1、芳香酰肼折疊體聚合物的構(gòu)建及其跨膜輸送研究化學系 化學專業(yè) 指導教目錄中文摘要Abstract關鍵詞Keyword前言1.1 超分子化學1.2 生物膜1.3 膜蛋白1.4 天然小分子通道1.4.1 短桿菌肽A(Gramicidin A)1.4.2 兩性霉素B(Amphotericin B)1.4.3 丙甲菌素1.5 人工合成跨膜輸送體系1.5.1 人工載體1.5.2 人工跨膜通道 1.5.2.1 超分子自組裝人工跨膜通道 1.5.2.2 單分子人工跨膜通道1.6 人工離子通道的表征方法-基于囊泡的熒光實驗正文2.1 目標分子的設計與合成2.2 芳酰肼大環(huán)分子M-1至M-3的嵌膜能力研究2.3

2、實驗部分參考文獻致謝摘要：本論文主要是關于一類新型的超分子跨膜輸送體系的研究介紹。從簡單的超分子化學概念出發(fā)，基于組內(nèi)以前的工作，我們設計并合成了一系列超分子的芳香酰肼大環(huán)體系，并進行了表征，最后還嘗試對其跨膜輸送效能進行了初步的嘗試。關鍵字： 超分子化學，跨膜輸送，大環(huán)，酰肼，芳香。Abstract:This dissertation is mainly about a new kind of supramolecular transmembrane system. From the ordinary conception of supermolecular chemistry, a ser

3、ies of aromatic hydrazide macrocycle molecules were designed and synthesized based on former work in our group. After proper characterization, we tried testing their tranmembrane transporting efficiency.Keywords: supermolecular chemistry , transmembrane transportation , macrocycles , hydriazide, aro

4、matic.前言1.1 超分子化學 “超分子化學”（supramolecular chemistry）一詞最早出現(xiàn)在websters dictionary (1903) 中，早期化學家也用“分子層次之上的化學”、“非共價鍵的化學”和“非分子化學”等詞語來描述這個領域。1978年，法國科學家Lehn首先引入了現(xiàn)代超分子化學的定義1。他將超分子化學定義為分子組裝及分子間成鍵的化學。法國科學家Lehn、美國科學家Cram和Pedersen分別在分子識別、穴狀化合物和冠醚方面的研究，為超分子化學的發(fā)展做出了開創(chuàng)性的工作，他們?nèi)斯餐@得1987年諾貝爾化學獎2。2002年，Lehn又對超分子化學重新進

5、行了定義：用非共價鍵的方法使各組份發(fā)生分子間的作用，來發(fā)展高度復合的體系3。分子識別（molecular recognition）與自組裝或自組織（self-assembly or self-organization）一直是超分子化學的兩個重要研究領域。在廣義上，超分子是由很多組分（一種或多種）通過自發(fā)的或者在非共價鍵作用的驅(qū)動下發(fā)生結(jié)合而形成具有不同于各組分功能的聚集體。這些聚集體可以是由一個分子包結(jié)（識別）另一個分子而形成的主-客體復合物，也可以是互補的組分通過自發(fā)的碰撞（自組裝）而形成的高級結(jié)構(gòu)。人類對于物質(zhì)世界從無序到有序變化過程以及對生物細胞自組織過程的認識都使我們對這種變化過程產(chǎn)生

6、濃厚的興趣，進而模擬這種過程來創(chuàng)造新的物質(zhì)4。超分子自組裝是一種或多種組分在多個非共價鍵的“編碼”下自發(fā)地形成熱力學穩(wěn)定的聚集體。聚集體的結(jié)構(gòu)取決于單體分子的結(jié)構(gòu)，有機合成可以提供自組裝的單體分子，而自組裝可以產(chǎn)生有序結(jié)構(gòu)的聚集體。自組裝可分為靜態(tài)和動態(tài)自組裝，它是一種具有可逆性、并最終能達到平衡的過程，這樣可以確保所形成的聚集體在熱力學上是最穩(wěn)定的，這也說明自組裝體系具有自糾錯能力。自組裝通常在溶液中或界面上進行，這樣可以使各組分自由的移動、碰撞和結(jié)合，并且各組分與體系所處環(huán)境間的相互作用也將影響自組裝的結(jié)果。現(xiàn)階段我們可以見到三種尺寸的組分可以發(fā)生自組裝：分子水平、納米級（膠體、納米線和納

