1、流式細胞術在臨床上的應用深圳市人民醫院臨床醫學研究中心 李富榮流式細胞術的臨床應用1流式細胞術在臨床上的應用深圳市人民醫院臨床醫學研究中心流式細 第一部分 流式細胞儀（FCM)）工作原理流式細胞術的臨床應用2 FCM系統結構流體系統：樣本流、鞘液光學系統：激光光源、分光鏡、濾片、 散射光和熒光探測器分選系統：壓電晶體、液流成滴、加電 系統、偏轉系統數據處理系統：計算機工作站流式細胞術的臨床應用3FCM系統結構流體系統：樣本流、鞘液流式細胞術的臨床應用3FCM工作原理流程：樣本（血液實體組織）單細胞懸液熒光染料特異染色的樣本上機細胞單列通過測量區1.散射光信號2.熒光信號分離、收集、分析、光信號

2、細胞理化特性分析圖加入熒光染料激光激發流式細胞術的臨床應用4FCM工作原理流程：樣本（血液實體組織）單細胞懸液熒光染料特流式細胞儀的構造及原理流式細胞術的臨床應用5流式細胞儀的構造及原理流式細胞術的臨床應用5FCM測量光信號獲取與分析散射光信號前向散射光(FSC)-細胞大小側向散射光（SSC)-細胞粒度（膜的粒度、核大小與粒度、胞質數量）FSC信號越大，表明細胞體積越大；反之，則越小。SSC信號越大，表明細胞粒度越大；反之，則越小。流式細胞術的臨床應用6FCM測量光信號獲取與分析散射光信號流式細胞術的臨床應用6根據FSC-SSC二維點圖，可以容易區分Lym(R3)Gran(R1)與Mono(R

3、2)R1R2Incident Light SourceRight Angle Light Dectector a Cell ComplexityForward Light Detector a Cell Surface AreaR3R2R1根據FSC-SSC二維點圖，可以容易的區分出Lym(R3) .Gran(R1)與Mono(R2)流式細胞術的臨床應用7根據FSC-SSC二維點圖，可以容易區分Lym(R3)Gra流式細胞術常用染料及檢測波長流式細胞術的臨床應用8流式細胞術常用染料及檢測波長流式細胞術的臨床應用8流式細胞術的臨床應用9流式細胞術的臨床應用9熒光染料的發射不同波長流式細胞術的臨床

4、應用10熒光染料的發射不同波長流式細胞術的臨床應用10DNA 和RNA熒光探針的理化特性熒光探針 分子量 結合方式 堿基特異性 激發鋒（nm) 發射鋒(nm)P1 668 嵌入 無 493 630EB 394 嵌入 無 482 616MI 1069 非嵌入 G-C 320,445 575 CA3 1183 非嵌入 GC 320,445 575 HO33258 624 非嵌入 AT 343 480 HO33342 615 非嵌入 AT 343 455DAPI 350 非嵌入 AT 540 6507-AAD 1270 嵌入 GC 540 655 AO 370 嵌入 (雙鏈） 無 492 530 靜

5、電（單鏈） 640PY 303 嵌入 (雙鏈） GCAT 549-562 565-574 靜電（單鏈）流式細胞術的臨床應用11DNA 和RNA熒光探針的理化特性熒光探針 分子量 細胞周期分析通過熒光探針對細胞周期進行相對DNA含量的測定，可分析細胞周期各時期的百分比，周期動力參數及DNA異倍體G1SG2GoM流式細胞術的臨床應用12細胞周期分析通過熒光探針對細胞周期進行相對DNA含量的測定，分選系統（Sorting)依據流式細胞術測定的細胞參數可分選所需細胞群體：電荷式分選穩定液流測量區液滴形成液滴充電液滴偏轉分選收集邏輯電路流式細胞術的臨床應用13分選系統（Sorting)依據流式細胞術測定

6、的細胞參數可分選電荷式分選流式細胞術的臨床應用14電荷式分選流式細胞術的臨床應用14通道式分選穩定液流測量區邏輯電路捕獲管分選收集流式細胞術的臨床應用15通道式分選穩定液流測量區邏輯電路捕獲管分選收集流式細胞術的臨 第二部分 流式細胞術在臨床醫學中的應用流式細胞術的臨床應用16 第二部分流式細胞術流式細胞術的臨床應用17流式細胞術的臨床應用17流式臨床應用淋巴細胞亞群分析Th1/Th2 腫瘤學HLA-B27PNH 四聚體血小板活化 細胞凋亡 移植免疫流式細胞術的臨床應用18流式臨床應用淋巴細胞亞群分析Th1/Th2 腫瘤學流式細胞術的臨床應用19流式細胞術的臨床應用19流式細胞術的臨床應用20

