表型的描述也常常不能滿足區分各種類群的需要。

第三頁，共六十八頁。

基于現代生物學的分子方法，為深入研究廢水生物處理過程中各種微生物的作用，為深刻理解廢水處理過程的本質、提高處理系統的性能以及進行工藝革新等提供了新的強有力的方法和手段，為我們了解這些處理系統中的微生物生態并對處理過程進行工程控制提供了可能。分子生物學方法的出現使我們有可能更好的理解現有的生物處理工藝（如活性污泥法、厭氧污泥消化）以及開發新的處理工藝。

第四頁，共六十八頁。利用分子生物學方法可以直接獲得活性污泥中微生物種群的基因信息，可以為我們提供傳統的測量指標，如生化需氧量（BOD）、揮發性懸浮固體（VSS）等所不能反映的一些精確信息。分子生物學方法可以跟蹤活性污泥中一些關鍵性的微生物，如絲狀菌、氨氧化菌等。我們將介紹常用的分子生物學方法在廢水生物處理微生物學研究中的一些成果及最新進展，包括微生物的原位檢測和定量分析、廢水處理系統中微生物的多樣性、與污泥膨脹和產生泡沫有關的細菌以及脫氮除磷微生物等。第五頁，共六十八頁。分子生物學方法可以直接探詢微生物種群中我們感興趣微生物的基因信息，而這些信息是傳統的分析方法不可能獲得的。利用分子生物學方法可以省去對微生物的選擇培養以及利用形態特征進行鑒定微生物存在的偏差。本節主要內容1.1分子方法探詢的基因目標1.2以rRNA為基因目標的優點1.3分子信息及其應用1分子生物學方法可以提供新的信息第六頁，共六十八頁。與建立在某些表型特性基礎上的細胞富集培養方法不同，分子方法直接針對微生物群落的基因信息，分子技術測定的是細胞DNA或RNA的堿基序列。

分子方法以不同類型的DNA或RNA為目標，這取決于我們需要哪種信息。表1總結了檢測目標以及每個目標能夠提供的信息。1.1分子方法探詢的基因目標第七頁，共六十八頁。目標獲得的信息核糖體（r）RNA系統發育身份，它們是什么？DNA上編碼rRNA的基因系統發育身份，它們是什么？DNA上的其他基因表型潛力，它們能夠做什么？信使（m）RNA表型活性，它們正在做什么？蛋白質或其他報告產物表型活性或發育系統身份，它們是什么？或它們正在做什么？表1分子生物學方法探詢的目標

第八頁，共六十八頁。為了確定群落中的微生物在系統發育上的身份，以rRNA（通常是16SrRNA）或用于編碼rRNA的基因為分子檢測的目標。表型潛力，如對某種特殊基質的降解能力，可以通過在DNA上尋找相關基因來進行檢測。已經得到表達的表型潛力可以通過檢測mRNA或蛋白質產物（如酶）來證明。根據我們的研究需要，可以利用適當的分子方法來探詢表1給出的基因目標，從這些基因分析中我們可以得到所需的信息。基因探詢的目標如圖1所示。圖1總結了微生物細胞如何將DNA中的遺傳密碼轉錄和翻譯成蛋白質分子的機制。第九頁，共六十八頁。復制基因轉錄信使RNA蛋白質產物翻譯氨基酸—轉運RNA微生物細胞內的信息流動示意圖DNA,mRNA,rRNA和蛋白質產物均可以作為分子方法探詢的基因目標。

第十頁，共六十八頁。1.2以rRNA為基因目標的優點

核糖體RNA（rRNA）是目前用于構建生物系統發育樹比較可靠的基因目標，可以為我們提供微生物群落中某一特定微生物豐度方面的信息。目前人們最常用的基因目標是rRNA，這是基于以下原因。第十一頁，共六十八頁。（1）生物細胞需要rRNA將遺傳信息翻譯成蛋白質，因此，rRNA存在于所有的生物細胞中；（2）生物細胞內含有大量的核糖體，因此，rRNA相對來說容易檢測到；（3）由于rRNA被包埋于核糖體中，因而相對較為穩定；（4）細菌和古細菌的小亞單位rRNA，即通常所說的16SrRNA，大約含1600個堿基對，這1600個堿基對可以提供足夠的進化信息，從中選擇15-20個堿基對序列的寡核苷酸片段用作探針，可以檢測和鑒定多種微生物；（5）從環境樣品中分離出rRNA并用于微生物系統發育、種類鑒定、多態性及多樣性研究的方法已全面建立。利用rRNA序列研究微生物群落特征的方法總結如圖2。