7、米微球）以及宏觀物質(zhì)（從微米到厘米大小）5。基于自組裝的理論成果，超分子化學家已經(jīng)組裝出各種結(jié)構(gòu)的超分子6。1. 2 生物膜細胞是生命體系活動最基本的功能與結(jié)構(gòu)單位。構(gòu)成生物體的細胞中都有一層薄膜，細胞內(nèi)外環(huán)境由這層薄膜分隔開來，從而生命活動可以獲得穩(wěn)定的生物環(huán)境，這層膜稱為外周膜或者是細胞膜。眾所周知，細胞內(nèi)還有許多細胞器與亞細胞結(jié)構(gòu)(例如：線粒體、葉綠體、高爾基體、溶酶體、細胞核及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)，這些細胞內(nèi)的細胞器或亞細胞結(jié)構(gòu)同樣需要膜系統(tǒng)來實現(xiàn)不同的功能，這樣的膜稱為內(nèi)膜。所有構(gòu)成細胞的外周膜與內(nèi)膜統(tǒng)稱為生物膜。生物膜在結(jié)構(gòu)上有其特殊性，雖然不同的膜系統(tǒng)在組成成分上有一定區(qū)別，但所有膜系統(tǒng)都

8、是由磷脂分子、多糖及膜蛋白等多組分組裝形成的超分子化學體系(Figure 1-1)7。Figure 1-1. A schematic diagram for the cell membrane構(gòu)成生物膜的膜脂根據(jù)結(jié)構(gòu)不同一般可分為三種類型：甘油磷脂(glycerophospholipid)、鞘脂(sphingolipid)以及膽固醇(cholesterol)。其中在生物體中占絕大多數(shù)的是甘油磷脂。一般認為，生物膜以甘油磷脂為主體骨架，鞘脂和膽固醇分散在主體骨架中，而在膜脂所形成主體骨架中還含有具有不同功能的膜蛋白8。甘油磷脂具有親水的頭基及兩條疏水的尾鏈，因此磷脂分子自組裝形成的脂雙層結(jié)構(gòu)的兩

9、個外表面為親水部分，而脂雙層內(nèi)部則為疏水部分。這樣的結(jié)構(gòu)形成生物膜，使得非極性小分子物質(zhì)可通過自由擴散進出細胞，而極性物質(zhì)(如：氨基酸、陰陽離子等)則很難通過自由擴散進出細胞，從而保證了細胞膜內(nèi)外生物環(huán)境的穩(wěn)定，使各種生物功能得以正常表達。傳統(tǒng)理論認為，膜脂主要是對其內(nèi)容物提供隔離保護及骨架支撐作用。普通的脂雙層在沒有外界力的作用下是不能滲透離子的，如鈉離子、氯離子等，因為從膜親水端開始穿過膜疏水性內(nèi)部需要很大的能量9。1.3 膜蛋白分子離子等在細胞膜內(nèi)外的傳輸是一個精確調(diào)節(jié)的生物過程。細胞維持正常的生理功能需要不斷地從外界獲取營養(yǎng)物質(zhì)、同時各種生理活動代謝產(chǎn)生的物質(zhì)也需要及時從細胞內(nèi)部排除，

