1、酶的提取與分離純化 （制作人：王眾 黃文輝 王晨） 2021/9/301要點：細胞破碎：提取：沉淀分離：離心分離：過濾與膜分離：層析分離：電泳分離：萃取分離： 結晶 10：濃縮與干燥2021/9/3021 細胞破碎細胞破碎是通過各種過程使細胞外層結構破壞的技術過程。細胞破碎的方法 機械破碎法物理破碎法化學破碎法酶促破碎法 2021/9/303機械破碎法1 搗碎法定義 利用搗碎機的高速旋轉葉片所產生的剪切力將組織細胞破碎的方法。使用范圍 動物內臟 植物葉芽 細菌2 研磨法利用研缽，石磨，細菌磨，球磨等研磨器械所產生的剪切力將組織細胞破碎的方法。必要時加入石英砂等助磨劑。使用范圍 植物和微生物組織

2、細胞的破碎 3 勻漿法 利用勻漿器產生的剪切力將組織細胞破碎的方法。使用范圍 易于分散，顆粒較小，比較柔軟的組織細胞 也可以對搗碎法和研磨法產生的顆粒進行進一步研磨2021/9/304物理破碎法定義：通過溫度，壓力，聲波等物理因素的作用是組織細胞破碎的方法。多用于微生物細胞的破碎1 溫度差破碎法利用溫度的突然變化熱脹冷縮的作用使細胞破碎的方法稱為溫度差破碎法用于脆弱，易于破碎的細胞的革蘭氏陰性菌，酶提取時 溫度不能過高，難于用于工業生產 2 壓力差破變化碎法利用壓力的突然變化，使細胞破碎的方法稱為壓力破碎法。常用的有高壓沖擊法，突然降壓法 及滲透壓變化法滲透壓變化法是滲透壓突然變化引起的細胞破

3、碎的方法，此法特別適用于膜結合蛋白酶細胞間質酶等的提取，但對革蘭氏陽性菌不適合，主要是細胞壁由肽聚糖組成，能承受滲透壓的突然變化。3 超聲波破碎法利用超聲波發生器所發生的聲波或者超聲波的作用，使細胞膜產生空穴（cavitation)而使細胞破碎的方法。簡便，快捷，效果好，特別適合微生物細胞的破碎，對數生長期的細胞進行破碎2021/9/305化學破碎法 定義：通過各種學試劑對細胞膜的作用，使細胞破碎的方法。 常用的化學試劑：甲苯 ，丙酮，丁醇，氯仿等有機溶劑 表面活性劑 ：特里頓（Triton）， 吐溫（Tween) （非離子型） 原理：有機溶劑使細胞膜的磷脂結構破壞，改變細胞膜的通透性，低溫下

4、進行。 表面活性劑與磷脂及至蛋白相互作用，破壞細胞結構。 表面活性劑有離子型和非離子型兩種。離子型對細胞膜的破壞性 效果較好，但會破壞酶的空間結構，故采用非離子型的。2021/9/306酶促破碎法定義：通過細胞自身的酶系或者外加酶制劑 的催化作用，使細胞的外層結構遭到破壞，而達到細胞破碎的方法。 自溶法：自身酶系， 取決于溫度，離子強度。外加酶：革蘭氏陽性菌溶菌酶破壞, 糖苷鍵酵母菌葡聚糖酶 水解 -1，3-葡聚糖霉菌幾丁質酶植物細胞纖維素酶，半纖維素 酶和果膠酶2021/9/307提取定義：在一定的條件下，用適當的溶劑或溶液處理含酶原料，使酶充分溶解到溶劑或溶液的過程，也成為酶的提取。酶的主

5、要提取方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對象鹽溶液0.020.5mol的鹽溶液用于提取在的低濃度鹽溶液中溶解度大的酶酸溶液PH26的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大且穩定性較好的酶堿溶液PH812的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩定性較好的酶有機溶劑可能與水互溶的有機溶劑用于那些與脂質結合牢固或含有較多非極性集團的酶2021/9/308提取方法1鹽溶液提取：大多數蛋白酶都溶于水(P酶），而且在低濃度鹽溶液條件下，酶的溶解度隨著鹽濃度的升高而增大的現象稱為鹽溶。當鹽濃度達到一定的界限后，酶的溶解度隨著濃度的提高而降低的現象稱為鹽析。 核酸類酶（R酶）的提取，一般在細胞破碎后，用0.14mo

