不育一直是個世界性醫學難題。不育與發生異常密切相關。TGF-β1（transforminggrowthfactorβTGF-β）作為TGF-β超家族的主要成員之一，以其復雜的信號通路在發育不同階段扮演不同角色，參與調節發生。因此，尋找并確定生殖細胞發育過程中參與TGF-β1信號通路的關鍵分子將有助于更好地詮釋發生機制。基于此，本文以小鼠上皮細胞GC-1spg為實驗材料，進行外源TGF-β1刺激后，開展了以下三個方面的工作：通過高通量的microRNA（miRNA）分析和定量PCR驗證，選出24種受TGFβ1調節的miRNA分子，其中重點驗證了10個表達豐度較高的差異miRNAs，并通過生物信息學分析和定量PCR技術初步驗證了這些miRNAs的可能靶：miR-5112的可能靶為Hbp1，miR-199a-3p的可能靶為Celsr2，miR-196a的可能靶為Nr6a1。通過高通量的2DE(two-dimensionalgelelectrophoresis2DE)電泳結合MALDI-TOF-TOF-MS電泳結合質譜技術，鑒定得到了8個可能受TGFβ1調控的差異蛋白：Gelsolin（Gsn）Vinculin（Vcl）Ezrin（EzrNDKB（Nme2），PPIA（Ppia），Cofilin1（Cfl1），TERA（Vcp）和IF5A1（Eif5a8個差異蛋白在TGFβ1的作用下表達下調。通過GEO數據檢索等生物信息學方法分析發現，上述的下游靶Nr6a1，Celsr2Hbp1以及差異蛋白NDKB，COF1PPIA等在畸形癥和細胞瘤等組織中存在差異表達，提示它們可能在精子發生過程中扮演重要角色。值得關注的是，通過整合miRNA結果以及蛋白質組學結果，同時結合生物信息學分析發現，有些差異miRNA與差異蛋白在TGF-β1的作用下，它們的表達趨勢符合microRNA負性調控機制下的互反現象：如差異蛋白NDKB可能受miR-199a-3p調節，而差異蛋白PPIA可能受miR-196a或miR-149調節，從而響應TGF-β信號通路。結果暗示，在GC-1spg細胞中，這3個miRNA可能分別抑制NDKB和PPIA等蛋白的表達，從而參與發生過程。綜上所述，在GC-1spg細胞系中篩選并重點驗證了10個差異表達的miRNA和8個差異表達蛋白，并發現TGF-β1可能通過誘導miR-199a-3p，miR-196a和miR-149等的上調來抑制其各自的下游靶分子NDKB和PPIA等蛋白的表達，從而參與發生。：TGF-β1；microRNA分析；蛋白質組學；GC-1spg細胞Maleinfertilityhasbeenaworldwidemedicalchallengeandiscloselrelatedtoabnormalspermatogenesis.TGF-β1（transforminggrowthfactorβ，TGF-β）,oneoftheTGF-βsuperfamilymembers,playsdifferentrolesatdifferentstagesoftesticulardevelopmentandinvolvesintheregulationofspermatogenesis. Therefore, itwillbetter interpret the mechanism ofspermatogenesistofindandidentifykeymoleculesinvolvedinTGF-β1signalingpathwayduringgermcelldevelopment.Basedonthese,themousespermatogonialepithelialcellsGC-1spgwasusedasexperimentalmaterialwithexogenousTGF-β1stimulation,andthenthefollowingthreeaspectswerecarriedout:Byhigh-throughputmicroRNA(miRNA)microarrayysisandtativePCR,twenty-fourmiRNAmoleculesregulatedbyTGF-β1werescreenedandthen10miRNAswithhighexpressionabundancewereselectedtoverifytheresultsofmiRNAmicroarray.ThroughbioinformaticysisandtativePCRtechnology,weinitiallyverifiedthatHbp1maybethegeneofmiR-5112,andCelsr2maybethegeneofmiR-199a-3p,andNr6a1maybethegeneofmiR-196a.Throughhigh-throughput2-DE(two-dimensionalgelelectrophoresis，2-DE)andMALDI-TOF-TOF-MS,eightdifferentiallyexpressedproteinsregulatedbyTGF-β1wereidentifiedinGC-1spgcells.TheyareGelsolin(Gsn),Vinculin(Vcl),Ezrin(Ezr),NDKB(Nme2),PPIA(Ppia),Cofilin-1(Cfl1),TERA(Vcp)andIF5A1(Eif5a),andtheirexpressionweredown-regulatedwithTGF-β1treatment.ThentheGEOysisandt-testwereperformedandfoundthatthegenesofsomemiRNAs-Nr6a1,Celsr2,Hbp1andthescreenedproteins-NDKB,COF1,PPIAweredifferentiallyexpressedinteratozoospermiaandseminoma,suggestingthattheymayinvolveinspermatogenesisprocess.Itisnoteworthythatfurtherstudyshowedthatthedown-regulatedproteinNDKBcouldbeadirectoftheup-regulatedmiR-199a-3p;andthedown-regulatedproteinPPIAcouldbethedirectoftheup-regulatedmiR-196aandmiR-149.TheirexpressionshowanoppositechangesinresponsetoTGF-β1.TheobservationmaysuggestthatthesethreemiRNAsmayplaytheroleinspermatogenesisviainhibitingtheexpressionofNDKB,PPIAandotherproteinsrespectively.Inconclusion,wescreenedandverified10differentiallyexpressedmiRNAand8differentiallyexpressedproteinsinGC-1spgcelllinesandfoundthatTGF-β1couldinhibittheNDKBorPPIAviainducingup-regulationofmiR-199a-3p,miR-196aandmiR-149,andthusparticipateinspermatogenesis.Keywords:TGF-β1；miRNAmicroarray；proteomicscomparativeysis；GC-1spgcell性I使用書 III 主要縮略詞 第1章緒 TGFβ概 TGFβ的基本概念及分 TGFβ信號通 TGF-β悖 TGFβs與發生、不 microRNA概 microRNA的發現與發 microRNA的生物miRNA的負性調控機 TGF-β1與micro microRNA與生殖細 蛋白質組學研 蛋白質組學簡 蛋白質組學研究方 蛋白質組學在雄性生殖系統的研 研究思路 第2章基于microRNA技術篩選受TGF-β1誘導的差異miRNA分子 前 材料與方 實驗儀 材料與試 實驗方 結果與差異miroRNA的篩 差異miroRNA的驗證分 miroRNA分子的 靶的熒光定量PCR分析 本章小 第3章基于蛋白質組學技術篩選受TGF-β1誘導的差異蛋白 前 材料與方 儀 材 實驗方 結果與總蛋白SDS預電 雙向凝膠電泳結 MALDI-TOF-TOF/MS分析及差異蛋白質功能分 差異蛋白點的定量PCR驗 本章小 第4章基于生物信息學方法分析TGF-β1作用下的miRNA與蛋白質的相互關系及功 前 材料與方 材 實驗方 結果與本章小 結 參考文 附錄A攻讀期間的致 主要縮略詞表英文縮 英文全 中文全TGF-β transforminggrowthfactorβ 轉化生長因子βBMPs bonemorphogeneticproteins 骨形成蛋白 antimuellerianhormone 抗苗勒氏管激素 bloodepidipymisbarrier 血睪屏障RISC RNAinducesilengcingcomplex RNA沉默復合體2 twodimensionalgelelectrophoresis 雙向凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電 polyacrylamidegelelectrophoresis isoelectricfocusingelectrophoresis 等電聚膠電泳MALDI

Matrix Assisted Laser DesorptionIonization

基質輔助激光解吸離子化TOF/MS TimeOfFlightMassSpectrometry 飛行時間質譜 Nucleosidediphosphate(NDP)kinasesB 核苷二磷酸激酶BPPIptidyl-prolylisomerase 親環蛋白ACOF cofilin- 絲切蛋白IF5A

Eukaryotictranslationinitiationfactor5A-1

真核翻譯起始因子5A表達綜合數據 GEOData集 epithelial-mesenchymaltransition 上皮間質轉分化1章緒論不育是世界性醫學難題。研究表明，不育與發生密切相關1。TGFβ1（transforminggrowthfactorβTGF-β）是一種機體內廣泛存在的多功能的多肽類細胞因子，具有調節細胞增殖，轉分化，和遷移等廣泛的生物學效應[2]。TGF-β1在的不同發育階段其表達程度不同，TGF-β1其通過自和旁的方式調節的發育和的發生，對細胞、間質細胞和支持細胞等發揮重要的調節作用，并且對曲精細管的形成及結構的維持起著重要的作用[3-6]TGF-β1對生殖過程的調RNA在真核microRNA(miRNA)在生TGFβmiRNATGF-β1誘導的關鍵靶分子，從而為明確TGF-β1在TGFβ概述TGFβ的基本概念及分類轉化生長因子β（transforminggrowthfactorβ，TGF-β），是一類結構上非常保守而功能不同的多效性細胞因子，首次發現于脊椎動物中[7]。人類TGFβ有30多個因子，分為兩大類。如激活蛋白，nodal蛋白，lefty 蛋白，抑制素和TGFβ 是一個分支，骨形成蛋白（bonemorphogenetic proteins，BMPs），抗苗勒氏管激素（anti-muellerianhormone，AMH和各種生長分化因子（GDFs為另一個分支[8,9]Activin，nodals，BMPs，AMH/MIS和GDFs是胚胎干細胞分化，體軸形成，左右對稱以及形成的關鍵調節者。除上述功能之外，在成熟中活化素和GDF9參與調節功能，抑制素抑制肌肉生長而BMPs在骨骼生長與修復過程中扮演重要角色。TGFβ在時序和空間上呈現了不同的表達差異。TGFβ調節涉及龐大的上皮細胞和神經組織系統，免疫系統和損傷修復過程。TGFβ信號通路TGFβ經典信號通路TGFβ大致存在三種亞型：TGFβ1TGFβ2TGFβ3。這種生物活性（latency-associatedprotein，LAP。LAP將TGFβ二聚體在一個復合體中，該復合體通過潛在的LTBP4錨定在胞外基質。noggin，chordin，gremlin，follistatin，DANcerberus，和Bmper能誘捕BMPs，而激活蛋白類則被抑制素誘捕。前體通過弗林蛋白酶或其他轉化酶裂解釋放具有生物活性的TGFβ，即為TGFβ活化。活化的TGFβ二聚體信號分別由兩類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶TypeⅠTypeⅡ受體識別（1.1A。細胞表面TypeⅡ受體識別結TGFβ1，受體構象發生改變，促使胞內TypeⅡ受體絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結構域TypeⅠ受體磷酸化，激活TypeⅠ受體，活化的TypeⅠ受體使Smad2Smad3蛋白磷酸化。