10、而且細胞需要維持內(nèi)外滲透壓等生物環(huán)境的穩(wěn)定，因此在細胞膜中對應有特定的傳輸系統(tǒng)來調(diào)節(jié)細胞與環(huán)境之間的化學物質(zhì)與化學信號，從而維持生命的穩(wěn)定與信息的傳遞。通常，這些系統(tǒng)是由復雜的蛋白構(gòu)成，也稱為膜蛋白，其中占據(jù)主導地位的是通道蛋白和載體蛋白兩種形態(tài)。因此在生物細胞中，陰陽離子、水、氨基酸以及糖類等具有生物活性的物質(zhì)進出細胞膜都依靠具有跨膜輸送能力的膜蛋白。膜蛋白起著內(nèi)外通道的作用，并表現(xiàn)出極高的選擇性與效率，在保持細胞內(nèi)部正常的生理環(huán)境、生理信號的傳導和活性物質(zhì)的合成等方面有極其重要的作用10。在過去的幾十年中，人們對跨膜蛋白的功能進行了大量的研究，對運輸與選擇性機制有了一定的了解，但是仍不足夠

11、清楚。就目前所得出的結(jié)論來看，在細胞膜上實現(xiàn)這一過程主要有兩種不同的機理：一類是通過被輸送的物質(zhì)在膜內(nèi)(或膜外)與載體蛋白結(jié)合以后，載體蛋白攜帶者該物質(zhì)運動到細胞膜的另一側(cè)然后將物質(zhì)釋放釋放，這類輸送過程稱為“載體”型輸送，典型的例子是葡萄糖傳遞因子(GLUT 1 transporter)；另一種是膜蛋白在膜上形成的特殊“孔道”，物質(zhì)經(jīng)由該“孔道”出入細胞膜。與“載體”型輸送相比，被輸送物質(zhì)是連續(xù)的通過“孔道”進出細胞膜，這一類型的輸送可稱為“通道”型輸送，在生物體內(nèi)典型的例子是鉀離子通道蛋白(Figure 1-2)。Figure 1-2. A schematic diagram for th

12、e transport protein and channel protein.前面提到，由磷脂雙分子層構(gòu)成的細胞膜無法在無外加驅(qū)動力的條件下輸送生物體系中的陰陽離子。因為在細胞膜上有大量具有特殊輸送功能的膜蛋白，才使得這一過程變得高效而且專一。從生物體系中得到啟發(fā)，化學家通過有機合成構(gòu)筑特定結(jié)構(gòu)的有機小分子來模擬通道蛋白的輸送過程，這類分子能夠通過攜帶或控制來選擇性跨膜輸送生物活性物質(zhì)。這些研究可為物質(zhì)跨膜輸送的機理提供簡單的模型，也有助于深入理解通道蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關系，并將為與通道蛋白相關疾病的治療提供新的研究思路11。1.4 天然小分子通道天然的通道蛋白雖然在傳輸效率及選擇性方面具有巨

13、大優(yōu)勢，但是其結(jié)構(gòu)過于復雜，很難通過化學方法構(gòu)筑相似結(jié)構(gòu)進行模擬。同時，由于通道蛋白不能脫離生命體進行研究等原因，其在跨膜輸送過程中的種種機理還并不清晰。然而與通道蛋白具有類似功能的天然小分子通道結(jié)構(gòu)卻簡單很多(通常是一些短肽分子)，通過化學合成較容易得到結(jié)構(gòu)與其類似的有機分子，并且對于天然小分子通道的研究更加全面透徹。目前，科研工作者主要以三類天然小分子通道為模板來設計人工合成的跨膜輸送體系。第一類是短桿菌肽A12，第二類是制霉菌素或兩性霉素B13，第三類是丙甲菌素14。下面就這三類天然小分子通道進行介紹。1. 4. 1 短桿菌肽A(Gramicidin A)Figure 1-3. A sc

14、hematic diagram for the gramicidin A.短桿菌肽A(gramicidin A)是從短芽孢桿菌(Bacillus brevis)的培養(yǎng)物中提取出的一種線狀多肽，由15個氨基酸構(gòu)成，其中包括交替排列的8個L型-氨基酸和7個D-氨基酸，這一結(jié)構(gòu)特點使短桿菌肽A形成-螺旋結(jié)構(gòu)。由于單個短桿菌肽A形成的螺旋結(jié)構(gòu)其長度不足以穿過磷脂雙層膜，所以其通常以二聚體的形式組裝成為跨膜離子通道(Figure 1-24)。短桿菌肽A一般作為抗生物質(zhì)使用，一般認為它的抗菌機理是通過在細菌細胞膜上形成跨膜的通道，從而改變細胞膜的通透性，使某些陽離子向膜的另一側(cè)傳輸，從而使細菌的新陳代謝活