第十二頁，共六十八頁。利用rRNA序列研究微生物群落特征的方法

第十三頁，共六十八頁。1.3分子信息及其應用

從圖1可以看出，微生物細胞擁有一個復雜的信息流動網絡，并用來決定其類型和控制其行為。這些信息在DNA中編碼。DNA編碼的基因并不實際承擔任何細胞工作，如能量產生或合成。相反，它們通過精確的、多步驟機制解碼DNA上的信息，并最終生成各種工作分子，如催化細胞內生化反應需要的酶。

第十四頁，共六十八頁。目前常用的分子方法有:2.1核酸雜交2.2變性梯度凝膠電泳2.3限制性片段長度多態性2.4報告基因法2常用的分子生物學方法第十五頁，共六十八頁。2.1核酸分子雜交技術探針是能與特定核苷酸序列發生特異性結合的己知堿基序列的核酸片段。它可以是長探針（100-1000bp），也可以是短核苷酸片段（10-50bp），可以是從RNA制備的cDNA探針，也可以是PCR產物或人工合成的寡核苷酸探針。探針既可用放射性核苷酸標記，也可用非放射性分子標記。核酸分子雜交的高度特異性以及檢測方法的高度靈敏性，使核酸分子雜交技術廣泛應用于檢測環境中的微生物，并對它們的存在、分布、豐度和適應性等進行定性和定量分析。

第十六頁，共六十八頁。

核酸雜交的主要步驟是核酸分子的變性和選擇性退火。雙鏈DNA或處于二級結構的RNA分子通過變性回復到它們原來的單鏈、線性形式，從而使它們處于能與互補的核苷酸鏈退火雜交的狀態。雜交實驗中所用到的核酸探針通常以需要檢測的核酸序列為基礎，它們可以來自DNA、RNA、寡核苷酸或cDNA等。第十七頁，共六十八頁。核酸雜交以堿基配對原理為基礎，利用寡核苷酸探針與靶細胞專一性結合進行生物分析。核酸雜交的基本實驗步驟為：細胞固定、雜交（專一性和嚴格性依賴于雜交溫度和時間、鹽濃度、探針長度及其濃度）、洗脫（去除與靶細胞沒有結合和非專一性結合的物質）和檢測，如下圖所示。第十八頁，共六十八頁。核酸雜交的步驟

第十九頁，共六十八頁。核酸雜交試驗并不要求探針與目標核酸序列之間百分之百地互補。有限數目的非互補堿基對的存在是可以接受的。互補的單鏈核苷酸分子經退火形成核酸雙鏈分子的過程是可逆的。因此，可以通過改變反應的物理和化學環境（條件）從而增加核酸雙鏈分子生成的速度、程度及其穩定性。影響兩段互補核苷酸鏈雜交的因素包括：雜交和洗膜的溫度、雜交時間、離子強度、甲酰胺濃度、堿基對之間非互補的程度以及探針分子和靶核酸序列的長度、復雜性和濃度等。

第二十頁，共六十八頁。利用核酸雜交技術研究環境樣品中的微生物具有以下優點：（1）核酸可以直接從樣品中提取，不必對微生物進行培養；（2）不管基因表達與否，都可以檢測到特定的基因或核酸序列，從而能準確地跟蹤、監測特定的微生物種群。通常，一份環境樣品中可能只有一小部分的微生物類群在迅速生長，因而也只有一小部分的基因在活躍表達，在這種情況下，核酸雜交技術的這一優點更加明顯；（3）利用同一樣品可以同時檢測到眾多不同的微生物類群。實際上，核酸雜交的檢測效率隨著所分析的微生物類群的增加而提高；（4）由于可以直接檢測到特定的核酸序列，因此該方法并不要求一定要有選擇性表型（即突變衍生物），這就避免了野生種的生態適應性被營養缺陷型所抵消的問題。