6、l/L的氯化鈉溶液提取，得到核糖核蛋白提取液，在進一步與蛋白質等雜質分離酶酸溶液的提取：有些酶在酸性溶液的溶解度大，且穩定性好，宜用酸溶液提取，不能太低，以免使酶失活。胰蛋白酶可用（）的硫酸溶液提取堿溶液提取：適用于在堿溶液溶解度大且穩定性好的酶，例如天冬氨酸酰胺酶在的堿液提取。注意加堿液時要一邊攪拌一邊攪拌加入，以免局部過堿，造成酶失活。有機溶劑提取與脂質牢固結合且含有較多非極性集團的酶，可采用與水混溶的乙醇，丙酮，丁酮等有機溶劑提取，例如琥珀酸脫氫酶，膽堿脂酶，細胞色素氧化酶采用丁醇提取。2021/9/309影響提取的主要因素溫度溫度對酶的提取效果影響明顯，適當提高溫度，可以增加酶的溶解度

7、和分子擴散速度，但溫度過高會引起酶的變性失活。采用有機溶劑時，溫度控制在低溫條件下。室溫下提取的有酵母醇脫氫酶，細菌堿性磷酸酶，胃蛋白酶。溶液的對酶的溶解度和穩定性有顯著影響，不同的酶會帶不同的電荷及其帶的電荷量不同，酶在等電點的溶解度最低，故提高溶解度應該避開等電點，但不能過高過低。提取液的體積增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。過量的提取液會使酶濃度降低，對分離純化不利。所以提取液總量一般為原料體積的體積，最好分幾次提取。在酶的提取過程中，體積小，顆粒的比表面積大，擴散面積大，有利于提高擴散速度，適當的攪拌和適當的延長時間，可使酶更好的溶解出來。注意為了保護酶的穩定性，可加某些保護劑，如

8、與酶作用的底物，輔酶，某些抗氧化劑。2021/9/3010沉淀分離定義：沉淀分離就是改變某些條件或者加入某些物質， 使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其他物質分離的技術過程。沉淀分離方法沉淀分離方法分離原理鹽析沉淀法利用不同的蛋白質在不同濃度的鹽溶液中溶解度不同的特性，通過在酶液中定濃度的中性鹽，使酶或雜質從溶液中析出沉淀，使酶和雜質分離等電點沉淀法利用兩性電解質在等電點的溶解度最低的特點和不同的物質具有不同的等電點的特點，通過調節溶液的，使酶或雜質沉淀析出，從而使酶和雜質分離有機溶劑沉淀法 利用酶在有機溶劑具有不同溶劑的特點，通過加入一定量的有機溶劑，使酶和雜 質分離 2021/9/3

9、011鹽析沉淀法定義:鹽析沉淀法簡稱鹽析，是利用不同的蛋白質在不同的鹽濃度下溶解度不同的特性，通過在酶液中加入一定濃度的中性鹽，使目標酶或雜質從酶液中析出，從而達到使酶與雜質分開的方法。 原理：鹽離子會改變蛋白質表面的電荷，同時改變了水的活度，使分子表面的水化膜發生改變。酶的溶解度和離子強度有確定的定量關系 (S/S0)=-Ks I 式中，s為蛋白質或酶在離子強度為I時的溶解度（g/L）；S0為酶或蛋白質在離子強度為0時（即在純溶劑）的溶解度（g/L）；Ks為鹽析系數；I為離子強度。 上式子中 S=S0 - Ks I=-Ks I 為s0, 主要取決于酶或蛋白質的性質，也和溫度和PH有關，當溫度