其他途徑如BMP受體活化后磷酸化Smad1，Smad5Smad8（11B。一旦活化RSmads進入細胞核內與輔助蛋白Smad4（Co-Smad）結合形成復合體作用于靶[9]。Smad蛋白具有DNA結合活性，但Smad4RSmad復合體必須結合額外的DNA結合輔助因子才能高親和性和選擇性地結合特異靶標Fig3A。這些Smad目的主要來自轉錄因子，如forkhead，homeobox，zinc-finger，Bhlh，RUNX和AP1[10,11]。目的調節區的同源結合序列元件的組成決定每種Smad-RSmad輔助因子識別一類特異。活化的Smad復合體還能募集轉錄輔助活化因子和重塑因子。通過這些不同轉錄因子共同作用，TGFβ信號能快速激活或抑制許多靶的表達。經典信號通路的多效性和信號協調建立在這種模式上的TGFβ信號有三種特征：多效性，協調性和環境依賴性。多效性表現在大量的轉錄因子與活化的Smad蛋白相結合作用于許多不同功能目的（圖1.1C。Smad蛋白表面由一系列疏水鍵著使它能特異性地行使他的功能9。協同性表現在：一種Smad-cofactor復合體能特異性地識別一套增強子元件，而這套增強子元件是不同共用的。在一個TGFβ轉錄調節過程中，把這種協同性稱為同步調節的同步表達組12,13]。不同細胞系或不同處理下，Smad轉錄調節復合體的所有組成成分表達不同，因此它們響應TGFβ應答途徑也不同，這就是環境依賴性。這種運行機制使得TGFβ信號通路具有很明顯的可塑性，成為它因遺傳缺失或失調而導致嚴重的一個重要方式。非經典TGFβ信號通路響應TGFβ的經典Smad信號通路包括不同的信號通路分支和Smad依賴性信號通路（11D。Smad4受抑制影響或Smad23活化后與其他因子結合從而影響經典影響途徑，轉向其他旁系調控。Smad4是許多Smad信號通路中必不可少的但不是所有TGFβ誘導轉錄調控反應都需要。事實上，抑制小鼠乳腺，肝臟或胰腺中Smad4表達，的生長發育并不會因TGFβ受體破壞而延誤。Smad4依賴型RSmad信號通路存在與否主要取決一個TGFβ信號中介子TIF1γ（transcriptionintermediatefactor1γ）的識別。TIF1γ與Smad4競爭性結合Smad2/3作用于未知的目的參與TGFβ誘導的紅系分化[14TIF1γ還能作為Smad4的抑制子[15。在鼠膠質細胞中，TGFβ活化的Smad23結合IκB激酶α（IKKα）調控癌Myc拮抗MAD1的表達和角質細胞分化[16]。值得注意的是，在血管平滑肌細胞中，BMP活化的Smad1和TGFβ活化的Smad23結合p68一個miRNA復合體DROSHA的組分作用于miR21的前體調控miR21的生成[17miR21通過下調抑制子PDCD4誘導收縮細胞表型。TGFβ/Smad信號通路中，TGFβ受體還能與白細胞介素1受體效應器相互作用，簡稱IL1R-TRAF6TAK1途徑，誘導JNK的活化和p38有絲原活化蛋白激酶（MAPK）途徑18。TGFβ受體還參與Rho-Rock1信號通路和Cdc42/Rac1-PAK2復合體形成，而它作為其中媒介的具體作用不是很清楚19]型受體通過基質傳遞信號不同于Ⅰ型受體。在上皮細胞中，TβR-Ⅱ磷酸化Par6，將其從Par6-TβR-Ⅰ復合體中出來。Par6上皮間質轉化過程中緊密連接的消除20。BMPⅡ型受體也能通過非Ⅰ型受體基質傳遞信號：泛素化C-末端結構域修飾的肌動蛋白細胞骨架調控激酶LIMK121。這些非經典TGFβ信號通路在人工培養的細胞中得到驗證，但它們是否與人類等疾病有關還待確認。TGFβ信號受體TGFβ須通過細胞膜表面高親和力受體（TβRI、TβRII和TβRIII）結合才能發揮生物學效應。TβRIII是細胞表面含量最豐富的TGF-β受體，它不直接參與信號通路的轉導，但能作為連接分子增加配體與受體I和II親和力。七種Ⅰ型受體和五種Ⅱ型以不同組合配對在TGFβ中構成了不同的受體系統（圖11B。這些受體在細胞質一面包含一個絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域。N端到激酶結構域的一段GS結構域為TypeⅠ受體提供了一個激酶活化轉換位點。在此基礎上，GS結構域與激酶活性位點粘合，抑制了催化活性。一個TypeⅡ受體誘導的配體依賴磷酸化過程中，TypeⅡ的GS結構域能從一個抑制元件轉換成底物Smad蛋白的停泊位點。大部分TGFβ成員共用幾種TypeⅠ和TypeⅡ受體，但TGFβ是個例外。在TypeⅡ受體中，只有TβRⅡ能結合TGFβ。而且只有TβRⅠ能與TβRTGFβ復合體相互作用[922]。圖1.1TGFβ信號轉導的構成[23A：TGFβ信號的配體-受體-輔助受體-SMAD途徑。B：TGFβ兩大支路TGFβ信號通路（綠色）BMP信號通路（藍色）的簡略圖。C：不同環境中轉錄輔助因子的不同結合決定特異活化的SMAD蛋白作用于不同。D：TGFβ信號通路的3種模式：Smad4依賴性RSmad信號途徑（經由TIF1γIKKα和p68DROSHA的相互作用過程）Smad依賴性受體Ⅰ信號途徑（經由小G蛋白和MAPK信號通路）和直接受體Ⅱ信號途徑（Pra6和BMPR-Ⅱ存在下LIMK1過程）E：中TGFβ信號通路組件的突變（紅），過表達（黑）或表達下調（綠）TGFβ悖論TGF-β1作為TGFβ中最早發現的成員之一，對細胞生長，血管增生，細胞轉分化，細胞轉移侵襲以及運動能力具有重要的調節作用。而在腫瘤早期階段，TGFβ1通過周期阻滯抑制腫瘤細胞生長，誘導細胞凋亡。TGF-β最初得到認定因為能夠促進正常小鼠神纖維細胞形態學的轉化和增殖24]TGF-β悖論的提出是在30年前它被證明還是一種潛在而強大的細胞增殖抑制因子25。因此，TGF-β既能促進間葉細胞的增殖，又能抑制上皮細胞。值得注意的是有研究表明轉化后的細胞TGF-β含量是原來非轉化的40倍[26]。這重要的結果明顯暗示了細胞轉化伴隨著TGF-β的腫瘤抑制功能的喪失。這種假設很快在腫瘤發生小鼠模型中得到了證明。例如，將能緩慢TGF-β的小球植入雌鼠體內，發現小鼠乳腺的生長和形態發生受到了抑制[27。相反，接種中和TGF-β抗體能增強自然細胞的能力消除小鼠的生長和[28]。組成型活化的TGF-β1的有條件表達證實了TGF-β的特殊的促進轉移的功能。TGF-β1能選擇性的增強肺癌細胞的轉移而不改變癌細胞的生長和增殖29。同樣的，在一個皮膚癌化學癌發生模型中，組成型活化的TGF-β1的在小鼠的角質細胞轉表達能促進它們增殖，最終向紡錘形細胞癌轉化[29,30]。