1、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管發(fā)生素【關(guān)鍵詞】斑馬魚(yú)；,血管發(fā)生素摘要：目的討論血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管發(fā)生素1及其受體在斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)，為構(gòu)建藥物挑選的在體模型提供根據(jù)。方法采用多聚酶鏈?zhǔn)椒错懀瑪U(kuò)增了長(zhǎng)約280bp的斑馬魚(yú)血管發(fā)生素1DNA局部序列，作為探針，以原位雜交法測(cè)定了血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管發(fā)生素1及其相應(yīng)受體flk1和Tie2的表達(dá)。結(jié)果從受精卵胚胎發(fā)育第12小時(shí)可見(jiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管發(fā)生素1及其相應(yīng)受體flk1和Tie2的表達(dá)；在受精卵胚胎發(fā)育的第16小時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管發(fā)生素1主要在頭部和尾部胚芽表達(dá)；第24小時(shí)在眼球、視窩、中腦、后腦的腹

2、前側(cè)和肌節(jié)中表達(dá)，Tie2和Flk1主要在肌間背部動(dòng)脈血管、軀干新生血管芽和軸向靜脈中表達(dá)。結(jié)論血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管發(fā)生素-1及其受體在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育早期的血管發(fā)生過(guò)程中可能互相作用，并協(xié)調(diào)血管發(fā)生過(guò)程。斑馬魚(yú)是研究胚胎發(fā)育早期微血管發(fā)生和血管發(fā)生的極佳動(dòng)物模型，可用于促血管發(fā)生或抑制血管發(fā)生藥物篩眩關(guān)鍵詞：斑馬魚(yú)；血管發(fā)生素1；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；受體ExpressinsfAngipietin1andItsReeptrsDuringEarlyDevelpentinZebrafishAbstrat：bjetiveTinvestigatetheexpressinfvasularendthel

3、ialgrthfatr(VEGF)andangipietin1(Ang1),andthEirreeptrsFlk1andTie2duringangigenesisandvasulgenesisinearlyebrydevelpentfzebrafish.ethdsUsinghlgy-basedplyerasehainreatin,a280bpfpartialDNAfzebrafish(zfAng1)asislated.TheexpressinsfAng1,Tie2,VEGFandFlk1inzebrafishereexainedduringupt24hebrynidevelpentbyhleu

4、ntinsituhybridizatin.ResultsThereerendetetableexpressinsfthesegenesupt10hpstfertilizatin.Hever,thereeredetetableexpressinsfthesegenesat12h.At16h,Ang1andTie2ereexpressedainlyinheadandtailbud.At24h,Ang1asexpressedainlyinthelens,ptiup,esenephaln,ventralpartfhindbrain,andytesinthesites,hilezfTie2asainly

5、expressedinintersitivesselsinludingdrsalartaandaxialvEIns,andsprutingvesselsfrthedrsalartainthetrunk.VEGFasexpressedainlyinthelens,ptiup,esenephalnandytesinthesites,hilezfFlk1asainlyexpressedinintersitivesselsinludingdrsalartaandaxialveins,andsprutingvesselsfrthedrsalartainthetrunk.nlusinAng1,VEGF,T

6、ie2andFlk1,ayatperativelyandinterativelyfrvasulardevelpentinzebrafishduringearlydevelpent.Presentresultsalssuggestedthatzebrafishasaqualitydelfrstudynvasulgenesisandangigenesisduringebrynidevelpentandsreeningfrangigenienhanerrinhibitrs.Keyrds：Zebrafish;Angipietin1;Vasularendthelialgrthfatr;Reeptr斑馬魚(yú)

7、(zebrafish,Danireri)具有世代周期短23個(gè)月，雌性個(gè)體可產(chǎn)大量卵，形體較小，易于在有限的空間內(nèi)飼育，早期胚胎發(fā)育過(guò)程血管發(fā)生過(guò)程透明便于直接觀察1。斑馬魚(yú)還具有和其他脊椎動(dòng)物相近的基因構(gòu)造和調(diào)節(jié)形式2。因此,利用斑馬魚(yú)發(fā)育過(guò)程中的這些優(yōu)點(diǎn)將有助于在體研究血管發(fā)生和微血管發(fā)生3。目前,血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vasularendthelialgrthfatr,VEGF)及其受體Flt-1在斑馬魚(yú)中的表達(dá)情況已經(jīng)相比照擬清楚4，5。但對(duì)于血管發(fā)生素1(angipietin1,Ang1)及其受體Tie2在斑馬魚(yú)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)尚不清楚。為此,我們檢測(cè)了Ang1及其受體Tie2在斑馬魚(yú)