10、和PH一定時，為一常數。 Ks為鹽析系數，主要取決于鹽的性質，Ks與離子價數成正比，與離子半徑和溶液的界電常數成反比，與酶或蛋白質的結構液有關。 2021/9/3012鹽析沉淀法離子強度I的計算 I= mi為離子濃度（mol/L）； 為離子價數miZi22021/9/3013 鹽析沉淀法1 在一定的溫度和PH條件下（為常數），通過改變離子強度使不同的酶或蛋白質分離的方法稱為Ks分段鹽析；而在一定鹽濃度和離子強度的條件下（KsI為常數），通過改變溫度和PH，使不同的酶和蛋白質分離的方法，稱為分段鹽析。2 常用的中性鹽有硫酸銨，硫酸鈉，硫酸鉀，硫酸鎂，氯化鈉和磷酸鈉，硫酸銨最常用，因為硫酸銨在水里

11、的溶解度大且溫度系數小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價廉易得。但用硫酸銨，緩沖能力較差，而且銨離子的濃度會干擾蛋白質的測定，所以有時用其他中性鹽鹽析。在硫酸銨鹽析時，常用飽和度表示濃度定義：溶液中加入飽和硫酸銨的體積與混合溶液總體積之比。相關數據可以查文獻。2021/9/3014 等電點沉淀法原理：利用兩性電解質在等電點時溶解度最低和不同的電解質具有不同的等電點的特性，通過調節溶液的PH，使酶或蛋白質沉淀析出，從而使酶和蛋白質分離的方法。由于在等電點時，兩性電解質表面的水化膜依然存在，故實際上酶等大分子蛋白質仍有一定的溶解性，從而使沉淀不完全。在實際中，此法經常與其他方法一起使用，如等電點

12、經常與鹽析沉淀，有機溶劑沉淀，和復合沉淀一起使用。單獨使用時，主要是從粗酶中除去某些等電點相差較大的蛋白質。加酸堿時，一邊攪拌一邊慢慢加進，防止局部過酸過堿一起蛋白質變性。2021/9/3015 有機溶劑沉淀法定義：利用酶和雜質在有機溶劑的溶解度不同的特性，通過加入某種特定的一定量的有機溶劑，使酶或雜質沉淀析出，從而使酶和蛋白質分離的方法。原理：有機溶劑的存在會使溶液的介電常數降低。既增大了溶質的靜電引力，又破壞了溶質周圍分子的水膜。常用的有機溶劑：乙醇，丙酮，異丙醇，甲醇影響因素：用量和PH（最好等電點附近）優缺點：比鹽析的沉淀易于離心或過濾；不含無機鹽，分辨率高，但易引起酶變性失活，所以必

13、須在低溫下操作，沉淀析出后盡快分離，盡量減少有機溶劑對酶活力的影響。2021/9/3016 復合沉淀法定義：在酶液中加入某些物質，使它與酶形成復合物沉淀下來，從而使酶和雜質分離的方法稱為復合沉淀法。常用的復合沉淀劑：單寧，聚乙二醇，聚丙烯酸例： 菠蘿蛋白酶與單寧復合可以制成藥片，用于治療咽喉炎復合物有的可以直接中使用，有的用適當的方法，使酶從復合物中析出進一步純化。2021/9/3017選擇性變性沉淀法定義：選擇一定的條件使雜蛋白變性沉淀，而不影響所需酶的方法。方法：熱處理，改變PH或加入某些金屬離子應用此法必須對與分離的酶以及酶液中的雜蛋白的種類含量及其物理和化學性質有較全面的了解。2021

14、/9/3018 4 離心分離2021/9/3019 離心機的選擇1 常速離心機 常速離心機又稱低速離心機，最大轉速在8000r/min以內，相對離心力（RCF ）在1*104g以下，主要用于細胞，細胞碎片和培養基殘渣的分離，也用于酶的結晶等較大顆粒的分離。2 高速離心機 最大轉速在（12.5）*104r/min,相對離心力達到1*1041*105g,在酶的分離中主要用于沉淀，細胞碎片和細胞器等的分離。由于轉速過高，引起溫度過高引起酶失活，故有的安有冷凍裝置，謂之高速冷凍離心機。3超速離心機 轉速能達到（2.512）*104r/min,相對離心力能達到5*105甚至更高。主要用于DNA，RNA，

