1、關于免疫學技術概論第1頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四目的與要求 1、了解最新的免疫學診斷技術以及細胞免疫技術的種類與用途； 2、掌握常用的免疫血清學技術及其實驗原理、影響因素； 3、掌握生物技術公司常用的免疫制備技術； 4、了解免疫學技術的應用及其發展趨向。難點與重點 重點：常用的免疫血清學技術及其實驗原理、影響因素；生物技術公司常用的免疫制備技術。 難點：常用的免疫血清學技術及其實驗原理、影響因素。第2頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四 免疫學技術是指利用免疫反應的特異性原理，建立各種檢測與分析技術以及建立這些技術的各種制備方法，包括：用于抗原

2、或抗體檢測的體外免疫反應技術，或稱免疫檢測技術，這類技術一般都需要血清進行試驗，故又稱為免疫血清學反應或免疫血清學技術；用于研究機體細胞免疫功能與狀態的細胞免疫技術；用于建立免疫檢測方法的免疫制備技術，如抗體或抗原的純化技術、抗體的標記技術。第3頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四E-玫瑰花環實驗正常人外周血中T細胞在體外能直接和綿羊紅細胞(SRBC)結合形成玫瑰花樣細胞團。這是因為人的T細胞膜上具有能和SRBC膜上的糖蛋白相結合的受體，稱為E受體。已證實E受體是人T細胞所特有的表面標志，因此本試驗可作為人外周血T細胞的鑒定和計數，同時作為人細胞免疫功能狀態的一個檢測指標，

3、也是分離T細胞的常用方法之一。免疫標記技術第4頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四第1節 免疫血清學技術概述 抗原與相應抗體在體內和體外均能發生特異性結合反應，因抗體主要來自血清，因此在體外進行的抗原抗體反應稱為血清學反應或免疫血清學技術，是建立在抗原抗體特異性反應基礎上的檢測技術。 免疫血清學技術自19世紀建立了最早和最簡單的凝集試驗開始，不斷發展，尤其是近20余年來，各種新方法、新技術層出不窮，應用面也日益擴大，已深入到生物學科的各個研究領域。第5頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四 免疫血清學技術按抗原抗體反應性質不同可分為凝聚性反應(包括凝集試驗

4、和沉淀試驗)、標記抗體技術(包括熒光抗體、酶標抗體、放射性同位素標記抗體、化學發光標記抗體技術等)、有補體參與的反應(補體結合試驗、免疫黏附血凝試驗等)、中和反應(病毒中和試驗等)等已普遍應用的技術，以及免疫復合物散射反應(激光散射免疫測定)、電免疫反應(免疫傳感器技術)、免疫轉印(western b1otting)以及建立在抗原抗體反應基礎上的免疫蛋白芯片技術等新技術。一、免疫血清學技術的類型第6頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四凝集試驗（血球凝集）凝集試驗（細菌凝集）補體結合試驗抗原-抗體反應模式圖第7頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四凝集反應沉

5、淀反應對流免疫電泳火箭免疫電泳第8頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四二、免疫血清學反應的一般特點(一)特異性與交叉性 血清學反應具有高度特異性。這是血清學試驗用于分析各種抗原和進行疾病診斷的基礎。一般血緣越近，交叉反應的程度也越高。除相互交叉反應外，也有表現為單向交叉的，單向交叉在選擇疫苗用菌(毒)株時有重要意義。天花 牛痘第9頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四(二)抗原與抗體結合機理 抗原和抗體的結合為弱能量的非共價鍵結合，其結合力決定于抗體的抗原結合位點與抗原表位之間形成的非共價鍵的數量、性質和距離，由此可分為高親和力、中親和力和低親和力抗體。

6、第10頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四(二)抗原與抗體結合機理 抗原與抗體的結合是分子表面的結合，這一過程受物理、化學、熱力學的法則所制約，結合的溫度應在040，pH在49。如溫度超過60或pH降到3以下時，則抗原抗體復合物又可重新解離。利用抗原抗體既能特異性地結合，又能在一定條件下重新分離這一特性，可進行免疫親和層析，以制備免疫純的抗原或抗體。第11頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四 抗原與抗體在適宜的條件下就能發生結合反應。但對于常規的血清學反應，如凝集反應、沉淀反應、補體結合反應等，只有在抗原與抗體呈適當比例時，結合反應才出現凝集、沉淀等可見

7、反應結果，在最適比例時，反應最明顯。這種因抗原過多或抗體過多而出現抑制可見反應的現象，稱為帶(zone)現象。 (二)抗原與抗體結合機理 第12頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四 為了克服帶現象，在進行血清學反應時，需將抗原和抗體作適當稀釋，通常是固定一種成分而稀釋另一種成分。為了選擇抗原和抗體的最適用量，也可同時遞進稀釋抗原和抗體，用綜合變量法進行方陣測定。(二)抗原與抗體結合機理 第13頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四第14頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四(三)免疫血清學反應的影響因素 影響免疫血清學反應的因素主要有電解