最近，有人將小鼠頭部和頸部上皮細胞的TβR-Ⅰ敲除后，發現腫瘤啟動劑二甲基苯并蒽（dimethytenzanthracene，DMBA）仍能促進物誘導的腫瘤發生，在某種程度上是依靠PI3KAKT信號通路的活化[31種TβRⅠ單倍型不足與Apc(Min/+)的結合發生的腸癌幾率是與野生型結合的小鼠的兩倍[32。總結來說，TGF-β能有效抑制腫瘤發生和早期腫瘤的生長，但能有力地促進晚期腫瘤細胞的發生轉移。TGFβs與發生、不TGF-β1作為TGFβ中最早發現的成員之一，對細胞生長，血管增生，細胞轉分化，細胞轉移侵襲以及運動能力具有重要的調節作用。TGFβ亞型和其受體在成人組織的體細胞和精細胞都有存在，而在睪丸的不同發育階段，TGFβ1均有表達并以自或旁等方式參與調控發育和發生過程，具有調節細胞的增殖和凋亡以及血屏障啟閉的重要功能[3]。免疫組化研究顯示TGFβ和其受體在小鼠細胞發生過程中具有細胞特異性和周期特異性。在上皮發展中，TGFβ1最早表達于晚期圓形細胞[33]。支持細胞是組織中TGFβ1的主要細胞，TGFβ1能抑制一種間質細胞（Leydig）的增殖和調控其分化進程，下調睪酮的[34]，暗示TGFβ1在雄性不育方面的作用。在TGFβ1缺陷型雄性中，雖具有正常的形態學，和，但不能存放或引起女性假孕，血液中和內的睪酮以及血二酮含量少。雄鼠體內TGFβ1的缺失會導致和酮以及二酮急劇下降，睪酮的缺失加上激素和較小程度上的血促激素減少會制垂體促激素，若加以人類絨毛膜促激素替代外源性促體激素血睪酮又回到正常水平35]TGFβ1這種遺傳缺陷可能對力有重要影響。血睪屏障（blood-epidipymisbarrier,BEB）是上皮緊密連接介導的附睪上皮選擇性滲透現象。血睪屏障的缺失導致環境失衡，可能引起不育。Stammler等用TGFβ1處理上皮細胞MEPC5細胞系，通過跨膜電阻（transepithelialelectrical，TER）和FITC-Dextran示蹤擴散實驗檢測細胞旁通透性發現TGFβ1干擾血睪屏障，并引起上皮細胞緊密連接蛋白claudin-1表達下調，而對閉合蛋白沒有影響36]。上皮細胞這種響應來自基底TGFβ1TGFβ1參與血睪屏障通透性調節。TGFβ還能調節胚胎發育，在不同時期TGFβ表達不同。大鼠睪丸發育過程中，剛出生（postnatalday0P0）P10兩個時期TGFβ1的mRNA水平表達最高；TGFβ2在胚胎第15天embryonicday15E15表達最高，E16表達下調，在P0和P3有短暫的上升；TGFβ3在整個胚胎發育過程表達都比較高，P3后開始下降。免疫組化顯示E14的支持細胞和P0形成期間TGFβ1和TGFβ2有高表達，P0期選擇性間質細胞也高表達TGFβ1和TGFβ2[37]。在P0期TGFβ1還能抑制表皮生長因子（epidermalgrowthfactor,EGF），可能通過在胚胎發育和早期發育兩個階段抑制發育[38]。在發育過程中，TGFβ1突變鼠生殖細胞在剛出生當天數目減少；TGFβ2突變鼠在胚胎15天后，形成的數量減少。TGFβs在胚胎發育不同階段分布不同，而不同TGFβ亞基通過互作彌補一些亞基的突變缺失，推測TGFβs在發育過程中扮演一定的角色39。microRNA概述microRNA的發現與發展microRNA（miRNA）是一類新發現的短片段，非編碼的調控RNA，由約22個核苷酸組成。1993年，Lee等在研究線蟲發育過程中發現了第一個miRNA—lin-4[40]。隨后，2000年,Reinhart等蟲中發現了第二個miRNA—let-741]。miRNA逐漸成為生物學研究的熱點。隨著生物技術的發展，人們蟲、果蠅、、小鼠、水稻、人等生物中發現了數千種miRNA。升級的miRNA數據庫miRbase20.0中顯示miRNA發夾24521miRNA序列有30424miRNA中，人成miRNA有2578條，小鼠成miRNA有1908條，大鼠miRNA有728條。microRNA通過與靶mRNA的3’-UTR的相互作用而降低靶mRNA穩定性或轉錄后抑制蛋白的，從而在細胞增殖、分化、代謝、與發育過程中發揮重要作用。大部分miRNA定位于組不穩定熱點區域，這些區域的擴增、缺失或重排均可導致miRNA異常表達，進而影響細胞的進程。同時，miRNA的表觀修飾和生物學的異常均影響miRNA的表達和功能。在miRNA中，有些性miRNA具有類似癌功能，如miR-21、miR-10b；有些抑癌性miRNA具有類似抑癌功能，如let-7、miR-15/16等，這些miRNA通過影響腫瘤細胞增殖、細胞周期、凋亡、侵襲轉移和藥物代謝等而參與腫瘤發生發展 [42-44]。轉錄因子、miRNA和靶之間組成的錯綜復雜的調控網絡，在信號轉導通路調控中扮演重要角色，實現對生命活動及疾病發生發展和轉歸過程的精細調控。microRNA的生物miRNA的發現豐富了的內涵。miRNA由編碼miRNA的gDNA轉錄而來。大多數miRNA由編碼序列而來，有一套獨立的編碼調控序列來轉錄。而部分miRNA定位于蛋白質編碼的內含子中，與蛋白編碼共轉錄，然后經過剪切而來。從gDNA到成miRNA經歷了一個復雜的轉錄、剪切、轉運和成熟過程。如圖1.2gDNARNA聚合酶作用下轉錄成miRNA的初級轉錄產物（primarymiRNApri-miRNApri-miRNA長達幾千個堿基，具有帽子結構和polyA尾巴。在細胞核中，pri-miRNA被Drosha剪切長約70個堿基長5端帶磷酸基3端為莖環結構miRNA（precursormiRNApremiRNApre-miRNA被轉運到細胞質內pre-miRNA經Dice酶剪切形成成miRNA。圖1.2成熟miRNA的產生及作用機制（/china-mainland/zh/life-science/functional-genomics-and-rnai/mirna/learning-center/mirna-introduction.html）miRNA的負性調控機制成miRNA與Argonaute（AGO）蛋白等形成RNA沉默復合（RNA-inducesilengcingcomplex,RISC）,RISC通過完全或不完全的結合方式作用于靶mRNA的3’UTR。如果成miRNA與靶的mRNA完全互補配對，則引起mRNA的降解。成miRNA與靶的mRNA不完全互補配對，則引起mRNA發生脫腺苷酸化和脫帽現象，最終導致mRNA降解；或通過AGO與翻譯起始因子競相結合mRNA帽子結構，阻礙核糖體裝配，則引起翻譯抑制。另外，這種不完全互補配對還能聯合多肽鏈降解相關的細胞因子（肽酶，翻譯后修飾酶），使核糖體與肽鏈解聚或使新生肽鏈發生降解，造成翻譯受阻。通過這種負性調控基因表達機制，miRNA在細胞的增殖、凋亡、分化、代謝等生物過程中發揮著重要作用。