第二十一頁，共六十八頁。第二十二頁，共六十八頁。

核酸雜交技術在環境中應用的一個重要局限就是它要比傳統的方法復雜得多。（1）從各種環境樣品中提取核酸本身就包含眾多繁冗的抽提和純化操作，因此也是最復雜的步驟之一。（2）從富含能干擾核酸檢測的污染物的樣品（如土壤）中回收核酸，仍有待用一些特殊的技巧對現行的有關方法加以改善。（3）對任何一個自然微生物群落的研究常常需要對其多個平行樣品進行分析和統計，而目前要用核酸雜交技術分析如此眾多的樣品實際上相當困難。準確估算樣品中有關基因的拷貝數的方法尚有待進一步建立。（4）從諸如水樣等樣品中檢測到以很低豐度存在的、或在整個微生物群落中僅占很小比例的微生物類群，核酸雜交技術的靈敏度尚需大幅度提高。而要將特定的微生物或核酸序列從富含與它親緣關系較近的其它微生物的背景中檢測出來，也要求一些特殊的方法。

第二十三頁，共六十八頁。核酸雜交技術的一個缺點是只有對已被分離并已測序的微生物才能夠放心使用。微生物生態學家估計在自然界中到目前為止，只有少數微生物能夠被分離、培養。此外，被分離的微生物也可能并不能很好地代表自然環境中最重要的微生物。無論微生物是否已被分離或已完成測序，具有能提供微生物群落多樣性指紋信息的分子技術是非常有用的。第二十四頁，共六十八頁。變性梯度凝膠電泳法（DGGE）是一種使用日益廣泛的方法。在DGGE方法中，DNA在含聚丙烯酰胺凝膠電泳池的一端。電泳池兩端的電極形成一個電場，吸引帶負電的DNA向正極運動。DNA分子的移動速率取決于其分子大小與帶電量之間的比值，因此，不同的DNA分子運動到兩個電極之間的不同位置上停下，從而形成具有指紋作用的DNA帶。將DNA帶從凝膠中分離出來，可以進行進一步的擴增及測序。

2.2變性梯度凝膠電泳法（DGGE）第二十五頁，共六十八頁。DGGE法的原理如果不斷增加溫度或用化學變性劑處理，DNA雙鏈分子的兩條鏈就會開始分開（解鏈）。首先解鏈的區域由解鏈溫度較低的堿基組成。G.C堿基對比A.T堿基對結合得要牢固，因此G.C含量高的區域具有較高的解鏈溫度。同時影響解鏈溫度的因素還有相鄰堿基間的吸引力（稱作“堆積”）。解鏈溫度低的區域，通常位于端部，稱作低溫解鏈區（lowermeltingdomain）。如果端部分開，那么雙螺旋就由未解鏈部分束在一起，這一區域便稱作高溫解鏈（highmeltingdomain）(下圖)。如果溫度或變性劑濃度繼續升高，兩條鏈就會完全分開。

第二十六頁，共六十八頁。第二十七頁，共六十八頁。第二十八頁，共六十八頁。限制性片段長度多態性（RFLP）分析是另一種指紋分析方法。該法利用限制性內切核酸酶將被擴增的DNA切成片段，限制性酶對DNA的剪切能避開靶基因區。靶基因周圍的側翼區中具有不同數目的酶切位點。因此，限制性酶切后得到的DNA片段的大小不同，能夠通過電泳分離。

2.3限制性片段長度多態性（RFLP）第二十九頁，共六十八頁。報告基因法為評價已表達的表型潛力提供了另一條途徑。在報告基因法中，利用重組技術將報告基因插入DNA分子上的目標區域。當DNA序列被轉錄時，報告基因也同時被轉錄。來自報告基因的mRNA被翻譯成能催化某些易于檢測的反應的酶。發光是最常見的報告基因效應，其中綠色熒光蛋白（GFP）最為常用。只有當完整序列被轉錄時才能觀察到報告基因效應，因此，報告基因的表達意味著目標基因的表達。報告基因法可以對已表達的表型進行實時測定，其應用前景十分可觀。2.4報告基因法第三十頁，共六十八頁。GFP