15、蛋白質等生物大分子以及細胞，病毒等的分離純化，樣品純度系數的檢測，以及沉降系數和相對分子質量的測定。超速離心機可分為制備用超速離心機，分析用超速離心機和分析制備兩用超速離心機。2021/9/3020離心方法的選用 1 差速離心 采用不同的離心速度和時間，使不同沉降速度的顆粒分批分離的方法。 主要用于大小和密度相差較大的顆粒，操作簡單方便，但分離效果較差，沉淀物中含有較多雜質，沉淀在離心管的底部受到擠壓。2 密度梯度離心 密度梯度離心是樣品在密度梯度介質中，使沉降系數比較接近的物質得以分離的一種區帶分離方法。等密度梯度離心 當欲分離的不同顆粒的密度范圍在介質密度范圍之內，在離心力的作用下，不同浮

16、力密度的顆粒或向下沉降，或向上漂浮，只要時間足夠長，就能移動到與它們各自密度相等的位置（等密度點），形成區帶，這種方法叫做等密度離心或稱平衡等密度離心。2021/9/3021 密度梯度離心 梯度介質的選取 1 有足夠大的溶解度，形成所需的密度梯度 2 不會與樣品中的組分發生反應，也不會引起組分的凝 集，變性和失活 3 常用的密度梯度介質 蔗糖 甘油 蔗糖密度梯度系統應用最多 密度梯度的制備 一般采用密度梯度混合器進行制備。 離心 適當地增加離心速度縮短離心時間，減少擴少散導致的區 帶擴寬現象。2021/9/3022 等密度梯度離心密度梯度離心，由于受到密度介質的影響，故分離的顆粒并未達到其等密

17、度位置。而等密度分離欲要求欲分離的顆粒處于密度梯度的等密度點。為此兩種密度梯度離心所使用的密度介質和密度梯度范圍應有所不同。常用的離心介質 氯化銫 硫酸銫 溴化銫 三碘苯的衍生物 過程 1 密度介質和樣品結合 2 離心 注意： 銫鹽對鋁合金轉子具有極強的腐蝕作用，防止銫鹽溶液濺到轉子上，用完后將轉子仔細清洗和干燥。最好用鈦合金的。2021/9/3023 離心條件的確定離心條件離心力離心時間溫度和PH2021/9/3024離心力低速離心一般用轉速，即轉子每分鐘的轉數表示，如5000r/min.而在高速特別是超速離心時，往往以相對離心力（RCF）表示，如5000g.相對離心力是顆粒所受到的離心力與

18、地心的引力的比值。 式中，RCF為相對離心力（g); FC為離心力；F g為地心引力;n為轉子 每分鐘的轉數（r/min) ;r為旋轉半徑（cm). 一般離心力的數值是平均數值，即在離心溶液中點處顆粒所受的離心力。 2021/9/3025 離心時間對于低速和高速離心機和差速離心來說，離心時間是指顆粒從離心管樣品液的液面完全沉降到離心官底的時間，稱為沉降時間或澄清時間。對于密度梯度離心而言，離心時間是指形成界限分明的區帶時間，稱為區帶形成時間。等密度梯度離心，是指顆粒完全達到等密度點的平衡時間，稱為平衡時間。其中最常用的是沉降時間。2021/9/3026 沉降時間 沉降時間決定于顆粒的沉降速度和

19、沉降距離。 t表示沉降時間（s) ;s表示顆粒的沉降系數; w表示轉子的角速度（r ad /s); r1,，r2分別表示旋轉軸中心到樣品液液面和離心管底的距離(cm)上式子做如下變換 k稱為轉子因子2021/9/3027溫度和PH離心溫度一般控制在4左右，對于某些耐熱性較好的酶，也可以在室溫下進行離心分離。但在超速離心和高速離心時，由于轉子高速旋轉會發熱而引起溫度升高，必須采用冷凍裝置，使溫度維持在一定范圍內。離心介質的PH必須處于酶穩定的PH范圍內，必要時可采用緩沖溶液，過高過低可能引起酶的變性失活，還可能引起轉子和離心機其他部件的腐蝕，應當加以注意。2021/9/30285 過濾和膜分離過