8、質、溫度、pH值等。1、電解質 特異性的抗原和抗體具有對應的極性基(羧基、氨基等)，它們互相吸附后，其電荷和極性被中和因而失去親水性，變為憎水系統。此時易受電解質的作用失去電荷而互相凝聚、發生凝集或沉淀反應。因此，需在適當濃度的電解質參與下，才出現可見反應。故血清學反應一般用生理鹽水作稀釋液，標記抗體技術中，用磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)作稀釋液。第15頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四2、溫度 在一定溫度下，將抗原抗體保溫一定時間，可促使兩個階段的反應。較高的溫度可以增加抗原和抗體接觸的機會，從而加速反應的出現。將抗原、抗體反應通常在37(培養箱或水浴)，也可在室溫下進

9、行；亦可用56水浴反應更快。有的抗原或抗體系統在低溫長時間結合反應更充分，如有的補體結合反應在冰箱低溫結合效果更好。(三)免疫血清學反應的影響因素 影響免疫血清學反應的因素主要有電解質、溫度、pH值等。第16頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四3、酸堿度 血清學反應常用pH為68，過高或過低的pH值可使抗原抗體復合物重新離解。如pH值降至抗原或抗體的等電點時，可引起非特異性的酸凝集，造成假象，出現假陽性。(三)免疫血清學反應的影響因素 影響免疫血清學反應的因素主要有電解質、溫度、pH值等。第17頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四第2節 細胞免疫技術的種

10、類與用途 細胞免疫技術是指與細胞免疫有關的各種檢測技術，包括對其免疫細胞、細胞因子的檢測及功能分析。由于人們越來越認識到細胞免疫在腫瘤、胞內菌感染、病毒感染等疾病免疫中的重要性，使近幾年來細胞免疫技術在醫學和獸醫學研究與臨床中應用越來越廣。 第18頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四第19頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四第2節 細胞免疫技術的種類與用途 根據被檢測的物質性質不同，可將細胞免疫技術分為淋巴細胞計數及分類技術、淋巴細胞功能測定技術和細胞因子檢測技術以及體內細胞免疫試驗等4大類。CIK是(cytokine induced killer)的縮

11、寫，最初是指在正常人體外周血中只占15%的cd3+cd56+的T淋巴細胞目前國內外制備的用于過繼免疫治療的cik細胞，實際上是體外擴增出的以cd3+cd56+cd3+cd8+為主的異質性細胞群。該細胞群是在多種細胞因子如IL-2IFN-及某些單克隆抗體(anti-cd3mcab)的刺激下，由從外周血骨髓或臍血中分離出來的單個核細胞在體外培養擴增而成，具有廣泛的非MHC限制的極強的溶瘤活性 第20頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四第2節 細胞免疫技術的種類與用途 根據被檢測的物質性質不同，可將細胞免疫技術分為淋巴細胞計數及分類技術、淋巴細胞功能測定技術和細胞因子檢測技術以及

12、體內細胞免疫試驗等4大類。生物治療技術是一種“自身免疫細胞療法”，它用“人體自身的免疫細胞殺死自己體內的腫瘤細胞”的原理來治療腫瘤，是最具優勢、最有前景的腫瘤治療技術之一。通過提取患者自身外周血中的單個核細胞，在GMP超潔凈實驗室中進行誘導，激活和數量擴增成樹突狀細胞（DC）和細胞因子誘導的殺傷細胞（CIK），然后再回輸給病人。這兩種細胞對腫瘤細胞有特異性識別作用，能夠廣泛識別各種腫瘤細胞。當DC與CIK細胞聯合作用將殘留惡性腫瘤細胞完全殺滅或降低并穩定在一定水平時，即可達到腫瘤的臨床治療或控制腫瘤的復發和轉移。第21頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四 該技術有效修復、增

13、強了人體的免疫系統，減少了腫瘤細胞轉移的幾率，無痛苦，無副作用，對于手術結束后或放療緩解期患者尤為適合。對于部分乙肝患者也可采用該方法治療 生物免疫治療大致分為五個主要步驟，首先是前期檢查，第二是采集外周血中的單個核細胞，第三步就是細胞在實驗室的激活、誘導與質控，第四步是回輸 第22頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四CIK細胞的特點1、增殖能力強，主要效用細胞CD3+CD56+ 可增殖1000倍；2、殺傷活力強，遠優于傳統的LAK細胞和細胞因子干擾素、白細胞介素2等；3、殺瘤譜廣，不受MHC限制，具有廣譜殺腫瘤和病毒的作用，對多重耐藥腫瘤細胞仍敏感，殺瘤活性不受環孢素A（

