1、HPLC-DAD測定 5 種苯類化合物（實驗報告）環境工程 劉鵬 123351一、實驗目的12基本了解高效液相色譜（1200LC）組成結構，硬件操作及掌握化學工作站的開機，關機，參數設定，數據采集及分析的基本操作。34掌握高效液相色譜定性、外標定量方法。二、實驗原理分配色譜原理：主要基于樣品分子在流動相和固定相間的溶解度不同（分配作用）而實現分離的液相色譜分離模式。C18 柱反相 HPLC（reversed phase HPLC其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠，代表性的流動相是甲醇和乙腈。是當今液相色譜的最主要分離模式，幾乎可用于所有能溶于極性或弱極性溶劑中的有機物質的分離。diode-ar

2、ray detector, ）工作原理：以光電二極管陣列（或CCD 陣列，硅靶攝像管等）作為檢測元件的 UV-VIS 檢測器，它可構成多通道并行工作，同時檢測由光柵分光，再入射到陣列式接受器上的全部波長的信號，然后，對二極管陣列快速掃描采集數據，得到的是時間、光強度和波長的三維譜圖。與普通UV-VIS檢測器不同的是，普通 UV-VIS檢測器是先用單色器分光，只讓特定波長的光進入流動池。而二極管陣列 UV-VIS 檢測器是先讓所有波長的光都通過流動池，然Agilent 1200 DAD 全掃描波長范圍為190nm-950nm ）Agilent 1200 LC 液相色譜儀的工作過程：輸液泵將流動相

3、以穩定的流速（或壓力）輸送至分析體系，在進入色譜柱之前通過自動進樣器將樣品導入，流動相將樣品帶入色譜柱，在色譜柱中各組分因處理或保存。外標法定量：外標法是色譜分析中一種簡便的定量方法。當樣品中所有組分都得到良好的分離并都能被檢測而得到色譜峰時，則可利用外標法定量計算樣品中各組分的濃度。其定量的依據是被測物質的量與它在色譜圖上的峰面積（或峰高）成正比。數據處理軟件（工作站）可以給出包括峰高和峰面積在內的多種色譜數據。一般由被測物所配標準濃度與峰面積做標準曲線，由標準曲線求出被測物濃度。三、儀器及試劑1、儀器：Agilent 1200 HPLC（四元泵、自動進樣器、柱溫箱、 DAD檢測器、C18色

4、譜柱，穩壓電源。2、試劑： 色譜級乙腈、甲醇；Miniport超純水；含5個苯類化合物的標準品；實際測試水樣四、實驗方法1.進樣器洗針進樣2.設置泵進樣量 20.0L流速 1.5ml/l溶劑停留時間 7.0minH2O 20%后運行時間 2.0min 甲醇 80%時間表時間0.0%C801.0801.017.00100.0100.03.柱溫箱溫控C4DAD信號4五、實驗步驟5.1上機準備根據待測物要求配制 5 個濃度點標準樣品，待測水樣 1-2查閱文獻，獲得目標分析物質或相近物質的液相色譜分離條件。檢查線路是否連接完好。檢查流動相、洗針液是否充足，不足則根據要求添加。有機流動相必須為進口 HP

5、LC 級，水相可使用 Millipore 純水機出水或娃哈哈屈臣氏純凈水。所有流動相在使用前均需用 0.2 m ,相需每天更換以保持新鮮。標樣和樣品在使用前必須用 0.2 m 的針頭式濾器（進口非分裝）過濾。用于清洗進樣系統及管路。（其中有下劃線部分為實驗課程中未涉及部分）5.2 開機1打開穩壓電源（指針指示 220V Accela AS、Accela PDA、Accela Pump電源開關。2打開電腦，雙擊工作軟件Xcalibur，在status 狀態欄下看到 ASPDAPump 三項顯示 readyto download；儀器面板燈除Pump 部分的 RUN 燈呈橙色外，其余燈均為綠色，表

6、明儀器及通訊正常，可進行下一步操作。3purge Accela Pump purge purge Accela pump 中的 purge Roadmap中 Instrument Setup 圖標，顯示 Instrument Setup 界面，點擊左側儀器圖標中的 Accela Pump，點擊下拉主菜單中 Accela Pump 欄中的 direct control 跳出該界面；在“take pump under control”欄打勾，輸入 flow 為 600 l/min100%play 鍵開始 10min 左右可按停止鍵；同樣的方法可 purge 其它流動相通道，直至管路中沒有氣泡。Pu

