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DB33浙 江 省 地 方 標 準DB33/T2287—2020羅氏沼蝦雙順反子病毒-1檢測規(guī)程DetectionprotocolsforMacrobrachiumrosenbergiidicistrovirus-12020-11-30發(fā)布 2020-12-30實施浙江省市場監(jiān)督管理局 發(fā)布DB33/T2287DB33/T2287—2020PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII前 言本標準按照GB/T1.1-2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》給出的規(guī)則起草。本標準由浙江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本標準件由浙江省水產(chǎn)標準化技術(shù)委員會歸口。本標準起草單位：浙江省淡水水產(chǎn)研究所。本標準主要起草人：潘曉藝、沈錦玉、藺凌云、姚嘉赟、尹文林、曹錚、劉憶瀚、夏炎春。引 言本標準的發(fā)布機構(gòu)提請注意如下事實，聲明符合本標準時，可能涉及到6.10-6.11中引物與《羅氏沼蝦雙順反子病毒全基因組序列及其應(yīng)用》(專利號：201110296487.9)專利權(quán)的使用。本標準的發(fā)布機構(gòu)對于該專利的真實性、有效性和范圍無任何立場。專利持有人：浙江省淡水水產(chǎn)研究所地址：浙江省湖州市吳興區(qū)杭長橋南路999號PAGEPAGE9羅氏沼蝦雙順反子病毒-1檢測規(guī)程范圍-1-1本標準適用于羅氏沼蝦雙順反子病毒-1的檢測及關(guān)聯(lián)疾病的流行病學(xué)調(diào)查、診斷和監(jiān)測。（GB/T6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求SC/T7103水生動物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范SC/T7202.1節(jié)蝦狀病病斷程 第1分：片微檢法下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1羅氏沼蝦雙順反子病毒-1Macrobrachiumrosenbergiidicistrovirus-1（Macrobrachiumrosenbergiitaihuvirus，MrTV）RNA30nm的二十面體球形顆粒，核酸類型為單股正鏈RNA，長度約10.3kb。其主要侵染羅氏沼蝦幼體甲殼下上皮組織和神經(jīng)節(jié)，造成肝臟和結(jié)締組織出現(xiàn)強嗜堿性細胞質(zhì)包涵體?？s略語下列縮略語適用于本文件。bp：堿基對（Basepair）DEPC：焦乙酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate）DNA：脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）dATP（Deoxyadenosinetriphosphate）dCTP（Deoxycytidinetriphosphate）dGTP（Deoxyguanosinetriphosphate）dNTP（Deoxyribonucleosidetriphosphate）dTTP：脫氧胸苷三磷酸（Deoxythymidinetriphosphate）EB：溴化乙啶，核酸染色劑（Ethidiumbromide）MrDV-1-1（Macrobrachiumrosenbergiidicistrovirus-1）MrTV（Macrobrachiumrosenbergiitaihuvirus）M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒（Moloneymurineleukemiavirus）RdRp：RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase）RNA：核糖核酸（Ribonucleicacid）RNasin：核糖核酸酶抑制劑（RNaseinhibitor）RT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)（Reversetranscriptionpolymerasechainreaction）Taq：水生噬熱桿菌（Thermusaquaticus）115RT-PCR3。