20、濾是借助過濾介質將不同大小，不同形狀的物質分離的技術過程。過濾介質不同分為膜過濾和非膜過濾兩大類。根據過濾介質截留的物質顆粒大小不同，過濾可分為粗濾，微濾，超濾和反滲透2021/9/3029過濾的分類及其特性 類別 截留顆粒的大小 截留的主要物質 過濾介質 粗濾 2m 酵母，霉菌，動植物 濾紙 濾布 纖維多孔陶瓷 細胞 固形物 燒結金屬微濾 0.22m 細菌 灰塵等 微濾膜 微孔陶瓷等超濾 200.2m 病毒 生物大分子等 超濾膜反滲透 20 生物小分子，鹽，離子 反滲透膜2021/9/3030非膜過濾定義：采用高分子膜以外的材料，如濾紙，濾布，多孔陶瓷，纖維，燒結金屬等作為過濾介質的分離技術

21、稱為非膜過濾，包括粗濾和部分微濾 粗濾：借助于過濾介質截留懸浮液中直徑大于2m的顆粒，使固形物和液體分離的技術。粗濾應用范圍： 酵母 霉菌 動植物細胞 培養基殘渣 大 顆粒固形物粗濾介質 ： 濾紙 濾布 纖維 多孔陶瓷 燒結金屬助濾劑 ： 硅藻土 活性炭 紙粕推動力 ： 常壓過濾 加壓過濾 減壓過濾2021/9/3031粗濾常壓過濾 以液位差為推動力的過濾方法 過濾設備簡單，操作易行方便，但過濾速度慢分離效果差加壓過濾 以壓力泵或壓縮空氣產生的壓力為推動力的過濾方法。 設備簡單，過濾較快，過濾效果好減壓過濾 又稱真空過濾或抽濾，是通過在過濾介質的下方抽真空，增加過濾介質上下方之間的壓力差，推動

22、液體通過過濾介質，而把大顆粒截留的過濾方法。 2021/9/3032微濾定義：又稱微孔過濾。微濾所截留的顆粒直徑在0.22m。無菌水，汽水等飲料的生產中廣泛應用。一般采用微孔陶瓷，燒結金屬等作為過濾介質，也可用微濾膜。2021/9/3033 膜分離技術借助一定的孔徑的高分子薄膜，將不同大小不同形狀和不同特性的物質顆粒或分子進行分離的技術稱為膜分離技術。常用膜 丙烯腈 醋酸纖維素 賽璐玢 尼龍 動物膜 硝酸纖維素膜實例：核糖體結合來確定遺傳密碼（硝酸纖維素的應用）膜分離技術包括（薄膜的原理和推動力） 1加壓膜分離 2電場膜分離 3擴散膜分離 2021/9/3034 加壓膜分離加壓膜分離 定義：以

23、薄膜兩邊的流體靜壓差為推動力的膜分離 技術。分類(以截留顆粒大小） 1微濾 2超濾 3反滲透2021/9/3035膜分離技術1微濾 定義:以微濾膜作為過濾介質的膜分離 技術。 截留顆粒在0.22m,操作壓力在0.1Mpa以下。例如：無菌水除菌，酶液除微生物細胞2超濾 定義：借助于超濾膜將不同大小的物質顆粒或分子分離的方法。 截留顆粒直徑在202000，用于分離病毒和各種大分子。 操作壓力：0.10.7Mpa 壓力對超濾流率影響效果較復雜，視具體情況而定。 注意：超濾濃度不要太高。 超濾不僅用于酶的分離純化，還用于酶液的濃縮，特別適用于液體酶制劑的生產。3反滲透 反滲透的孔徑小于20，操作壓力在

24、0.713Mpa，分離各種離子和小分子物質，在無離子水和海水淡化有廣泛的應用。 2021/9/3036 電場膜分離定義：電場膜分離是在半透膜兩側分別裝上正負極，在電場的作用下，帶電的小分子或者離子向與它們所帶電荷相反的方向移動，透過半透膜達到分離的目的。電滲析和擴散 膜分離 電滲析主要用于酶液或其他溶液的脫鹽，海水淡化，純水制備 以及其他帶電荷小分子的分離。用于凝膠電泳后含有的蛋白質或核酸的凝膠帶電荷大分子的分離。 離子交換膜點滲析 與電滲析一樣，只是用離子交換膜代替半透膜。2021/9/3037 擴散膜分離定義：利用小分子的擴散作用，不斷使小分子透過半透膜擴散到膜外，而大分子被截留，從而達到