15、動受到抑制而死亡。短桿菌肽A對某些革蘭氏陽性菌(Gram Positive Bacteria)有較好的抗菌效果，但對人體細胞同樣有上述作用，故它的臨床應用受到較大限制，一般制成藥膏局部外用。1. 4. 2 兩性霉素B(Amphotericin B)Figure 1-4. Models of amphotericin B function in phospholipid bilayers.由于制霉菌素(Nystatin)與兩性霉素B(Amphotericin B, AMB)的結(jié)構(gòu)作用機制基本類似，故此處以兩性霉素B為例介紹這類天然小分子通道。兩性霉素B是從節(jié)狀鏈霉(Streptomyces no

16、dosus)的代謝產(chǎn)物中提取的環(huán)狀多烯類抗生素，它是由37個碳原子組成，含有7個共軛雙鍵組成的剛性疏水結(jié)構(gòu)和7個羥基的飽和烷基連組成的親水的柔性結(jié)構(gòu)，是一個環(huán)狀內(nèi)酯兩親性分子 (Figure 1-4)。兩性霉素B與固醇類分子有較強的結(jié)合能力；同時，由共軛雙鍵組成剛性疏水結(jié)構(gòu)與固醇類分子間存在范德華力作用，這就使固醇類分子與兩性霉素B的結(jié)合更加緊密。舉例來說，兩性霉素B與真菌細胞膜上的麥角固醇(Ergosterol)結(jié)合后會形成板狀結(jié)構(gòu)，4到12個這樣的板狀結(jié)構(gòu)可以在細胞膜中自組裝形成“桶-板”結(jié)構(gòu)的跨膜通道。利用此特點，兩性霉素B可以用來治療艾滋病、移植后的深度真菌感染。1. 4. 3 丙甲菌

17、素(Alamethicin)丙甲菌素(Alamethicin)是一種從真菌(綠色木霉菌，Trichoderma viride)中提取出的一種天然線狀多肽，由20個氨基酸組成。丙甲菌素采取-螺旋結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，單體長度為3.4納米，盡管長度足以穿透磷脂雙層膜，但其并不以單分子的形式形成跨膜通道。目前研究者認為，丙甲菌素在磷脂雙層中以3-11個單體(最常見的為8個單體)通過自組裝形成“桶-板” (barrel-stave)結(jié)構(gòu)(Figure 1-5)。同短桿菌肽A類似，丙甲菌素也有較好的抗菌活性，它對細菌及真菌都有抑制或殺死功效15。Figure 1-5. (a) Alamethicin; (b) -

18、helical structure; (c) barrel - stave model.1.5 人工合成跨膜輸送體系如上文所述，具有跨膜輸送能力的膜蛋白在維持細胞的各類正常生理功能方面具有至關重要的作用。這些膜蛋白在跨膜輸送的過程中表現(xiàn)出極高的選擇性與效率，而且在保持細胞內(nèi)部正常的生理環(huán)境、生理信號的傳導和活性物質(zhì)的合成等方面有極其重要的作用。這些蛋白的功能失調(diào)將引起一系列重大疾病，例如：鉀離子通道蛋白在細胞間的信號傳導方面有重要功能，參與調(diào)節(jié)心率、神經(jīng)遞質(zhì)釋放等重要的生物功能，鉀離子通道蛋白功能異常會引起癲癇等疾病。多年以來，化學家希望通過構(gòu)筑人工跨膜輸送體系來模擬具有跨膜輸送功能的蛋白的結(jié)