綠色熒光蛋白作為新一代的基因轉移報告物或定位標記物，在環境微生物研究中越來越受到關注，GFP的優點：（1）不需加任何底物，經激發后即可產生熒光，且熒光性質穩定；（2）相對分子質量小，對細胞無毒性；（3）檢測方便，可對活細胞進行實時定位觀察；（4）已有多種GFP突變蛋白，熒光特性得到明顯改善。第三十一頁，共六十八頁。第三十二頁，共六十八頁。第三十三頁，共六十八頁。第三十四頁，共六十八頁。第三十五頁，共六十八頁。3.1活性污泥中微生物多樣性研究3.2絲狀細菌的研究3.3脫氮微生物的研究3.4除磷微生物的研究3分子方法的應用第三十六頁，共六十八頁。自1995年以來，基于16SrRNA基因庫分析，人們對活性污泥和生物膜處理系統中微生物多樣性進行了較廣泛的研究。大量的16SrRNA基因序列研究表明，這些處理系統中最常出現的微生物主要有-、-和-Proteobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria。這些發現與利用熒光原位雜交（FISH）研究活性污泥系統得出的結果一致。利用16SrRNA數據庫還可以預測在所分析的系統中存在的細菌種屬。盡管從廢水處理反應器中得到的16SrRNA基因克隆非常多，但是，對于實際廢水處理廠的微生物分析還沒有足夠的數據。

3.1活性污泥中微生物多樣性的研究

第三十七頁，共六十八頁。此外，一些復雜系統中實際的微生物種群組成不能夠僅僅根據16SrRNA基因庫來推測，而必須根據定量FISH分析結果來確定。定量FISH方法還很少用于研究實際廢水處理廠中微生物的種群結構，這可能是由于對不同探針標記的微生物在顯微鏡下進行計數非常費事，且技術上也有一些困難。半自動數字圖像分析方法極大地加快了定量FISH的分析速度，并且使微生物學家第一次得到了活性污泥中微生物種群組成的高清晰度的、完整的圖像。第三十八頁，共六十八頁。3.2

絲狀細菌的研究

在活性污泥中存在一定數量的絲狀菌對于污泥絮體的形成是重要的，但是，出現大量的絲狀菌對于廢水處理則是有害的，因為它們會導致在污泥中形成泡沫、或者使二沉池中活性污泥的沉降性變差（引起污泥膨脹）。許多絲狀細菌難于培養，因此，人們對于絲狀菌了解不多，目前僅有一些在顯微鏡下可以觀察到的特征。據報道，人們在處理生活污水的廢水處理廠觀察到了30多種不同形態特征的絲狀菌，在處理工業廢水的活性污泥廠又觀察到了約40多種其他形態特征的絲狀菌。

第三十九頁，共六十八頁。利用透視電子顯微鏡（TEM）和定量FISH技術可以研究活性污泥中的絲狀菌。利用顯微操作技術富集和分離絲狀微生物，然后進行16SrRNA基因序列分析。研究結果清楚地表明，一些分類學上相距較遠的細菌通常具有在光學顯微鏡下難于分辨的相同形態特征。因此，對絲狀菌根據其形態特征進行分類提出了強烈的置疑。在活性污泥中，有些絲狀菌可以呈現出非絲狀菌的生長形式。因此，僅僅根據形態特征進行鑒定有時是不可靠的。

第四十頁，共六十八頁。基于絲狀菌的16SrRNA基因序列，人們開發出了一套用于直接鑒定活性污泥中絲狀菌的定向于rRNA的寡核苷酸探針。利用寡核苷酸探針和抗體染色技術，可以定量地研究活性污泥中絲狀菌與污泥形成泡沫的關系。

第四十一頁，共六十八頁。第四十二頁，共六十八頁。第四十三頁，共六十八頁。第四十四頁，共六十八頁。改進絲狀菌的原位鑒定和定量分析方法，開發絲狀菌的有效控制技術，都需要進一步了解這些微生物生態生理方面的知識。