7、流式細胞術的臨床應用20流式細胞術的臨床應用21流式細胞術的臨床應用21流式細胞術的臨床應用22流式細胞術的臨床應用22流式細胞術的臨床應用23流式細胞術的臨床應用23常用淋巴細胞亞群報告模式R流式細胞術的臨床應用24常用淋巴細胞亞群R流式細胞術的臨床應用24深圳市人民醫院流式細胞術報告單模式流式細胞術的臨床應用25深圳市人民醫院流式細胞術報告單模式流式細胞術的臨床應用25流式細胞術的臨床應用26流式細胞術的臨床應用26流式細胞術的臨床應用27流式細胞術的臨床應用27流式細胞術的臨床應用28流式細胞術的臨床應用28流式細胞術的臨床應用29流式細胞術的臨床應用29流式細胞術的臨床應用30流式細胞

8、術的臨床應用30流式細胞術的臨床應用31流式細胞術的臨床應用31流式細胞術的臨床應用32流式細胞術的臨床應用32流式細胞術的臨床應用33流式細胞術的臨床應用33流式細胞術的臨床應用34流式細胞術的臨床應用34流式細胞術的臨床應用35流式細胞術的臨床應用35流式細胞術的臨床應用36流式細胞術的臨床應用36流式細胞術的臨床應用37流式細胞術的臨床應用37HLA-B27通過CD3PEvsSSC設門，圈定CD3陽性細胞（T淋巴細胞），檢測其B-27的平均熒光強度。如標本的平均熒光強度小于標準微球熒光強度則為陰性，反之為陽性。流式細胞術的臨床應用38HLA-B27通過CD3PEvsSSC設門，圈定CD3

9、陽性細流式細胞術的臨床應用39流式細胞術的臨床應用39 Th1/Th2細胞流式細胞術的臨床應用40 Th1/Th2細胞流式細胞術的臨床應用40流式細胞術的臨床應用41流式細胞術的臨床應用41流式細胞術的臨床應用42流式細胞術的臨床應用42流式細胞術的臨床應用43流式細胞術的臨床應用43流式細胞術的臨床應用44流式細胞術的臨床應用44流式細胞術的臨床應用45流式細胞術的臨床應用45流式細胞術的臨床應用46流式細胞術的臨床應用46 腫瘤學流式細胞術的臨床應用47 腫瘤學流式細胞術的臨床應用47流式細胞術的臨床應用48流式細胞術的臨床應用48流式細胞術的臨床應用49流式細胞術的臨床應用49流式細胞術

10、的臨床應用50流式細胞術的臨床應用50流式細胞術的臨床應用51流式細胞術的臨床應用51流式細胞術的臨床應用52流式細胞術的臨床應用52流式細胞術的臨床應用53流式細胞術的臨床應用53流式細胞術的臨床應用54流式細胞術的臨床應用54流式細胞術的臨床應用55流式細胞術的臨床應用55流式細胞術的臨床應用56流式細胞術的臨床應用56流式細胞術的臨床應用57流式細胞術的臨床應用57流式細胞術的臨床應用58流式細胞術的臨床應用58流式細胞術的臨床應用59流式細胞術的臨床應用59 細胞凋亡流式細胞術的臨床應用60 細胞凋亡流式細胞術的臨床應用60流式細胞術的臨床應用61流式細胞術的臨床應用61流式細胞術的臨

11、床應用62流式細胞術的臨床應用62流式細胞術的臨床應用63流式細胞術的臨床應用63流式細胞術的臨床應用64流式細胞術的臨床應用64流式細胞術的臨床應用65流式細胞術的臨床應用65 移植免疫流式細胞術的臨床應用66 移植免疫流式細胞術的臨床應用66流式細胞術的臨床應用67流式細胞術的臨床應用67流式細胞術的臨床應用68流式細胞術的臨床應用68流式細胞術的臨床應用69流式細胞術的臨床應用69流式細胞術的臨床應用70流式細胞術的臨床應用70流式細胞術的臨床應用71流式細胞術的臨床應用71 四聚體流式細胞術的臨床應用72 四聚體流式細胞術的臨床應用72Tetramer-原理內源性抗原外源性抗原流式細胞