25、分離的效果。材料 動物膜 羊皮紙 火棉膠 賽璐玢2021/9/30386 層析分離層析分離 定義：利用混合液中各組分的物化性質（分子大小和形狀，分子極性，吸附力，分子親和力，分配系數等）的不同，使各組分以不同的比例分布在兩相中。其中一個相是固定相，另一個相是流動相。當流動相流經固定相時，不同的組分在流動相中以不同的速度流動，從而達到不同組分的分離純化。2021/9/3039層析分離方法層析方法 分離原理吸附層析利用吸附劑對不同的物質吸附能力不同而使混合物各組分分離分配層析利用不同的物質在兩相的分配系數不同而使各組分分離離子交換層析利用離子交換劑上的可解離集團（活性集團）對各種離子的親和力不同而

26、達到分離目的凝膠層析以多孔凝膠為固定相，利用流動相中各組分的相對分子質量不同而達到分離的目的親和層析利用生物分子與配基專一而又可逆的親和力力，使生物分子分離純化層析聚焦將酶等兩性物質的等電點的特性與離子交換層析的特性結合在一起，實現組分分離2021/9/3040吸附層析 定義：利用吸附劑對不同物質的吸附力不同而使混合物中各組分分離的層析方法。2021/9/3041原理： 吸附劑和被吸附劑之間是范德華力。特點是可逆的，一定條件下，被吸附物被吸 附到吸附劑表面，另外條件下，被吸附物可離開吸附劑表面，稱為解吸。 吸附劑： 固體吸附劑（常用）和液體吸附劑 裝置： 柱形裝置洗脫方法: 1：溶劑洗脫法 2

27、：置換洗脫法 3：前緣洗脫法 2021/9/3042洗脫方法的曲線及優缺點1溶劑洗脫法 從圖可看出，兩組分有一段“空白”， 即只有不含組分的純溶劑，各組分能很好的分離。當兩組分的吸附力相差不大時，產生“拖尾”現象，采用梯度洗脫法。 物質濃度洗脫液體積2021/9/3043置換洗脫法定義：用吸附力比被吸附組分更強的洗脫物質來洗脫 樣品組分。 從圖可看到，置換洗脫可使每個組分分離，每一個階梯只有一個組分，并可以求出各組分的濃度。然而各組分一個接一個，界限不分明，交界處互相混雜，分離效果并不理想。物質濃度洗脫液體積AB 2021/9/3044前緣洗脫法 定義：是連續向吸附層析柱內加入欲分離的混合溶液

28、，即所使用的洗脫液為含有各組分的混合溶液本身。 從圖可看出只有吸附力最弱的A組分，得以和其他組分分離，故作前緣洗脫法。物質濃度洗脫液體積AA+BA+B+C2021/9/3045吸附劑和洗脫劑的選擇吸附劑的選擇吸附劑有無機吸附劑和有機吸附劑由化學性質不活潑的多孔材料制成，比表面積大常用吸附劑通常用于酶分離純化的有：硅藻土，氧化鋁（活化處理），磷酸鈣，活性炭等洗脫劑的選擇注意事項 1洗脫劑不會與吸附劑發生化學反應，也不會使吸附劑溶解。 2洗脫劑對混合液中各組分的溶解度大，黏度小，流動性好，容易與被洗脫的組分分離 3有一定的純度，以免雜質對分離的不利影響 常用洗脫劑：石油醚，四氯化碳等2021/9/

29、3046分配層析定義：利用各組分在兩相的分配系數不同從而達到各組分分離的層析方法。分配系數：一種溶質在互不相容的溶劑中溶解達到平衡時，該溶質在兩項溶劑中濃度的比值。 溶質在流動相的帶動下流經固定相時的分配系數2021/9/3047 分配層析的方法分配層析紙上層析分配薄層層析分配氣相層析2021/9/3048紙上層析和薄層分析紙上層析 定義：以濾紙纖維結合水為固定相，以與水互不相溶或者部分混溶的有機溶劑為流動相。展開時，樣品各組分在兩相之間不斷地進行分配，由于各組分的分配系數不同，所以移動速率不同，從而達到分離。薄層層析 定義:將固定相支持物均勻地鋪在支持板（一般用玻璃板）上，形成薄層，把樣品點