14、CsA）和FK506等免疫抑制劑的影響，能抵抗腫瘤細胞引發的效應細胞Fas-FasL凋亡。4、毒副作用小，無嚴重不良反應。不過長度超過30bp的dsRNA會由于干擾素應答引發非特異性基因抑制。第23頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四CIK細胞治療技術的優勢1、可有清除手術、放化療 后殘余的癌細胞及微小病灶，預防腫瘤的復發和轉移；2、可與放、化療聯合使用，能降低放化療的毒副作用的感染率，提高放化療的療效；3、可用于放、化療無效的患者，或對化療藥物產生耐藥性的患者的治療；第24頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四CIK細胞治療技術的優勢4、對于失去手術機會

15、或已復發轉移的晚期腫瘤患者，能迅速緩解其臨床癥狀，延長生存期；大部分患者出現瘤體減小甚至消失或長期帶瘤生存的治療效果；5、由于CIK細胞具有免疫調節和體細胞修復作用，在治療腫瘤的同時，大部分患者尤其是放化療后的患者，可出現消化道癥狀減輕或消失，皮膚有光澤，黑斑淡化，靜脈曲張消失，脫發停止甚至頭發生長或白發變黑等“年輕化”表現，及精神狀態或體力明顯恢復等現象，從而提高腫瘤患者的生存質量，延長生存期。 第25頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四第26頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四第27頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四第28頁，共

16、50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四第29頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四第30頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四第31頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四激光共聚焦顯微鏡第32頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四第33頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四第34頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四第35頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四 細胞免疫技術的特點：（1）方法復雜，根據不同檢測對象需采用不同的方法，這也是細胞免疫技術發展不快的

17、原因；（2）目前逐漸發展用血清學方法檢測細胞免疫，如用單克隆抗體檢測CD抗原進行T細胞亞群分析，血清學反應測定白細胞介素和干擾素等，即細胞免疫技術與血清學技術融為一體。 第36頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四 細胞免疫技術的特點： 此外，近年來各種先進的檢測儀器應用于細胞免疫技術，如流式細胞儀(flowcytometer)、激光共聚焦顯微鏡等，使免疫細胞表面分子的檢測、定位及其功能的研究有了較大的發展。第37頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四第3節 免疫制備技術的種類 免疫制備技術是指制備與免疫檢測有關制劑的各種技術，包括抗原制備、抗體制備、抗體純

18、化及抗體標記等技術。第38頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四第4節 免疫學技術的應用一、動物疫病診斷 用免疫血清學方法對動物傳染病、寄生蟲病等進行診斷，是免疫學技術最突出的應用。應用免疫血清學技術可以檢測病原微生物抗原或抗體，其中酶標抗體技術，已成為動物多種傳染病的常規診斷方法，其簡便、快速，又具有高度的敏感性、特異性和可重復性，已有許多商品化的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)診斷試劑盒。第39頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四二、動植物生理活動研究 動物、植物體中存在一些活性物質，如激素、維生素等，它們在體內含量極微少，但在調節機體的生理活動中起重要

19、作用，因此可通過分析測定這些生物活性物質的含量及變化來研究機體的各種生理功能(如生長、生殖等)。由于這些物質含量極低，用常規檢測方法不能準確測出。第40頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四二、動植物生理活動研究 目前放射免疫測定和酶免疫技術已能精確測出ng(10-9g)及pg(10-12g)級水平的物質，它們已成為測定動物、植物、以及昆蟲體內微量激素及其他活性物質、植物生理和生物防治的重要技術手段。第41頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四三、物種及微生物鑒定 各種生物之間的差異都可表現在抗原性的不同，物種種源越遠，抗原性差異越大，因此可用區分抗原性的血

20、清學反應進行物種鑒定與物種的分類等工作。血清學反應在細菌、病毒等微生物鑒定和血清型及亞型的分析方面已得到廣泛應用。但在動物種源、植物和昆蟲分類方面還是一個新領域。第42頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四四、動植物性狀的免疫標記 通過分析動物、植物一些優良性狀(如高產、優質、抗逆性等)的特異性抗原，然后用血清學方法進行標記選擇育種，是一個很有前途的方向，它比分子遺傳標記選擇育種簡便。第43頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四五、生物制品研究 生物制品(如疫苗、診斷制品、免疫增強劑等)的研究與開發，免疫學技術是必不可少的支撐技術。疫苗研究中需用血清學技術和

21、細胞免疫技術作為免疫效力的評價手段。在研究一些免疫增強藥物，尤其研究抗腫瘤藥物時，需用細胞免疫技術分析測定它們對機體細胞免疫功能的增強作用。第44頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四六、動物疫病致病機理研究 動物傳染病的病原從機體特定部位感染，并在特定組織細胞內增殖，引起致病。采用免疫熒光抗體染色或免疫酶組化染色技術，可在細胞水平上確定病毒等病原微生物的感染細胞，還可用免疫電鏡技術等，在亞細胞水平上進行抗原的定位。免疫學技術還可用于研究自身免疫病和變態反應性疾病的發病機理。第45頁，共50頁，2022年，5月20日，9點46分，星期四七、分子生物學研究 在基因工程研究中，目的基因的分離、表達產物的特異性檢測與定量分析，以及表達