7、rge 完后將 purge 閥順時針擰到右邊，取下針筒中的廢液倒入指定的廢液桶。4檢查 Accela AS 門上自動進樣針筒上部黃色密封圈上端是否有氣泡，如有氣泡則要先行排氣，方法如下：點擊軟件雙擊 Roadmap 中 Instrument Setup 圖標，顯示 Instrument Setup 界面，點擊左側儀器圖標中的 Accela As，點擊下拉主菜單中 Accela As 欄中的 direct control 跳出該界面；選擇 Flush，點擊 apply（注意此時要關上 AS 5 穩定泵系統。雙擊軟件Roadmap 中 Instrument Setup 圖標，顯示Instrumen

8、t Setup 左側儀器圖標中的 Accela Pump，點擊下拉主菜單中 Accela Pump 欄中的 direct control 跳出該界面；take pump under control”欄打勾，輸入所需流動相啟動泵系統，運行20min 后方可進行其它操作（如運行 sequence5.3建立打開 UPLC 工作站 Xcalibur，雙擊 Roadmap 界面中的 Instrument Setup 圖標，點擊 Accela AS、Accela PDA、Accela Pump 圖標分別設置參數。Accela AS 參數設置：除 Injection （可設為 1-20l）外，其余參數請不要

9、更改。Accela PDA 參數設置：根據樣品實際情況對 run lengthtime、spectra、channels 等進行設置。Accela Pump 參數設置：選擇 Gradient Program 界面，編輯流動相梯度（注意正確選擇通道，以免氣泡進入系統）參數設置完后保存方法（默認路徑為：d:UPLCmethod5.4建立sequence點擊 sequence view 圖標進入 sequence 編輯界面。對于已建分析方法的樣品，可直接在原來的sequence sequence Unknown InstMeth 和 ProcMethod（如沒有工作曲線時可先不填此項）輸入方法名及定

10、量分析方法，輸入分析樣品在 Accela As 中的位置以及進樣量，以此類推編輯整個序列，遍及完后保存序列，并點擊按鈕運行。5.5 樣品分析點擊按鈕 real time plot play 可以看到實時采集的數據。開啟儀器半小時左右，可觀察到儀器信號基線平穩。sequence 設置完畢后，點擊 run sequence 在做標樣時，標樣也先作為未知樣品分析，待所有樣品分析完后再進行定量分析。5.6 分析結束進樣系統清洗：以不含營養鹽的流動相為樣品（最后一個樣品）run2-3 次，清洗進樣系統。其它添加物）流動相洗柱, 至無明顯出峰為止。最后用 80%以上的有機溶劑保存柱子。關閉工作站窗口，退出

11、工作站；關閉儀器面板 Accela AS、Accela PDA、Accela Pump 電源開關；關閉電腦，關閉穩壓電源。取出樣品瓶，清潔桌面，在儀器使用記錄本上登記。5.7 數據處理定量分析過程（建立工作曲線）參考“Xcalibur 定量分析”說明書。未知樣品結果分析，打開 sequence 在 Pro Meth 中輸入定量分析方法。選擇需計算濃度的樣品，點擊 Batch Reprocess Setup，選擇 Quan 欄，Peakdetection&Intergration以及 Quantitation（注意其余選 OK。點擊 Roadmap 進入 Quan Browser，打開seque

12、nce 文件名，選擇顯示所有數據，點擊unknows 查看樣品結果。六、數據處理1）原始數據實驗所得色譜圖 .2353025201510018.2.2776.3.1.1500標準樣品數據1234min濃度（ppm） 24681019.00134.87348.61467.40678.42535.83146.58255.39265.73582.24112.85825.61835.36748.67759.04218.94137.71353.90473.33989.48266.836（2）數據處理根據標準樣品的實驗數據，做出峰面積隨濃度變化的標準曲線。鄰苯二甲酸二甲酯100峰0246812濃度1008

13、0y = 5.5987x + 23.564R2 = 0.9853峰02468121212濃度y = 5.7714x + 1.6843R2 = 0.998102468濃度10080y = 8.8354x + 1.6634R2 = 0.9992峰02468濃度y = 6.6384x + 0.6416R2= 0.9985積面峰0246812濃度根據標準曲線，計算實際單標中的物質濃度 峰面積濃度七、思考題67.4068.34465.7357.53248.6778.14273.3398.11254.6808.1401、為什么溶劑和樣品要過濾?溶劑和樣品過濾非常重要，它會對色譜柱、儀器起到保護作用，消除由于污染對分析結果的影響。堵塞。和活塞的磨損。2、流動相使用前為什么要脫氣？流動相使用前必須進行脫氣處理 ，以除去其中溶解的氣體（如 O2相由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低而產生氣泡。氣泡會增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析。溶解的氧氣還會導致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發生降解而改變柱的分離性能。若用 ，可能會造成熒光猝滅。3、如何防止溶劑瓶內溶劑過濾器的堵塞，以及堵塞后的處理？沖液（PH=4-7A：請嚴格執行溶劑過濾。：請勿使用多日存放的蒸餾水及磷酸鹽緩沖液C：如果應用許可，可在溶劑中加入 0.0001-0.