1、肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)課實驗報告實驗老師_至蕓瑛12級 生物科學(xué)3班5組 姓名：張鵬 學(xué)號：36實驗日期：2013年11月27日實驗題目植物中脯氨酸含量的測定實驗?zāi)康模毫私庵参矬w內(nèi)脯氨酸含量對植物抗寒性的影響，掌握標準曲線法測 定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的基本操作和 722型分光光度計的試用和操作方法。 實驗原理：采用磺基水楊酸提取植物體內(nèi)的游離脯氨酸，不僅大大減少了其他 氨基酸的干擾，快速簡便，而且不受樣品狀態(tài) （干或鮮樣）限制。在酸性 條件下，脯氨酸與苗三酮反應(yīng)生成穩(wěn)定的紅色縮合物，用甲苯萃取后， 此縮合物在波長520nm處有一最大吸收峰。脯氨酸濃度的高低在一定范 圍內(nèi)與其消光度成正比。樣品在

2、520nm波長下比色，即可從標準曲線上查出（或用回歸方程計算）脯氨酸的含量。實驗材料：木瓜葉葉片實驗器材：. 722型分光光度計；2.研缽；3. 100ml小燒杯；4.容量瓶；5.大 試管；6.普通試管；7.移液管；8.膠頭滴管；9.水浴鍋；10.漏斗； 11.漏斗架；12.濾紙；13剪刀。實驗試劑：1.酸性苗三酮溶液：將苗三酮溶于 30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸 中，攪拌加熱 （70C）溶解，貯于冰箱中。. 3 %磺基水楊酸：3g磺基水楊酸加蒸儲水溶解后定容至 100ml。.冰醋酸。.甲苯實驗步驟：.標準曲線的制作(1)在分析天平上精確稱取25m引甫氨酸，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸 儲

3、水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸儲水定容至刻度，此標準液 中每ml含脯氨酸100 H g。(2)系列脯氨酸濃度的配制取6個50ml容量瓶，分別盛入脯氨酸原液，一，及，用蒸儲水定容至刻度，搖勻，各瓶的脯氨酸濃度分別為 1,2,3, 4, 5及 6/g/ml。(3)取6支試管，分別吸取2ml系列標準濃度的脯氨酸溶液及 2ml 冰醋酸和2ml酸性苗三酮溶液，每管在沸水浴中加熱 30min。(4)冷卻后各試管準確加入 4ml甲苯，振蕩30S,靜置片刻，使色 素全部轉(zhuǎn)至甲苯溶液。(5)用膠頭滴管輕輕吸取各管上層脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以 甲苯溶液為空白對照，于520nm波長處進行比色。(6)標

4、準曲線的繪制：先求出吸光度值(Y)依脯氨酸濃度(X)而 變的回歸方程式，再按回歸方程式繪制標準曲線，計算 2ml測定液中脯 氨酸的含量(g g/2ml)根據(jù)吸光度測定，所得數(shù)據(jù)如下:編號123456脯氨酸濃度(Wg/2ml)24681012吸光度.樣品的測定(1)脯氨酸的提取 準確稱取不同處理的待測植物葉片各，分別置 大管中，然后向各管分別加入 5m13%的磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提 取10min,(提取過程中要經(jīng)常搖動)，冷卻后過濾于干凈的試管中，濾液 即為脯氨酸的提取液。(2)吸取2ml提取液于另一干凈的帶玻塞試管中，加入 2ml冰醋酸 及2ml酸性苗三酮試劑，在沸水浴中加熱 30min

5、,溶液即呈紅色。(3)冷卻后加入4ml甲苯，搖蕩30S,靜置片刻，取上層液至10ml 離心管中，在3000rpm下離心5min。(4)用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯 為空白對照，在分光光度計上 520nm波長處比色，求得吸光度值為。 實驗結(jié)果：根據(jù)系列脯氨酸濃度液吸光度的測定，得標準曲線如下：度光吸標準曲線2468101214脯氨酸含量（以g/2ml）度光吸標準曲線2468101214脯氨酸含量（以g/2ml）53525 503 0 2 0 1 0 06sss吸光度根據(jù)標準曲線上查出2ml測定液中脯氨酸的含量(Xp g/2ml),根據(jù)公式y(tǒng)=+,得脯氨酸含量為g g/2

6、ml結(jié)果計算：計算公式如下：單位鮮質(zhì)量樣品的脯氨酸含量（% = X-VT- 100W VS 106其中，X為從標準曲線查處的2mL測定液中脯氨酸的含量（ug/2mL）;VT為提取液體積（mL）;VS為測定是取用的樣品體積（mL）;W為樣品質(zhì)量（g）。X=w g/2ml VT=2ml VS=2ml W=把以上數(shù)據(jù)代入公式計算，得木瓜葉中所含脯氨酸為注意事項：.實驗過程中系列脯氨酸濃度的配制過程一定要精確無誤才能盡量 減少實驗的誤差，使標準曲線較為準確。.我們確保把木瓜葉片剪得足夠細碎，并研磨充分使脯氨酸充分釋 放出來，使得最后提取的脯氨酸含量盡量接近木瓜葉所含脯氨酸的量。.酸性苗三酮溶液要現(xiàn)場配

7、置好，否則其中的醋酸揮發(fā)后就會導(dǎo)致 結(jié)果出現(xiàn)偏差配置。.配制酸性苗三酮溶液和后續(xù)使用酸性苗三酮溶液進行染色的過程 中注意不要弄到皮膚上。.與酸性苗三酮溶液的反應(yīng)一定要反應(yīng)足夠長的時間才能使脯氨酸 充分染色，否則會使最后測得的樣品吸光度偏低。.沸水浴加熱的過程中注意反應(yīng)時間要充分。實驗分析：植物體內(nèi)的脯氨酸含量直接反映了植物的耐寒能力，因此植物耐寒 性越高，體內(nèi)所含脯氨酸含量也越高。遺憾的是，由于我們學(xué)校地處南 方，氣候溫暖，我們沒能在附近找到能在北方廣泛存在的常綠植物如小 麥高粱等，所以只能采用一些南方的常綠植物來進行實驗。使用苗三酮 溶液本該要小心，但是染色過程中手還是被苗三酮溶液染成了紫色。另 外在過濾操作的過程中比較難過濾充分，總是有部分濾液殘留于濾渣中 可能導(dǎo)致結(jié)果偏小。并且過濾所得的提取液非常少，大概勉強達到2ml,給吸取工作造成很大的麻煩。后來的吸光度測定工作，都是多次重復(fù)進 行測定，取數(shù)次測定的平均值，以減少實驗的誤差使實驗結(jié)果更精確。第二