Yin等[45]在TGF-β1處理小鼠顆粒細胞（ovariangranulosacells,GCs）后，發現miR-320表達下調；過表達miR-320通過負調控E2F1和SF-1抑制雌激素（E2）生成和GC細胞增殖。Zhao等[46]利用生物信息學工具和雙熒光報告技術發現miR-141作用于靶MAP4K4抑制胰細胞的增殖，集落形成和侵襲過程。miR-101是TGFβ通路的一個抑制因子，主要通過作用于TβRⅠ和它的轉錄活化因子KLF6Tu等47]利用小鼠模型證明了這點，他們發現在纖維化肝miR-101表達下調而TβR/KLF6表達上調。進一步研究發現TβRⅠKLF6是miR-101miR-101miR-101寡核苷酸實驗發現，miR-101通過作用于靶TβRⅠ/KLF6抑制肝纖維化。miR-1915能抑制靶Bcl-2表達，在DNA損傷凋亡反應過程中，腫瘤抑制因子p53通過誘導miR-1915表達實現對Bcl-2的負調控[48]。miR-146a負調控靶NF-κB調節平滑肌細胞的突變和分化[49]。人們多年的探索，正在逐步揭示miRNA在發育和疾病發生中的作用。TGFβ1micro現有表明，microRNAs的表達與TGF-β悖論的有關，并在致瘤TGF-β 信號通路中增加。比如說，TGF-β誘導的EMT 會使microRNA-200表達下調，microRNA-200本身能促進ZEB1/2的表達和在轉化細胞中對E-cad表達的抑制作用[50,51]。而且miR-200c表達的缺失可能與識別高轉移和高侵襲力的腫瘤細胞有關[52,53]。有的是，miR-200c表達的缺失與p53功能失活有聯系[54]。最近，有人發現了一種TGF-β誘導EMT的潛在抑制子—c-Ab1[55]，它介導p53表達的復活和誘導p21[56]。提高ZEB1/2的表達，伴隨著的EMT能有效克服抑癌因子p53活化或上皮生長因子受體（EGFR）過表達誘導的衰老作用[57。除了miRNAs的microRNA-200的調節作用之外，TGF-β還能調節原miR-21向前miR-21的轉錄過程，該過程是Smad23復合體形成所必須的。這些miRNA在正常的Smad4缺失細胞中發生突變[58，因此這與經典的偶聯著miRNA過程的TGF-β信號體系存在一個新的。TGF-β對miR-21和miR-31表達的刺激作用，能促進EMT過程，進而影響細胞的轉移和侵襲能力，推測是通過鳥嘌呤交換因子Tiam1的表達下調T細胞淋巴瘤的轉移和侵襲研究[5960TGFβ通過Smad4獨立途徑誘導miR155表達是EMT過程中RhoA表達下調所必須的，miR155作用于smad2基因的3UTR抑制SMAD2的表達影響TGFβ應答途徑[61Myc的擴增能誘發miR-9的表達，后者能通過下調E-cad表達提高細胞的轉移能力[62]。盡管，還沒有檢測到它在TGF-β調節這些事件中的直接作用，但這些結果可能供了一個新的觀點，就是Myc的異常表達無視TGFβ的細胞抑制作用[63641.3描繪了miRNAsTGFβ因子在EMT過程中的相互關系。圖1.3TGFβ誘導EMT過程中各轉錄組的差異表和相互關系[65紅色表示在TGF-β誘導EMT過程中表達上調，綠色在TGF-β誘導過程中表達下調，橙色表示TGFβ誘導EMT過程中酶活性增加microRNA與生殖細胞microRNA在生殖細胞發育過程中的作用發生是一個二倍體細胞分化成單倍體細胞的過程。FrantzBouhallier等在研究microRNA在發生過程中的作用時發現miR34c在生殖細胞中高表達。TGIF2和NOTCH是miR34c的直接靶標,miR34c誘導TGIF2NOTCH表達下調[66TGIF2是一個轉錄抑制因子，是TGFβ信號通路的抑制子，TGIF2的下調會增強TGFβ信號[67]。NOTCH2在生殖細胞中幾乎不表達，在體細胞分化中扮演重要角色[68NOTCH2所在的NOTCH信號通路調節細胞分化抑制，細胞增殖和干細胞數目控制等過程69。miRNA生成通路的阻斷實驗表明miRNA對于生殖細胞在繁殖是必不可少的。生殖細胞特異性DICER敲除小鼠，PGCs（Primordialgermcells）移植在后，在E11.5之前表現為正常生殖細胞數量此后急劇下降。后續觀察發現雌性生殖細胞恢復而雄性生殖細胞沒有恢復。而新生的鼠只有野生型小鼠發生細胞數量的一半[70]。miRNA也是發生后期所必需的。在研究DICER缺失鼠3，4，8和16周以及8個月后發現在少數小管有激活的發生過程，而成年小鼠發生不育[70,71]。許多小管還是Sertoli細胞表型或是精細胞缺失。成年小鼠小管內Sertoli細胞數量增加，少數小管還存留著圓形精細胞，而擁有成熟精子的小管的比例下降[71]。Hayashi等檢測DICER缺失鼠子代的基因組發現大部分幼鼠擁有完整的DICER，精細胞能逃避抑制作用形 。這也暗示衰老過程中成年小鼠的不育可能是由dicer缺失引起的[70]。Maatouk等[71利用CR（campresponseelement）重組酶受體系統觀察精細胞dicer缺失小鼠的發現缺失精細胞能進入變性段。雖形成了正常的頭部，尾巴生成方向發生錯誤，殘留的細胞和線粒體異常導致明顯的運動能力缺失。這也解釋了確實小鼠的繁殖能力下降的原因。上述這些研究表明DICER的缺失會引起細胞增殖受阻和早期發生。由此也可看出，miRNA在發生和細增殖過程的重要性。microRNA在組織內的表SeungilRo等[72]通過新sRNA克隆技術，在小鼠中鑒定出141個miRNA，其中29個是新miRNA。70%miRNA定位于內或間區域。60%miRNA在體內廣泛表達，35%在內高表達，5%為睪丸特異性表達。miRNA在不同生殖細胞發育階段表達不同。在小鼠中，miR141200a200c323隨著發育多的進行會逐漸下調70。而let7miRNA以及miR-125a和miR-9會在雄性生殖細胞發育過程中表達增加。MiR-125a和let7都是抑癌。let7調節RAS途徑和Fas介導的細胞凋亡過程，而miR-125a在細胞中結合HuR抑制細胞生長[73]。在發生期間轉錄后調控非常活躍。大規模轉錄發在兩個階段：減數期間細胞呈之前（如粗線期）和再次減數裂后細胞核沉默之前。三分之二以上的轉錄產物會被翻譯74。miRNA水平的增加與這些活化的轉錄保持一致。現如今，miRNA靶涌現，日新月異，拓展了對miRNA結合位點的認知。將 和實驗驗證結為尋找miRNA與靶的捷徑。通過這種方法，Yan等鑒定了miRNA潛在的幾個重要的與發生相關靶。如，sox5和sox6是miR-181c的靶基因，rsbnl是miR-355，181c和181b的靶[75]。