8、早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況，以期為建立促血管發(fā)生或抑制血管發(fā)生的藥物挑選的動(dòng)物在體模型奠定基矗1材料與方法1.1試劑除特殊標(biāo)記的試劑外的其他試劑均購(gòu)自Siga公司。1.2斑馬魚(yú)Ang1(zebrafishAng1，zfAng1)DNA局部序列的別離從受精卵發(fā)育24h的胚胎lZAPDNA文庫(kù)(Stratagene,USA)中以PR和特定引物擴(kuò)增出一段斑馬魚(yú)zfAng1DNA局部序列，引物根據(jù)包括人、小鼠和牛在內(nèi)的Ang1蛋白的羧基端構(gòu)造域纖維蛋白樣構(gòu)造域(fibringenlikedain)的氨基酸序列設(shè)計(jì)。所用的引物：5TAAA(A/G)AA(A/G)GG(A/G)TT(/T)GG(A/G)

9、AAT(AGT)3，與人的Ang1蛋白的第344到第352位氨基酸序列YKKGFGNP相對(duì)應(yīng);5(TG)A(/T)G(A/G)T(A/G)AAAA(/T)(A/G)3，與人的Ang1蛋白的第445到第452位氨基酸序列GGFDA相對(duì)應(yīng)。擴(kuò)增條件：蛋白的第445到第452位氨基酸序列GGFDA相對(duì)應(yīng)。擴(kuò)增條件：94預(yù)變性4in，9410s，6030s，68120s，進(jìn)展40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增獲得約270個(gè)堿基對(duì)的DNA片段，應(yīng)用Apliyle測(cè)序，擴(kuò)增的DNA克隆至PRBlunt載體上。1.3動(dòng)物斑馬魚(yú)購(gòu)自arlinaBilgialSupplypany飼養(yǎng)于光照14h/10h黑暗周期，水溫28.5的魚(yú)

10、缸中。雌雄斑馬魚(yú)的投放比例為32。在給予光照后10in內(nèi)以虹吸管搜集受精卵，放置28.5盛有E3培養(yǎng)液的平皿中孵育。1.4hleunt原位雜交用所克隆到的zfAng1DNA作為探針，采用PR從斑馬魚(yú)受精卵發(fā)育24h時(shí)相的ZAPDNA文庫(kù)中克隆得到zfVEGF的全長(zhǎng)序列的探針。zfTie2探針由美國(guó)杜克大學(xué)KevinPeters博士惠贈(zèng)，zfFlk1的探針由美國(guó)卡羅林那大學(xué)DidierStainier博士惠贈(zèng)。斑馬魚(yú)的胚胎固定于焦碳酸二乙酯處理的磷酸鹽緩沖液配成的4%多聚甲醛，蛋白酶K酶解，用2g/L的甘氨酸清洗2次，再次固定和清洗，樣本在55進(jìn)展預(yù)雜交和雜交，未結(jié)合的探針用RNaseA(20g

11、/l)加以去除。樣品用羊血清封閉后,在堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗地高辛抗體孵育后,參加底物BIP/NBT進(jìn)展顯色。為進(jìn)展組織學(xué)檢測(cè),標(biāo)本再次用4%PFA固定、脫水、包埋在JB4包埋劑中，用irte(Zeiss)低溫切片機(jī)制成1厚切片。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2結(jié)果2.1zfAng1的DNA和氨基酸序列用同源PR法擴(kuò)增得到了約280bp的zfAng1DNA片斷，以此片斷的DNA可編碼得到含有90個(gè)氨基酸殘基的zfAng1，將所得到的zfAng1DNA片斷和人、小鼠及牛的血管生成素基因中編碼纖維蛋白原構(gòu)造域的核酸序列進(jìn)展的多重比擬具有54%57%的同源性，由所獲得的zfAng1DNA片斷預(yù)測(cè)可能編碼得到的氨