第四十五頁，共六十八頁。氨氮是生活污水中主要的含氮化合物（尿素極易水解形成氨），在污水處理廠中通過微生物的硝化和反硝化作用去除。盡管在教科書中仍然認為，Nitrosomonaseuropaea和Nitrobacterspp.是主要的氨氧化細菌和亞硝酸氧化細菌，但是，實際情況要復雜得多。

3.3

脫氮微生物的研究

第四十六頁，共六十八頁。氨氧化過程涉及的酶

NH4+

氧化為NO2-的過程需要經過2個步驟：

2H++NH4++2e-+O2NH2OH+H2O+2H+NH2OH+H2OHONO+4e-+4H+上述2個反應分別由氨單氧合酶（ammoniamonooxygenase，AMO）和羥胺氧化還原酶（hydroxylamineoxidoreductase，HAO）催化，其中AMO催化NH3

氧化為NH2OH的反應，HAO催化NH2OH氧化為NO2-的反應（見圖）。在細胞內（invivo）和細胞外（invitro）進行的一系列研究使我們獲得了關于AMO和HAO的結構與活性方面的大量信息。

第四十七頁，共六十八頁。氨氧化途徑及其相關基因

第四十八頁，共六十八頁。氨單氧合酶（AMO）

AMO是一種細胞膜結合酶，類似于顆粒甲烷單氧合酶（pMMO）。許多間接證據表明，在N.europaea以及其它可能的Proteobacteria的L和Q亞類自養菌中，AMO包含3個亞單位，AMO-A,AMO-B和AMO-C，其結構和大小各不相同，位于細胞的細胞膜/壁膜間隙中。在含14C標記的14C2H2中培養N.europaea細胞時，AMO的活性會喪失，一個27-kDa的多肽（AmoA）被標記。因此，人們認為AmoA中有氧化NH3的催化位點。對N.europaea中編碼氨單氧合酶的基因測序結果表明，第2個多肽（AmoB;38kDa）可以與AmoA一起純化。關于AMO的第3個多肽（AmoC;31.4kDa）的信息是間接的。對Nitrosomonaseuropaea和Nitrosospirasp.NpAV中amoC，amoA,和amoB基因的轉錄研究結果表明，AmoC，AmoA和AmoB的基因一起轉錄到單鏈mRNA中。第四十九頁，共六十八頁。AMO除可以氧化NH3以外，還可以氧化一系列的底物，將C-H鍵氧化成醇，將C=C鍵氧化成環氧化合物。反應底物包括烷烴、芳烴、鹵代烴等。這為生物修復受氯代烴污染的環境提供了一種新的途徑。第五十頁，共六十八頁。Nitrosomonas細胞內由AMO催化的幾種反應

第五十一頁，共六十八頁。羥胺氧化還原酶（HAO）

羥胺氧化還原酶的結構非常復雜，該酶以溶解態位于壁膜間隙，但定位在胞質膜中，為64-kDa亞單位的同源三聚體，每一個亞單位包含8個c-型的血紅素。其中7個血紅素通過c-型的血紅素典型的硫醚鍵與蛋白質共價結合。第8個血紅素為P460，另外還有一個通過酪氨酸殘基與蛋白質相連的共價鍵，位于NH2OH氧化的活性部位。HAO的晶體結構顯示了每一個亞基中血紅素的定向以及電子在酶中流動的潛在途徑。第五十二頁，共六十八頁。在AMO催化的反應中，O2中的一個O原子插入NH3分子中，另一個O原子被還原成H2O，該反應需要2個額外的電子。因為NH3分子是這些細菌的唯一還原劑來源，所以生成H2O分子需要的電子必須來自NH2OH分子的隨后氧化。在HAO催化氧化NH2OH分子過程中釋放的4個電子中，2個電子流向NH3的氧化，剩下的2個電子用于其他的需要還原劑的細胞過程，如細胞生物合成和ATP的形成。第五十三頁，共六十八頁。酶功能的調節