在恒河猴中，的miRNA靶標包括NOTCHI（miR-34b34c和449等的靶標）和BCL2（miR-449的靶標）[76]。利用豬模型，Luo等進一步檢驗了這些差異表達miRNA分子的靶的表達水平，分析發現候選dazl可能是miR-34b和34c的靶[77]。蛋白質組學研究生物調控機制十分復雜，涉及到多個的多個層次的系統調節是遺傳信息的載體，而蛋白質是功能的執行者，更為直接的與生物調控。要物調控機制，直接是的結構是不夠的，必從蛋白質水平進行系統的深入的研究。蛋白質組學的出現為從全和整體的角度發現并解決問題，更全面地分析生命活動規律開辟了新的生命科學研究領域。蛋白質組學簡介蛋白質組（proteome，意指proteinexpressedbyagenome）由澳大利亞學者Williams和Wilkins于1994年首先，源于蛋白質（protein）和組（genome）兩個詞的雜合，即“組所表達的全部蛋白質”，是對應于一個組的所有蛋白質組成。由于在不同細胞、不同組織中的表達情況各異，甚至同一細胞或組織類型在不同生理條件，不同發育階段中，表達和蛋白質組成情況也各不相同。蛋白質組是一個時空上動態變化的整體，而蛋白質組學（proteomics）是指通過各種技術應用從整體出發研究細胞內多變的蛋白質組成成分、表達情況和修飾狀態，了解蛋白質之間的相互作用與聯系，揭示蛋白質功能與生命活動規律。二十世紀中期以來，隨著DNA雙螺旋結構問世與蛋白質空間結構的成功解析，進入了分子生物學時代。對DNA和蛋白質的研究，成為生命科學研究的主流。在后組時物學研究的重點已轉向遺傳信息在整體水平上對生物功能的研究，功能組學應運而生。功能組學將遺傳信息和生命活動建立聯系。的功能主要是在mRNA水平與蛋白質水平上體現。近年來各種新技術在mRNA水平上的研究比較多，而且取得了很大的進展，但是mRNA水平不能完全體現蛋白質水平的狀況，mRNA與蛋白質的相關系數只有04~05。蛋白質是生命功能的主要而直接的執行者，具有翻譯后加工修飾、轉移定位，蛋白質與蛋白質及蛋白質與其他生物大分子相互作用等特點，很難從DNAmRNA水平體現蛋白質水平的狀況。這使得人們開始從整體蛋白的組成、表達差異和功能角度去物調控機制。蛋白質組學研究在國內展十分迅速。基礎理論和技術方法都在不斷的進步和完善。許多種細胞的蛋白質數據庫已經建立，互聯也層出不窮，目前被認為收錄最廣泛和注釋信息最全面的蛋白質數據庫是Uniprot（http://www.uniprot./）,是由歐洲生物信息（EBI、白質信息資源（PIR）和生物信息（SIB）合作建立的，涵了非常全面的蛋白質序列，蛋白質結構和功能信息，還提供了其他相應的數據庫，包括2-DE凝膠電泳數據庫和蛋白質數據庫等。國內如上海生物 也在建立和相關數據庫SDSPB。近年來蛋白質組學研究的文章每年增長很快，但不同領域數量不同。比如，作者以“proteome”為關鍵詞之一在PUBMED（http://www.ncbi.nlm.nih. /pubmed/）“ALLFIELD”條件下檢索不同物種的相關文獻結果（圖1.4。結果發現蛋白質組學在人類領域的相關文獻有14867篇是第二名的小鼠的4倍多，與動物蛋白和菌類蛋白相比植物蛋白還比較滯后。另外以“proteomecancer”和“proteomeTGF-β1”為搜索發現與相關的蛋白質組學文章多達4733 篇，而與TGF-β1相關的文獻非常少。這也暗示了目前蛋白質組學研究的領域還比較集中，還有許多領域需要人們去開拓。蛋白質科學及技術儼然成為了生命科學與生物技術的重要前沿，是生命科學突破與生物技術的創新的必由 圖1.4蛋白質組學在不同領域的文A：“proteomics”加“物種名”為在pumbed中的檢索結果；B：“proteomics”加“cancer”或加“TGF-β1”為在pumbed中的檢索結蛋白質組學研究方法（expressionprofile）研究，主要研究蛋白質組成。雙向凝膠電泳（two-dimensionalgelelectrophoresis,2DE和質譜鑒定技術及生物信息學為蛋白質組表達模式的主要技術。蛋白質組學研究常需要蛋白質分離和純化技術。透析、超濾、鹽析、免疫沉淀、電泳和層析等是最常用的蛋白質分離和純化技術。利用透析袋可以將大分子蛋白質與小分子化合物分開。超濾是應用正壓或離心力使蛋白質溶液透過有一定量截留分子量的超濾膜，濃縮蛋白質，回收率高，是最常用的蛋白質濃縮方法。針對蛋白質的不同理化及生物學性質，我們還可以采用不同沉淀方法沉淀濃縮蛋白。如蛋白質在溶液中溶解度低，易產生沉淀，通過沉淀法可將蛋白質沉淀濃縮；鹽析法中將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質溶液，是蛋白質表面電荷中和且水化膜遭破壞，導致蛋白質在水溶液中的穩定因素去除而沉淀；利用特異抗體識別相應的抗原蛋白，并形成復合體，可從蛋白質混合溶液中分離獲得抗原蛋白。在蛋白質分離技術中，蛋白質在高于或低于其等電點的溶液中為帶電顆粒，在電場中能向正極或負極移動，這種通過電場泳動而達到分離各種蛋白質的電泳技術是最重要的蛋白質分離技術，常用的有SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和等電聚膠電泳（IEF）等。另外，層析是蛋白質分離技術的主要技術之一，通過流動相經過固定相，根據溶液中待分離的蛋白顆粒大小、電荷多少及親和力等，將待分離的蛋白質組分在兩相中反復分配，并以不同速度流經固定相而達到分離目的，如離子交換層析和親和層析等。基于上述這些單向蛋白質分離技術，人們開發出了雙向凝膠電泳，并迅速成為最主要的基于蛋白質組分分離技術。OFarrel創立此技術之時，從大腸桿菌中分離出了1000多個蛋白質組分。目前最廣泛的實用2-DE技術路線是蛋白質提取、2-DE分離蛋白、染像分析、蛋白差異點尋找最后采用質譜鑒定技術鑒定差異點，驗證結果并進行生物信息學分析。2-DE技術由于其高分辨率、可視性高而得到廣泛應用，但此技術重復性低，對等電點和分子量蛋白分離效果不好是其難以服的缺點。，因此發展了許多新型高分辨率、高通量和容量的分離技術的非凝膠技術，如液相色譜法（liquidchromatography,LC、毛細管電泳技術（capillaryelectrophoresis,CE）等。這些非凝膠技術簡化了蛋白質組研究步驟，又可與質譜聯用實現對2DE技術路線的有效補充，但尚不能取代2-DE在蛋白質分離中的地位。鑒定分離純化出來的蛋白質是蛋白質組學研究的任務，備受親睞和重視的鑒定技術要屬質譜（MS）MS是目前蛋白質組研究中發展最快的技術。其基本原理是樣品分子離子化后，根據離子鍵質荷比（m/z）的差異來分離并確定樣品的分子量。