圖1羅氏沼蝦雙順反子病毒-1檢測程序流程圖GB/T6682-2008RT-PCRRNAdNTPsdATP、dTTPdGTP、dCTP10mmol/L20RNA40U/L，－20M-MLV200U/L，－205×M-MLV2010×PCR－20TaqDNA5U/L，－20DNADNAMarkerDL2000，－20RT-PCRMrTV572F1：5’-ATGTA-GAGCG-TGGAG-GAGTA-AAA-3’，MrTV572R1：5’-CACTA-TCTCT-GTCTT-CGAGG-GATT-3’，擴增RdRp基因的572bp片段。RT-PCRMrTV472F2：5’-TGCTT-CTATT-TCGGC-TCG-3’，MrTV472R2：5’-CAACG-AATTA-GGGAG-AGG-3’，擴增RdRp基因的472bp片段。陽性對照為已知受MrTVRT-PCR80℃保存。MrTVRT-PCR80℃保存。RNA860℃～40≥15000/PCR樣品采集的要求和數(shù)量按SC/T7103和SC/T7202.1的規(guī)定。鮮活幼體、仔蝦及體長在3cm以下稚蝦個體樣品約30mg～50mg(去掉稚蝦眼)；成蝦取約30mg～50mg鰓絲或游泳足。所取樣品分別置于1.5mL無RNA酶微量離心管中，立即進行RNA提取操作或加入1mLTRIzol試劑，充分研磨后，暫時保存于－20℃。RNA1mLTRIzol50.2mL1554℃下，12000轉(zhuǎn)/10RNA0.5mL104℃下，12000轉(zhuǎn)10分201mLRNA70%（RNA70AA.1進行）14℃下，12000轉(zhuǎn)530L～50LRNARNAAA.2RNART-PCR80RNA操作時外源性RNABGB19489也可采用等效商業(yè)化的RNA抽提試劑盒。RT-PCRcDNA對每一份樣品，在一支無RNA酶的0.2mLPCR管中，加入1.5L10M引物MrTV572R1，2.5L無RNA酶水和2L待測樣品RNA模板?；靹蚝螅噪x心，置于70℃，10分鐘，然后立即置于冰中。加入2L5×M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、1LRNasin(40U/L)、0.5L10mmol/LdNTPs、0.5LM-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/L)，42℃保溫1小時，以合成cDNA，然后于80℃中5分鐘后，迅速置于冰中。第一輪PCR擴增RNA0.2mLPCR2.5L10×PCR0.5L10mmol/LdNTPs、0.5L10M引物MrTV572F1、0.5L10M引物MrTV572R1、0.5LTaqDNA(5U/L)、L無RNA2L8.3.125LPCRPCRPCR擴增：953b) 943062307240，35c) 727第二輪PCR擴增對每一份樣品，取一支無RNA酶的0.2mLPCR管，加入5L10×PCR緩沖液、1L10mmol/LdNTPs、L10MMrTV472F2、0.5L10MMrTV472R2、1LTaqDNA(5U/L)、41.0L無RNA1L8.3.250LPCRPCRPCR擴增：953b) 943062307240，35c) 7278.4 用1（1AA.3配制2含0.5g/mLA中A.4200005LPCR1L6（6A中A.5進行DNA5V/cm0.5PCR572bpPCR472bp572bp472bp當(dāng)被檢樣品第一輪PCR572bpPCR472bpC）PCR當(dāng)被檢樣品第一輪PCR572bpPCR472bp或經(jīng)測序確定不是MrDV-1PCR。表1 套式RT-PCR物電果分析實驗結(jié)果結(jié)果判讀及原因分析對應(yīng)原因的問題排除羅氏沼蝦樣品第一輪PCR擴增：陽性對照和陽性樣品在572bpbp處無任何條帶，以無RNA水為模板設(shè)立的空白對照無任何條帶出現(xiàn)。第二輪PCR擴增：陽性對照在bp處會有特定條帶出現(xiàn)；陽性樣品在472bp在472bp處無任何條帶，以無RNA為模板設(shè)立的空白對照無任何條帶出現(xiàn)。1．RT-PCR反應(yīng)正常，結(jié)果有效。陽性對照有條帶，但分子量標準沒有影像。1．分子量標準失效或加樣量太少。1.更換分子量標準或增加其加樣量。條帶。套式RT-PCR反應(yīng)失敗。陽性對照失效。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物成份抑制PCR。