12、術的臨床應用73Tetramer-原理內源性抗原外源性抗原流式細胞術的臨床應Tetramer-原理MHC Class I-HLA-A2流式細胞術的臨床應用74Tetramer-原理MHC Class I-HLA-A2流Tetramer-原理流式細胞術的臨床應用75Tetramer-原理流式細胞術的臨床應用75Tetramer-原理國外醫學免疫學分冊 2001；24(2):102-105流式細胞術的臨床應用76Tetramer-原理國外醫學免疫學分冊 2001；24(2HLA Class I 限定性腫瘤抗原肽流式細胞術的臨床應用77HLA Class I 限定性腫瘤抗原肽流式細胞術的臨床應用抗原

13、特異性CTL的分析方法51Cr釋放實驗PCR法酶聯免疫斑點法(ELISPOT)擴增特異T淋巴細胞受體Tetramer法間接法需大量的特異性CTLs作為效應細胞需體外擴增，周期長，敏感性低， 費時費力難以廣泛應用敏感性高但只能用于已知TCR基因型的特異性CTLs檢測直接法敏感性高不受TCR基因型的限制有限稀釋法(LDA)用Tetramer法研究表明，外周血中僅有0.2-2.5% 的CD8+細胞對CMV和EBV特異流式細胞術的臨床應用78抗原特異性CTL的分析方法51Cr釋放實驗PCR法酶聯免疫斑Tetramer法Doherty PC.The numbers game for virus-spec

14、ific CD8+T cellsJ. Science,1998,280:227了解病毒特異性CTL和記憶性CTL方面的一項革命檢測病毒特異性CD8細胞的金標準(Gold Standard)流式細胞術的臨床應用79Tetramer法Doherty PC.The numberTetramer-應用感染性疾病HIV-AIDS, EBV, CMV, HPV, HBV, HCV, Influenza, Measles, Malaria, TB and RSVBreast, Prostate, Melanoma, Colon, Lung, Cervical, Ovarian and LeukemiaDia

15、betes, Lyme disease, Multiple sclerosis, Rheumatoid arthritis, Autoimmune vitiligoEBV and CMV 移植 自身免疫性疾病腫瘤流式細胞術的臨床應用80Tetramer-應用感染性疾病HIV-AIDS, EBV,感染性疾病Tetramer-應用-例證含有HIV-I型病毒包膜肽等三種抗原肽：HIV特異性CTL數量與血漿中RNA病毒量有明顯的負相關，而與產毒性感染細胞的清除率無關慢性HCV感染患者的特異性CTLs數量明顯少于急性HCV感染和已康復患者用黑色素瘤抗原誘導潛在的腫瘤特異性T細胞用Tetramer分離，富

16、集GVHD(移植物抗宿主反應)：受體與供體的次要組織相容性抗原(mHags)的不同引起，在骨髓移植后早期出現(14天內)，造成骨髓移植失敗-HLA-mHags肽四聚體監測mHags特異性CTL，以了解對GVHD的臨床治療效果HLA-A2/pp65 Tetramer監測腎移植患者感染CMV后的免疫應答能力 移植腫瘤流式細胞術的臨床應用81感染性疾病Tetramer-應用-例證含有HIV-I型病毒包流式細胞術的臨床應用82流式細胞術的臨床應用82流式細胞術的臨床應用83流式細胞術的臨床應用83 第三部分 定量流式細胞術流式細胞術的臨床應用84 第三部分流式細胞術的臨床應用84 定量流式細胞術的概述

17、定量流式細胞術指的是對待細胞的某種生物分子的絕對計量，而不是陽性細胞的相對百分數。原理：通過檢測標準微球的熒光強度獲得標準曲線，通過標準曲線（或方程）求得待測細胞的某種生物分子的精確數值，從而反應在某種生理、病理條件下待測細胞出現的微細變化，對臨床疾病的研究、診斷及治療等具有重要意義。流式細胞術的臨床應用85 定量流式細胞術的概述定量流式細胞術指的是對待細胞的某種生物血小板表面抗原定量- PLATELET Calibrator Kit流式細胞術的臨床應用86血小板表面抗原定量- PLATELET Calibrator特點可定量與血小板相關的任何抗原(如CD41, CD61, CD42a等)免洗