30、到薄層上，用適宜的溶劑展開，利用各組分的移動距離不同，而使個組分分離。2021/9/3049離子交換層析定義：離子交換層析是利用離子交換劑上得可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達到分離的目的。離子交換劑：離子交換劑是含有若干可解離基團的高分子物質。活性基團的性質不同：陽離子交換劑和陰離子交換劑2021/9/3050離子交換劑的選擇和處理母體：苯乙烯樹脂，酚醛樹脂，纖維素，葡聚糖，瓊 脂糖等引入基團： 酸性基團：磺酸基（-SO3H),磷酸基（-PO3H2） 堿性基團：季胺（-N（CH3）3），叔胺（- N（CH3）2） 以陽離子交換劑為例： 分配系數： 平衡常數K是離子交換劑上活性基

31、團與組分離子之間親和力大小的指標。平衡常數K的值越大，離子交換劑的活性基團對某組分離子的親和力越大 K值的大小決定組分離子在離子交換柱內的保留時間。2021/9/3051離子交換劑的選擇與處理選擇考慮的因素1組分離子和離子交換劑的物理化學性質2組分離子所帶電荷的種類3溶液中組分離子的高低4組分離子的質量大小5組分離子和離子交換劑的親和力大小處理1水浸泡2無離子水進行洗滌澄清3用酸浸泡，無離子洗滌至中性4用堿浸泡，無離子水洗滌至中性5轉型處理2021/9/3052離子交換層析的操作過程 1裝柱 干法裝柱和濕法裝柱子 2上柱 將欲分離的混合液加入到離子交換柱中 3洗脫和收集 4再生2021/9/3

32、053凝膠層析原理：組分在多孔凝膠進行垂直向下的移動和無定向的分子擴散運動（布朗運動）。大分子只能進入凝膠顆粒的間隙，小分子同時能進入凝膠微孔，故大分子移動的比小分子快 ，從而達到分離的目的。凝膠層析又稱凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層析等，以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相所含各種組分的相對分子量不同而達到物質分離的一種層析技術。2021/9/3054分配系數表示洗脫體積，表示某一組分從加入層析柱到出現最高峰所需要的洗脫體積。是外體積，即為層析柱內凝膠顆粒間隙的體積。為內體積，層析柱內凝膠顆粒內部微孔的體積。1 如果組分的分配系數ka為0，即 ,說明組分完全不能進入凝膠微孔，洗脫時最先流出。

33、2如果組分的分配系數ka=1,即是 ，說明該組分可自由擴散進入凝膠顆粒的所有微孔中，洗脫時最后流出。3如果組分的分配系數在01，說明該組分分子大小介于小分子和大分子之間，可以進入凝膠微孔，但擴散速度較慢，洗脫時按照ka值由小到大的順序先后排出。2021/9/3055凝膠的選擇與處理凝膠材料1葡聚糖凝膠：廣泛用于各種物質的分離2瓊脂凝膠和瓊脂糖凝膠：適用于分子質量較大的蛋白質和多糖的分離純化3聚丙烯酰胺：惰性凝膠，適合酶,蛋白質，核酸的分離純化，但不能遇強酸交聯劑：環氧氯丙烷等2021/9/3056凝膠層析操作過程凝膠層析裝柱上柱洗脫2021/9/3057親和層析定義：利用生物分子與配基之間所具

34、有的可逆親和力，使生物分子分離純化的層析方法優缺點 優點：選擇性很高，通過一次純化分離步驟得 到很高的產品 缺點：價格昂貴，處理量不大，一般在純化的 后期使用 影響因素 溫度 PH 2021/9/3058親和層析母體和配基礎配基在親和層析中，作為固定相的一方是配基，配基必須偶聯于不溶性母體上。母體一般采用瓊脂糖凝膠，葡聚糖凝膠，聚丙烯酰胺 凝膠。配基和偶聯必須對母體進行活化、。溴化氰法，疊氮法。酶的親和層析一般用瓊脂糖作為母體，選用適宜的配基制成親和層析劑。2021/9/3059親和層析方法親和層析分子對親和層析免疫親和層析共價親和層析疏水親和層析金屬離子親和層析染料親和層析凝集素親和層析20