19、構(gòu)與功能，以期為研究物質(zhì)跨膜輸送機理提供簡單的模型，從而為通道病的治療提供新的研究思路。幾十年來，超分子化學家們報道了多種多樣的人工跨膜輸送體系，按照作用方式不同可簡單的分為“人工載體”與“人工跨膜通道”兩類，下面我們分別介紹這兩類人工跨膜輸送體系。1. 5. 1 人工載體(Artificial Transporters)如前文所述，生物體系中存在以“載體”形式輸送分子、離子的載體蛋白。它的輸送過程可簡單描述如下：被輸送的物質(zhì)在膜內(nèi)(或膜外)與載體蛋白結(jié)合后，載體蛋白從細胞膜的一側(cè)向另一側(cè)運動，并且釋放被輸送物質(zhì)。由示意圖可知，該輸送過程是不連續(xù)的(Figure 1-6)。科研工作者在實驗中發(fā)

20、現(xiàn)，一些有機小分子可以與特定的離子或分子結(jié)合，該過程與生物體系中的載體蛋白結(jié)合被輸送物質(zhì)時類似，以此為突破口，化學家們發(fā)展了多種類型的人工離子載體。目前，人工離子載體的研究主要集中在陰離子的跨膜輸送上16。Figure 1-6. A schematic diagram for artificial transporters.2008年，A. P. Davis 課題組報道了一類以甾類化合物為骨架的人工離子載體。甾類化合物骨架與磷脂雙分子層的疏水環(huán)境可以很好地相容，使得此類人工傳遞因子可以高效的實現(xiàn)氯離子的跨膜輸送(Figure 1-7)17。Figure 1-7. The structures

21、of steroid-based Artificial Transporters.2013年，P. A. Gale 課題組報道了一類以鄰苯二胺為骨架的人工離子載體，該體系可以跨膜輸送氯離子、碳酸氫根離子等陰離子。此類人工離子載體表現(xiàn)出非常高的輸送效率(Figure 1-8)18。Figure 1-8. (a) Structures of ortho-phenylenediamine-based bisureas; (b) Molecular mechanics lowest energy structures of 5Cl- (top) and 5HCO3- (bottom) complexe

22、s.1. 5. 2 人工跨膜通道(Artificial Channels)在前文中提到，生物體系中另有一類通道蛋白以“通道”形式跨膜輸送離子、分子。與載體蛋白不同，通道蛋白是在膜上形成貫通細胞膜兩側(cè)的“孔道”，由此可以實現(xiàn)連續(xù)輸送(Figure 1-9a)。天然通道蛋白的結(jié)構(gòu)復雜、難于表征，且天然通道蛋白脫離生物體系易失活，不便于研究，故在科研工作中往往選用與其功能類似，且結(jié)構(gòu)簡單、性質(zhì)穩(wěn)定的天然小分子通道。多年來，科學工作者對這類天然通道的跨膜輸送機理進行了深入的研究，并以此類天然小分子通道為模型，發(fā)展了種類繁多的人工跨膜通道體系。自1982年Tabushi 課題組首次報道人工合成跨膜通道至

23、今19，關于人工合成跨膜通道的報道逐年加速增長。從形成跨膜通道的機理上分類，主要可分為如下五大類20 (Figure 1-9b)：(A)單分子模型(Unimolecular)；(B)桶-板模型(Barrel-Stave)；(C)桶-環(huán)模型(Barrel-Hoop)；(D)桶-花環(huán)模型(Barrel-Rosette)；(E)超分子膠束模型(Micellar Supramolecules)。其中，除單分子模型外，其余四種模型均是通過超分子自組裝形成的多分子跨膜通道。下面我們就超分子自組裝模型與單分子模型分別加以詳述。Figure 1-9. (a) A schematic diagram for a