目前最普及的質譜技術如兩級飛行時間串聯質譜（MALDI-TOF-TOF/MS）和傅里葉轉換回旋質譜（FTMS）等聯合了幾種鑒定技術精確鑒定蛋白，使蛋白質鑒定的靈敏性、可MALDI-TOF-TOF/MS更是成為眾多生物公司提供質譜鑒定技術的主要技術之一。隨著蛋白質組表達模式的深入研究，修飾蛋白和蛋白質-蛋白質相互作用的研究已成為蛋白質組學研究的重要內容，即蛋白質組功能模式研究。近年來蛋白質組學研究技術發展日新月異，出現了許多有效的功能蛋白質組研究方法，如酵母雙雜交系統，噬菌體展示、生物傳感質譜、工程和蛋白質工程中的突變表達分析、核磁成像、X線晶體衍射分析、蛋白質技術等。蛋白質組研究在技術發展方面出現了多種技術聯合，相互整合互補，取長補短，以適應不同蛋白質特征。另外，蛋白質組研究與其他學科如組學、生物信息學等領域的交叉日益顯著和重要，呈現出新的系統生物學（systembiology）研究模式，成為生命科學的新奇前沿。蛋白質組學在雄性生殖系統的研究蛋白質組學是一個物理學與生物學的前沿的交叉點，并迅速成為分子和細胞生物學的潛力應用。蛋白質組學為不育研究帶來了新的突破口。通過從蛋白質組范圍的差異性研究，人們尋找到新的生物標記分子，查明蛋白分子水平的變化，進一步揭示疾病發生的分子機制。水泡蛋白分選因子VPS54的突變會引起梅花頭老鼠（WR）運動神經元變性和圓頭癥。通過雙向熒光差異凝膠電泳檢測發現這種突變會導致8種蛋白表達上調和35種蛋白表達下調，而質譜分析結果中，發現這些蛋白與代謝物轉運，細胞間互作，脂肪酸代謝，微管組裝以及應激反應等有關。其中通過免疫印跡驗證得到了一個脂肪酸結合蛋白FABP3在突變WR的中是下調的。由此，可知VPS54的錯義突變不僅會抑制的形成還會誘發一系列的 代謝異常和應激反應[78]。LiJ等通過2-DE和MALDI-TOF-TOF/MS分析支持細胞綜合癥（SCOS）的組織找到了導致SCOS 的發生關鍵因子異構核糖白L（HnRNPL）[79] 組織的蛋白質組學研究最近基于2-DE的研究為提供了一個含有1908個蛋白點的人類蛋白質遺傳圖譜[80]。此外，蛋白質的剪切異構體和磷酸化形式的報道為更好地理解這些人類組織蛋白的調節機制和抑制性。2-DE數據庫（/2d）作為一個常用資源，提供了有關正常患者組織的比較蛋白質組學信息，為生物標記物的發現鋪平了道路[80]。研究正常組織和病理性組織發現有10個與發生相關的差異蛋白，其中四個蛋白（GPX4Prx4HSP27和CTSD）在各種發生階段，包括細胞移動和過程，扮演重要角色[81]。如果這些蛋白能被證明作為分子標記，那么為不育調節和方面提供了新的思路。雖然在不同發育階段和分化階段組成精上皮的細胞亞群和細胞類型不同，但對單個細胞群如細胞，細胞，圓頭和細長細胞蛋白質組知之甚少。Com等[82]通過肽圖譜和串聯質譜在大鼠曲精細管的細胞鑒定出156個新多肽。這些多肽對應102個差異蛋白，反映出翻譯后修飾的復雜性，其中79個蛋白首次被認定與發生有關。Rolland等[83]利用2D-DIGE比較細胞，減數期細胞和細胞的蛋白質組發現123個獨特的與發生過程有關的差異蛋白。這些蛋白涉及了能量代謝，轉運，轉錄RNA加工，應激反應和凋亡等生物學過程。闡明發生過程不同階段蛋白質的差異有助于更好地理解發生過程的編排機制。 和的蛋白質組學研究蛋白質組學還應用在精細胞微環境研究上。微環境中含有精細胞和的物。最近，Li等[84]利用2-DE和MALDI-TOF繪制了精子定位蛋白和精細胞微環境蛋白質組的圖譜，得到了725個獨特蛋白，其中240個蛋白經蛋白質印跡驗證在精細胞微環境中，167個蛋白經免疫細胞化學驗證定位在成熟細胞中。免疫組化不同組織細胞的定位蛋白有利于內在蛋白和外在蛋白的鑒定和描述，闡明了突變和的蛋白質組的差異。作為的主要組成部分，含有來自，和副腺的多種蛋白，成為利用2DDIGE評價不育的生物標記分子的潛在資源[85]。通過這些研究找到了4個非梗阻性缺乏相關的候選標記分子：STAB2，CP135，GNRP和PIP，有利于進一步的非梗阻性缺乏的臨床研究。 人類細胞的蛋白質組學研究在發現階段的蛋白質組學研究非常多。在研究人類表面結合了矢量標記，微分萃取和2-DE方法鑒定了一批新的分子，Percoll梯度分離和1%TritionX-100裂解純化再進行蛋白組學分析，結果鑒定得到大量的精細白組成成分，表明糖基化是精細胞中最重要的翻譯后修飾87。在探索父本轉移至細胞后的功能過程中，deMateo等[88]得到了一系列精細胞白。人類精細胞白由魚精蛋白和組白組成。在提取的人精細胞，2-DE幫助鑒定了12種魚精蛋白P1和P2相關蛋白以及特異性組蛋白（H2B）[89]。定量分析不育患者的P1和P2，發現P1和P2的比率失衡，暗示這些蛋白可作為男性不育的標記[90]。一些蛋白質組學研究還比對了不育患者會正常捐精者的蛋白質組，鑒定出了許多不育相關潛在蛋白[91-93]。Shetty等[91]在已鑒定的98個精細胞自身抗原和同系抗原中，進一步用125I矢量標記法分析得到6個與抗體介導不育相關的自身抗原和同系抗原。體外失敗患者的蛋白質組學研究表明在組成成分上存在有20個差異蛋白點（6個蛋白點缺失-其中兩個是DDX37和促肌動蛋白結合蛋白，3個蛋白點再表達其中兩個為溴結構域PHD指轉錄因子和外層致密纖維蛋白224個蛋白點表達下調，7個蛋白點表達上調均還未鑒定）[92。另外58個差異蛋白與魚精蛋白含量和精細胞DNA整體性有關[93。而Heredia等94通過2DEMALDI-TOF法在人類精細胞中鑒定出98個蛋白，其中10%與細胞骨架，鞭毛和細胞運動有關。蛋白質組學研究還用于生殖毒性物質如乙二胺單乙酰匹林25己二酮對大鼠精細胞的毒性作用，鑒定得到了谷胱甘肽S轉移酶，特異性熱休克蛋白70，甘油酸3磷酸脫氫酶和磷脂酰乙醇胺結合蛋白。大部分這些毒性物質引起的組織病理學變化前的蛋白質組差異得到鑒定，有利于尋找生殖和毒性的潛在生物標記分子95。研究思路綜上所述，發現發生等過程是不育的重要原因研究和探索發生機制對解決這一世界性難題具有重要意義。研究發現，TGFβ具有調節細胞的增殖和凋亡以及血睪屏障啟閉的重要功能，而且還在這些過程中呈周期性和特異性，提示TGFβ在發生發展等過程中起著舉足輕重的作用。為了闡明TGFβ調控發生的分子機制，明確其在發生、發展中的生物學意義，設想：在TGFβ1控制和維持生殖細胞發育的過程中，是否還有未知的關鍵分子在起作用？它們是否與發生過程有關？miRNA分子的挖掘與研究顯示，miRNA的負性調控機制在表達的過程中的重要作用啟示了其在生物學過程中不可缺少的色。而另一方面，蛋白質組學技術的發展也進一步拓展了的研究認知。基于此，為了回答科學問題，本課題采用小鼠上細胞為研究材料，分別從miRNA水平和蛋白質水平探討參與了細中受TGF-β1誘導的差異分子。具體研究思路如下：小鼠上皮細胞（GC-1spg）的同步化不同濃度TGFβ1RNA提 蛋白質提microRNA分差異microRNA篩選microRNA靶靶定量PCR驗證