檢查逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑，糾正出錯程序。更換陽性對照，重新實驗。稀釋逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或純化cDNA。陰性對照組或空白對照組在第一次PCR擴增后572bp處有特定條帶；第二次PCR擴增后在472bp處有條帶出現(xiàn)。微量移液器污染。試劑污染。環(huán)境污染。操作污染。PCR微量移液器跑電泳。更換試劑。不得從PCR后區(qū)到PCR加強操作隔離。表1 套式RT-PCR產(chǎn)電泳果析續(xù)）實驗結(jié)果結(jié)果判讀及原因分析對應(yīng)原因的問題排除知帶毒樣品無條帶。RNA模板降解或提取RNA失敗。逆轉(zhuǎn)錄或PCR抑制物介入。RNA提取RNA。檢查逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑，重新合成cDNA和PCR。性對照和樣品出現(xiàn)較多雜帶或明顯的彌散區(qū)。未注意低溫操作，使PCR出現(xiàn)非特異性擴增。酶活性變化、dNTPs濃度變化或10×PCR緩沖液濃度變化。反應(yīng)溫度控制異常。做好低溫操作，RT-PCR操作。確認預(yù)混物制備的準確性、試劑質(zhì)10×CRPCR儀溫控。DNA分子量標準。紫外觀察儀有故障。背景發(fā)紅太亮。凝膠太厚。電極顛倒或電泳時間過長。EB分解失效。檢查紫外觀察儀。EB水中30分鐘后再觀察結(jié)果。重新制作瓊脂糖凝膠片。EB)。附 錄 A（規(guī)范性附錄）試劑配制方法無RNA70%乙醇無水醇新瓶) 70mL加入RNA酶水 30mL在無RNA酶的玻璃量筒中配制，混勻，按1.0mL/支分裝于無RNA酶的1.5mL微量離心管中，保存于－20℃待用。無RNA水 1000mLDEPC 1mL3712小時，按50mL/瓶～200mL/RNA15DEPC有毒，應(yīng)避免吸入、吞食和沾著皮膚，操作在通風(fēng)櫥中進行。1×Tris 4.84g冰乙酸 1.142mL0.5mol/LEDTA(pH8.0) 2mL加水容至 1000mL室溫儲存。10mg/mLEB貯存液EB 10mg水 1mL完全溶解后，室溫保存于棕色瓶中。6×蔗糖 40g加水解定至 100mL溴酚藍 0.25g溶解后，4℃儲存。附 錄 B（規(guī)范性附錄）外源性RNA酶污染消除方法在RNA操作過程中，應(yīng)嚴格防止RNA酶污染。外源性的RNA酶污染是指來自于水、玻璃制品、塑料器皿、電泳槽、操作人員和微生物等。可通過DEPC、氯仿、干熱烘烤等方法來消除。本附錄主要介紹外源性RNA酶的消除方法。對DEPCDEPCRNADEPC12121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘。不能用DEPCTrisDEPCRNA0.22m玻璃器皿洗凈后，在180℃烘烤4小時可徹底除去器皿上沾污的RNA酶。不得用任何在180℃下可燃燒、變性或融化的材料包裹器皿。金屬制品也可按玻璃制品的辦法處理。聚丙烯塑料制品可在通風(fēng)櫥內(nèi)用氯仿漂洗，晾干后再經(jīng)高壓蒸汽滅菌，最后烘干。也可在加有0.1%DEPC的水中浸泡12小時，然后經(jīng)高壓蒸汽滅菌，最后烘干?？少徺I無RNA酶的一次性塑料制品，如塑料離心管、PCR管、槍頭等，直接使用。處理RNARNARNA所有接觸RNA的試劑和材料都應(yīng)保持無菌，一旦有微生物污染應(yīng)丟棄。附 錄 C（資料性附錄）羅氏沼蝦雙順反子病毒-1套式RT-PCR檢測產(chǎn)物序列（GeneBank登錄號：NC_018570）4524ATGTAGAGCGTGGAGGAGTAAAAGTAGATATAGTTATTTGCGAATTAGGTGCTTCTATTT4582MrTV572F1 MrTV472F2CGGCTCGTAAGGGTATAGTGTCTTATTTTCCGCGCGTGAATGAGTTGTCTAGTCTTAGTG4642GTTTAATGGCTAACGGTGAGTTAAGAGTATTTACAACAACCAATTTTGGTAAATTCAATT4702TTCTAATTCCCAAAGATTCTTCTGCTATCTTTACTAGGGTTGTGGATCATGTAGAGTCTA4762GATCACCAGAAGGTTCTTCGTATTATATAAGGCAAGGTTTTGAAGCAAAGGGAAATTCTG4822TTCATGGTGATTGTTGTGCTCCCTACATAATGTTT