35、21/9/3060分子對親和層析 定義：利用生物分子對之間專一而又可逆的性質使生物分子分離純化的方法。 酶與底物，酶與競爭性抑制劑，酶與輔助因子，抗原與抗體等，故分子對親和層析在酶的分離純化中有重要的應用。 在親和層析中控制好溫度，PH等2021/9/3061免疫親和層析定義:利用抗原與抗體之間專一而又可逆的親和力使抗體或者抗原分離純化的一種親和層析方法。免疫親和層析廣泛應用于藥物的分離純化，例如工業制取組織纖溶酶原激活劑。2021/9/3062 共價親和層析定義:生物分子的功能性基團與層析劑上的配基形成可逆性的共價鍵的一種分離純化方法。共價親和層析可用于純化牛乳巰基氧化酶，從大腸桿菌分離純化

36、青霉素酰化酶等。2021/9/3063 疏水層析定義：生物分子上的功能性基團與層析劑配基配基形成可逆性疏水鍵結合的一種親和層系方法。酶蛋白中常含有疏水性較強的氨基酸:如亮氨酸，纈氨酸和苯丙氨酸。采用氨基烷和溴化氰活化的瓊脂糖進行反應，形成改性瓊脂糖。酶可以和改性瓊脂糖的烷基發生疏水結合反應，從而得以分離。2021/9/3064 金屬離子親和層析定義:利用生物分子的功能性基團和層析劑上得金屬離子形成可逆性結合的一種分離方法。 蛋白酶類和其他蛋白質表面的一些氨基酸殘基如組氨酸的咪唑基團，半胱氨酸的巰基，色氨酸的吲哚基團，可與金屬離子親和結合。用螯合劑將金屬離子（cu+2,zn+2,co+2等）螯合

37、到母體（如交聯化的瓊脂糖，葡聚糖)的表面制成離子親合劑。 洗脫方法：改變鹽的濃度或PH，降低金屬離子和蛋白質之間的親和常數。 或用競爭性試劑如咪唑，組氨酸，色氨酸，半胱氨酸將蛋白質置換下來。 洗脫時，可采用分級洗脫和梯度洗脫方式。 優點:可用不同的金屬螯合到母體上，可用更強的螯合劑將金屬離子洗脫，實現母體的再生。大多數情況下，洗脫下的酶仍然保持生物活性。 2021/9/3065 染料親和層析定義:利用生物分子的功能性基團和層析劑上染料配基形成的可逆性結合的一種層析方法。已經成功用于以NAD+,NADPH+,ATP為輔酶的多種酶的分離純化。2021/9/3066 凝集素親和層析定義：生物分子的功

38、能性基團和層析劑上得凝集素形成可逆性結合的層析方法。 用于各種糖蛋白的分離純化。2021/9/3067層析聚焦定義:將酶的兩性等電點和離子的交換層析的特性結合在一起，實現組分分離的層析技術。1離子交換劑和緩沖液體系 （1）多緩沖離子交換劑 （2）多緩沖溶液2PH梯度的形成3層析聚焦的操作過程2021/9/3068層析聚焦的操作過程（1）多緩沖離子交換劑和多緩沖溶液的選擇 （2）形成PH梯度 （3）上柱聚焦 （4）洗脫 （5）再生2021/9/3069電泳分離 定義：帶電粒子向著與自身電荷相反的電極移動的現象叫電泳。 在酶學研究中，電泳技術主要用于酶的純度鑒定，酶分子質量的測定，酶的等電點的測定以及少量酶的分離純化。2021/9/3070電泳的分類和影響因素電泳按支持物體不同分為：1紙電泳2薄層電泳3薄膜電泳4凝膠電泳5自由電泳6等電聚焦電泳影響因素1電場強度2溶液的PH3溶液的離子強度4電滲5緩沖液的黏度和溫度2021/9/3071 紙電泳紙電泳是以紙為支持物的電泳技術。操作過程：1：支持物的選擇，一般采用層析濾紙為支持物。2：選擇一定的PH和一定強度的緩沖液3：點樣,量要適當4：電泳2021/9/3072薄層電泳薄層電泳:是將支持體與緩沖液調制成適當厚度的薄層而進行