18、間接法一抗亞型為IgG1, IgG2a或IgG2b定量范圍寬(500-90,000 分子/血小板 )定量準確，CV值(變異系數)小血小板表面抗原定量- PLATELET Calibrator Kit流式細胞術的臨床應用87特點可定量與血小板相關的任何抗原(如CD41, CD61, 標準曲線血小板表面抗原定量- PLATELET Calibrator Kit流式細胞術的臨床應用88標準曲線血小板表面抗原定量- PLATELET Calibr結果血小板表面抗原定量- PLATELET Calibrator Kit流式細胞術的臨床應用89結果血小板表面抗原定量- PLATELET CalibratC

19、D41/61復合物變形與Firbrinogen結合，為初期血栓形成的關鍵步驟PLATELET Fibrinogen Kit流式細胞術的臨床應用90CD41/61復合物變形與Firbrinogen結合，為初期應用心血管疾病(不穩定心絞痛，心肌梗塞等)監測抗凝集治療(如RepPro, Integrelin, Plavix, Ticlid等)檢測GPIIb/IIIa(CD41/CD61)受體Fibrinogen結合能力血液體外(in vitro)活化(ADP等誘導)后，檢測Fibrinogen結合能力血小板活化狀態(ex vivo)標本處理PLATELET Fibrinogen Kit流式細胞術的臨

20、床應用91應用心血管疾病(不穩定心絞痛，心肌梗塞等)血液體外(in v白細胞表面抗原定量- CELLQUANTTM Calibrator Kit流式細胞術的臨床應用92白細胞表面抗原定量- CELLQUANTTM Calibra特點可定量與白細胞相關的任何抗原(如CD3, CD4, CD55, CD59等)單個定量(用一個單抗，如CD28抗體定量白細胞表面CD28分子數)多參數定量(如用CD8設門來定量CD8+ T細胞上CD28分子數)全血和分離的細胞(如細胞株等)均可間接法一抗亞型為IgG1和IgG2a定量范圍寬(1000-300,000 分子/白細胞 )定量準確，CV值(變異系數)小白細胞

21、表面抗原定量- CELLQUANTTM Calibrator Kit流式細胞術的臨床應用93特點可定量與白細胞相關的任何抗原(如CD3, CD4, CD標準曲線白細胞表面抗原定量- CELLQUANTTM Calibrator Kit流式細胞術的臨床應用94標準曲線白細胞表面抗原定量- CELLQUANTTM Cal結果白細胞表面抗原定量- CELLQUANTTM Calibrator Kit流式細胞術的臨床應用95結果白細胞表面抗原定量- CELLQUANTTM CalibBlood Dendritic Cell Enumeration KitDC作用：1.樹突狀細胞（dendritic c

22、ell,DC）為一群非均一性專職抗原遞呈細胞，與MHC二類分子結合向其它免疫活性細胞傳遞抗原信息。 2.骨髓樣DC（MDC）和淋巴樣DC(PDC).在誘導和調控免疫應答方式上完全不同：首先它們表達不同的抗原識別受體并對不同的抗原起作用；表達不同的細胞因子受體并對不同的細胞因子起反應，即使受到相同的抗原刺激。骨髓樣DC（MDC）與Th1效應相關,而淋巴樣DC（PDC）與Th2效應有聯系； 已經應用的領域包括：1）SLE病人病情和療效觀察；2）AIDS病人免疫機能分析；3）病毒性肝炎病人免疫狀況研究；4）疫苗研究。流式細胞術的臨床應用96Blood Dendritic Cell Enumerati

23、特點簡便、快捷、絕對計數DC亞群數/ml流式細胞術的臨床應用97特點簡便、DC亞群數/ml流式細胞術的臨床應用97流式細胞術的臨床應用98流式細胞術的臨床應用98最新技術計數血液中循環內皮細胞的標準方法流式細胞術的臨床應用99最新技術流式細胞術的臨床應用99循環內皮細胞(CEC)增加于CELLQUANT FF-CD146急性冠狀動脈綜合征血小板減少性紫癜鐮刀細胞貧血敗血癥狼瘡腎病綜合征器官移植排斥手術創傷癌癥傳統方法顯微鏡檢，手工計數。費時，費力，無法標準化流式細胞術的臨床應用100循環內皮細胞(CEC)增加于CELLQUANT FF-CD1新技術新標準CELLQUANT FF-CD146免疫磁珠富集與3色流式細胞術結合僅需1 mL血整個過程不到1個小時靈敏度高：1mL血中可檢測出10個循環內皮細胞重復性好，室間差(Interlaboratory CV)小流式細胞術的臨床應用101新技術新標準CELLQUANT FF