12、基酸序列和人、小鼠及牛的血管生成素氨基酸序列比擬，分別具有41%45%的同源性。結(jié)果見(jiàn)圖1。一樣的序列用陰影表示2.2斑馬魚(yú)的Ang1,Tie2,VEGF和Flk1的表達(dá)形式應(yīng)用hleunt原位雜交法對(duì)zfAng1和zfTie2在斑馬魚(yú)受精卵胚胎發(fā)育至24h的表達(dá)進(jìn)展了測(cè)定。結(jié)果說(shuō)明：到斑馬魚(yú)受精卵胚胎發(fā)育10h為止，未檢測(cè)到zfAng1和zfTie2的表達(dá)；在胚胎發(fā)育第12小時(shí)可檢測(cè)到zfAng1在斑馬魚(yú)胚胎頭部背側(cè)和zfTie2在頭部腹側(cè)的表達(dá)；在第16小時(shí)zfAng1主要表達(dá)于前腦、后腦和尾芽，而zfTie2主要表達(dá)于前腦、中腦前部和尾芽的腹前側(cè)；至第24小時(shí)，zfAng1主要表達(dá)于眼球

13、、視杯、中腦、后腦腹側(cè)和肌節(jié)中的肌肉局部，而zfTie2那么極少在頭部?jī)?nèi)皮側(cè)表達(dá)，主要在包括背部動(dòng)脈和腹側(cè)靜脈及軀體背動(dòng)脈的芽生血管等肌間血管中表達(dá)。結(jié)果見(jiàn)圖2。在斑馬魚(yú)受精卵胚胎發(fā)育至10h未能檢測(cè)到zfVEGF及其受體Flk1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而在第12小時(shí)可觀測(cè)到zfVEGF及其受體Flk1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)，這和已有的研究報(bào)道相符57。至第24小時(shí),zfVEGF主要表達(dá)于眼球、視杯、中腦和肌節(jié),而zfFlk1那么主要表達(dá)于包括背部動(dòng)脈、軸向靜脈以及軀干背動(dòng)脈的芽生局部在內(nèi)的肌間血管。結(jié)果見(jiàn)圖3。3討論本研究說(shuō)明Ang1、VEGF及其受體Tie2和Flk1在斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育過(guò)程中變化顯著。這些

14、基因不僅在血管部位表達(dá)，而且在包括眼睛在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，說(shuō)明這些基因除了參與斑馬魚(yú)的血管發(fā)生過(guò)程，在斑馬魚(yú)的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中也扮演著重要的角色。zfTie2和zfFlk1在內(nèi)皮細(xì)胞有著很強(qiáng)特異性表達(dá)。已有研究報(bào)道證實(shí)可在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育18h檢測(cè)到zfTie2和zfFlk1的表達(dá)，在斑馬魚(yú)受精卵發(fā)育的第30小時(shí)，可在所有內(nèi)皮細(xì)胞中檢測(cè)到zfTie2和zfFlk1的表達(dá)，在斑馬魚(yú)胚胎的頭部、心臟、軀干和尾部的血管內(nèi)皮細(xì)胞都檢測(cè)到zfTie2和zfFlk1的表達(dá)8。我們的研究結(jié)果說(shuō)明，在斑馬魚(yú)后續(xù)胚胎發(fā)育過(guò)程中軀干背主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞芽生出也可檢測(cè)到zfTie2和zfFlk1的表達(dá)。因此，同哺乳

15、動(dòng)物的胚胎發(fā)育過(guò)程中一樣,zfAng1和zfVEGF及其受體zfTie2與zfFlk1可能在斑馬魚(yú)出生前的血管發(fā)育過(guò)程中互相協(xié)同、互相作用。本研究結(jié)果還說(shuō)明,zfAng1及其受體Tie2可作為研究早期胚胎發(fā)育過(guò)程中血管發(fā)生的良好標(biāo)志物，斑馬魚(yú)也是促進(jìn)或抑制血管發(fā)生藥物挑選的極佳的動(dòng)物模型。參考文獻(xiàn)：1StainierDYR,Fishan.ThezebrafishasadeltstudyardivasulardevelpentJ.Trendsardivased,1994，4：207.2DddA,urtisP,illiasL,etal.Zebrafish:bridgingthegapbeteend

16、evelpentanddiseaseJ.HulGenet,2000，9：2443.3SerbedzijaGN,FlynnEandillettE.Zebrafishangigenesis:AnedelfrdrugsreeningJ.Angigenesis,2000,3:353.4BrEierG,AlbrehtU,SterrerS.etal.ExpressinfvasularendthelialgrthfatrduringebryniangigenesisandendthelialelldifferentiatinJ.Develpent,1992,114:521.5LiangD,XuX,hinAJ,etal.lningandharaterizatinfvasularendthelialgrthfatr(VEGF)frzebrafish,DanireriJ.BiphiiaBiphysiaAta,1998,1397:14.6Lia,BisgrveB,SayerH,etal.Thezebrafishgenelheatsupstreafaflk-1hlguetregulateendtheli