MALDITOFTOFMS鑒定差異蛋白的篩選定量PCR驗證關鍵靶分子的GEO數據檢索分析差異miRNA與蛋白質的功能初步分析第2 基于microRNA技術篩選受TGF-β1誘導的差異miRNA分子前言TGF-β是一種機體內廣泛存在的多功能的多肽類細胞因子，其信號通路的多效性和信號協調性及依賴性在細胞增殖，轉分化，和遷移等具有廣泛的生物學效應。TGFβ在發生過程中的重要作用十分復雜涉及的分子表達也并不單一。要研究篩選TGF-β1誘導細胞的關鍵分子，無非是從和蛋白水平兩個方面去尋找。而miRNA的出現，打開了分子調控機制新的一頁，其涉及了廣泛的生物過程和疾病發生過程，水平的研究不再是傳統而單一的mRNA水平研究。miRNA是一類短片段，非編碼的調控RNA。miRNA通過與靶mRNA的3’UTR的相互作用而降低靶mRNA穩定性或轉錄后抑制蛋白的，從而在細胞增殖、分化、代謝、與發育過程中發揮重要作用。如miR-21、miR-10b具有類似原癌功能[42,43]，let-7、miR-15/16等有類似抑癌功能[44，miR9、miR155和miR200等參與TGF-β1誘導的EMT過程[50516162。在生殖細胞中miR34c高表達會抑制TGIF2和NOTCH，TGFβ信號增強而NOTCH信號通路受抑制[66]miRNA形成過程中dicer缺失會引起細胞增殖受阻和早期發生造成成年小鼠不育[70,71]。人們開始探索靶上游miRNA水平的研究。因此，本章將從miRNA水平探索小鼠上皮細胞系GC-1spg中受TGF-β1誘導的關鍵miRNA分子。材料與方法實驗儀器實驗用儀器：本實驗中所涉及到的儀器的名稱、型號及生產廠家如表21所示：表2.1實驗儀器及型號規格儀器名稱型號規格制造廠家蛋白核酸測定儀22331HamburgEppendorf立式壓力蒸汽滅菌鍋LDZX-40百奧儀器離心機5810REppendorf續表CO2培養 ThermoForma Thermo公司動物細胞培養 HBRVU-187.5 榮華儀器制造超凈操作 BHC-1300ⅡA/B 江蘇蘇凈公數顯恒溫水浴鍋 HH-S 江蘇省金壇市醫療儀器廠微型旋渦混合儀 WH-2 滬西分析儀器廠電子天 PB303- METTLERTOLEDO公pH DELTA METTLERTOLEDO公-80℃冰 MDF-U5410 SANYO公電熱恒溫鼓風干燥 DHG-9246A 精宏實驗設備4℃冰 BCD-185D 美的電器數顯震蕩培養 BS- 榮華儀器制造純水系統 Milli-Q Millipore中國熒光倒置顯微鏡 EclipseTE300 Nikon公司激光掃描共聚焦顯微 TCSSP2Leica Nikon公司電泳 DYY- 六一儀器廠梯度PCR T-GRADIENT 德國Biometra公熒光定量PCR MX3000 Stratagene材料與試劑細胞GC-1spg細胞：小鼠B型上皮細胞系ATCCCRL-2053?。培養于10%胎牛的DMEM中，為本保存。試劑TGF-β1購自PeproTech公司。DMEM和改良型RPMI1640培養基、新生小牛和胎牛全都購自Hyclone公司；青霉素與鏈霉素6孔板、24孔板和96孔板購自Thermo公司；胰蛋白酶粉劑、細胞培養瓶、0.22μm濾膜等購自鼎國生物技術；DNAmarker、普通PCRDNA聚合酶、質粒小提試劑盒和DNA純化試劑盒購自天根生化科技有限公司，RNAisoPlus總RNA提取試劑、PrimeScripttmmiRNAqPCRStarterKitVer試劑盒購自TaKaRa公司；FastStartUniversalSYBRGreenMaster(Rox定量PCR試劑盒購自Roche公司；鈉鉀鹽類等均為國產分析純；所有引物均在生工生物工程（）公司。實驗方法細胞培養細胞培養均采用250ml的細胞培養瓶，在超凈工作臺內完成所有操作，移液槍吸掉舊培養基，用D-Hanks緩沖溶液3~4次；然后加入適量（覆蓋細胞即可）0.5胰酶，放入37℃溫箱消化30s60s（消化過程需配合顯微鏡觀察細胞消化狀態），消化完畢，移液槍吸取去掉胰酶；加入2ml新的培養基，用移液槍將瓶壁上的細胞勻速吹打下來，反復吹打細胞懸液間歇輕輕晃動培養瓶，這樣細胞充分懸浮在培養液中。最后進行細胞計數，依細胞量傳代分瓶，最后補加4ml新的培養液，蓋上瓶蓋（不能太緊）375CO2、飽和濕度的培養箱中繼續培養。細胞處理TGF-β1配制：首先加10μl的10mmol/l的檸檬酸溶液溶解1μg的TGF-β1粉末；再用DMEM培養基稀釋至200μl，使終濃度為5μg/l；然后分裝成10管，每管20μl，保存于80TGFβ1處理GC1spg3（號AB和C。當細胞培養接近細50融合度時，3個組都更換為無血清培基，饑餓細胞24h9697，使細胞同步化。同步化細胞后3個組都更換含1FBS的DMEM培養液5ml，其中實驗組B再加入10μl的5nglTGFβ1（TGFβ1的終濃度[98100為5ngml）；實驗組C加入20μl的5nglTGFβ1（TGFβ1的終濃度[98100為10ngml）；對照組A不加TGFβ1為等體1FBSDMEM3個組細胞在375CO2、飽和濕度的培養箱中培養48h。RNA提取步驟如下：①將培養的細胞，去掉培養基，用DHanks緩沖溶液輕洗1次。②每10cm2生長的培養細胞需1mlRNAisoPlus，適量加入后水平放置并顯微鏡下觀察細胞裂解情況，裂解液均勻覆蓋細胞層上，細胞迅速裂解，再利用移液槍反復吹打，細胞完全裂解。③用移液槍將細胞裂解液轉移至滅菌的離心管中，并輕輕吹吸至裂解液無沉淀。④室溫下靜置5min（或凍存在-80℃，用于microRNA分析和下一次RNA提取。⑤再將氯仿加入向上述勻漿液（RNAisoPlus1/5用量），蓋緊后劇烈振蕩15s（氯仿沸點低，易揮發，振蕩時應離心管蓋突然彈開。充分至無明顯分相現象后，室溫下繼續靜置5min⑥12,000g415min⑦離心之后，管中勻漿分三層：無色上層清液、中間白色蛋白層及下層淡紅有機相。200μl移液槍細心吸取上清液至新的EP管中（切忌吸出白色中間層。⑧向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在15~30℃下靜置10min⑨12000g410min一般在離心后，試管底部會出現沉淀。⑩注意用不同小量程移液槍去上清液，沿EP管壁緩慢地加75的乙1ml（切勿觸及），水平側動洗滌EP