氨氧化代謝產物NO2-對Nitrosomonaseuropaea

細胞中AMO活性的影響研究結果表明，NO2-對AMO活性有抑制作用，從而對Nitrosomonaseuropaea細胞產生毒性作用。Nitrosomonaseuropaea細胞中的亞硝酸鹽還原酶（nitritereductase，NirK）并不是產生氣體氮氧化物所必需的。借助于周質的含銅亞硝酸鹽還原酶，微生物細胞可以克服NO2-產生的部分負面影響，提高微生物對NO2-的忍耐能力。NO2-可以刺激Nitrosomonaseuropaea細胞中的NH3氧化反應。氨限制會導致Nitrosomonaseuropaea細胞喪失AMO活性，但是，細胞的其他功能，如HAO活性保持不變。

第五十四頁，共六十八頁。在轉錄、翻譯和后翻譯水平上，氨對AMO活性的調節研究表明，利用RT-PCR，可以在相同的轉錄產物中檢測出3種amo

基因的所以產物，這表明amoC

是amo操縱子的一部分。在Nitrosomonaseuropaea

細胞中，amo以及hao的轉錄受氨分子的誘導。但是在氨饑餓條件下，這些基因的mRNA在8小時內會消失。通過蛋白質印跡（westernblot）和酶活性測量等研究表明，在氨饑餓的Nitrosomonaseuropaea

細胞中，HAO可以保持穩定長達72小時。在自然界中，即使在氨濃度波動的條件下，氨氧化的2種關鍵酶，AMO和HAO，仍然可以保持穩定。第五十五頁，共六十八頁。氨氧化酶的基因

氨單氧合酶基因AMO的3個多肽由3個相鄰的基因amoC，amoA

和amoB編碼（圖1）。在N.europaea

的基因組中，AMO在2個幾乎相同的（>99%）拷貝中。其他的NH3-氧化細菌（如Nitrosomonascryotolerans，Nitrosococcusoceanus，Nitrosospirasp.NpAV）的amo基因與N.europaea的amo基因高度相似。在不同的NH3-氧化細菌中，基因蔟amoCAB出現在3個拷貝中。在生長的N.europaea細胞中可以檢測出AMO的3個轉錄產物，分別對應于amoC，amoAB和

amoCAB

。關于AMOmRNAs的知識目前還不太了解，它們可能來自amoCABmRNA的加工，也可能來自amoC和amoA的轉錄。轉錄的起始位點在amoC起始密碼子上游的166和103bp處，以及在amoC和amoA基因間區中amoA起始密碼子上游114bp處。

第五十六頁，共六十八頁。羥胺氧化還原酶基因

編碼羥胺氧化還原酶的基因hao，長度為1710bp，表達為單順反子轉錄產物。該基因也編碼18–24氨基酸前導序列，特別是周質蛋白質，它們在HAO的轉運和成熟期間被去除。N.europaea的基因組包含3個分隔的HAO基因拷貝。除了在一個基因拷貝中有1個核苷酸差別外，hao基因3個拷貝的編碼區域是相同的。第五十七頁，共六十八頁。用于氨氧化菌多樣性分析的分子生物學方法是基于amoA基因（編碼所有氨氧化細菌中氨單加氧酶亞單位的活性位點）和/或16SrRNA基因分析。200余個

amoA基因片斷的比較序列分析結果顯示，屬于-Proteobacteria的各種氨氧化菌大量存在于廢水處理廠的硝化活性污泥中，除N.europaea,Nitrosomonaseutropha,Nitrosococcusmobilis外，還有Nitrosomonasmarina等。amoA分析結果表明，與其它生態系統不一樣，在這些硝化活性污泥中，Nitrosospira屬的氨氧化菌并不重要。這些發現與氨氧化菌種群組成的定量FISH分析結果是一致的。第五十八頁，共六十八頁。值得注意的是，非生理活性的氨氧化菌也能夠被FISH方法檢測出，因為這些細菌即使在不利的環境條件下，細胞內也會有高含量的核糖體。利用MAR-FISH技術和14C同位素標記的碳酸氫鹽作底物，可以精確地測定生理活性的氨氧化菌。最近，利用定量PCR技術和FISH技術，人們完成了氨氧化菌的分子工具箱。據此，可以推測出復雜樣品，包括活性污泥中這些細菌的絕對細胞濃度。這些方法，如果與專一性合適的引物或探針結合，可以成為非常有價值的工具，用于確定廢水處理廠設計和運行中的一些重要參數。第五十九頁，共六十八頁。分子生物學分析結果表明，在大多