24、rtificial channels; (b) Different models of artificial channels.1.5.2.1 超分子自組裝人工跨膜通道天然小分子通道基本是以超分子自組裝形式形成跨膜通道，所以在人工跨膜通道體系中，基于超分子自組裝的人工跨膜通道非常重要。由有機合成得到結(jié)構(gòu)相對簡單的單體分子，然后通過自組裝形成超分子體系，這樣的過程在人工組建跨膜通道的過程中是可行的。超分子自組裝人工跨膜通道體系根據(jù)結(jié)合模式不同主要分為：桶-板模型、桶-環(huán)模型、桶-花環(huán)模型、超分子膠束模型。下面舉例介紹一下這幾類人工跨膜通道模型。桶-板模型(Barrel-Stave)：桶-板模型的

25、構(gòu)成單元是一類結(jié)構(gòu)簡單、不可彎曲的剛性棒狀分子。S. Matile 課題組發(fā)展的苯低聚物(p-oligophenyl)是最為典型的例子，通過調(diào)節(jié)這類低聚物上的芳基數(shù)目，可得到不同長度的低聚物，它們作為剛性的棒狀骨架。引入多條肽鏈的棒狀分子嵌入脂雙層膜中后，肽鏈之間彼此可通過氫鍵結(jié)合在一起，而棒狀分子組成類似木桶的“木板”，四個這樣的“木板”通過彼此間的肽鏈上的氫鍵結(jié)合就可以形成柱狀的中空通道結(jié)構(gòu)(Figure 1-10) 21。 Figure 1-10. Self-assembly of artificial ion channel from p-oligophenyl rods.桶-環(huán)模型(

26、Barrel-Hoop)：桶-環(huán)模型的構(gòu)成單元是環(huán)狀分子，主要包括環(huán)肽以及芳酰胺大環(huán)等。J. R. Granja 課題組報道了一系列環(huán)肽分子，它們通過環(huán)與環(huán)之間的氫鍵作用組裝形成管狀結(jié)構(gòu)，此類人工合成通道對陽離子有較好的選擇性(Figure 1-11)22。Figure 1-11. Self-assembly of artificial ion channel from cyclic peptide.桶-花環(huán)模型(Barrel-Rosette)：桶-花環(huán)模型中的單體分子相對前兩種更小。桶-花環(huán)模型通過環(huán)與環(huán)之間的弱相互作用堆積成管狀結(jié)構(gòu)，這與桶-環(huán)模型類似，但桶-環(huán)模型中單體是環(huán)狀結(jié)構(gòu)，而桶-

27、花環(huán)模型中環(huán)狀結(jié)構(gòu)是由更小的片段組裝形成的。典型的例子是P. Talukdar 課題組報道的以甘露醇衍生物為結(jié)構(gòu)單元，通過超分子自組裝形成的管狀結(jié)構(gòu)。在此管狀結(jié)構(gòu)中，三或四個基本單元通過分子間氫鍵形成平面環(huán)狀結(jié)構(gòu)，環(huán)狀結(jié)構(gòu)之間又通過氫鍵結(jié)合成為管狀結(jié)構(gòu)(Figure 1-12)。這類人工跨膜通道在跨膜輸送的過程中表現(xiàn)出陰離子選擇性，這不同與大部分人工跨膜通道優(yōu)先選擇陽離子23。Figure 1-12. Mannitol-based barrel-rosette ion channel.超分子膠束模型(Micellar Supramolecules)：T. M. Fyles 課題組報道了一類兩親

28、性的小分子化合物可在脂雙層中形成跨膜通道，這類兩親性分子很可能是按照超分子膠束模型在膜上形成跨膜孔穴的 (Figure 1-13)。這類通道優(yōu)先選擇通過陽離子。其實，不止這個分子可以形成人工跨膜通道，很多兩親性的分子都可以在脂雙層上表現(xiàn)出通道性質(zhì)24。Figure 1-13. A micellar channel formed by double-chain amphiphiles.1.5.2.2 單分子人工跨膜通道前文所提到的超分子自組裝人工跨膜通道是通過結(jié)構(gòu)簡單的單體分子自組裝形成，過程具有較強的動態(tài)可逆性和濃度依賴性，穩(wěn)定性不高，因此傳輸過程中輸送效率和選擇性都不夠理想。相比之下，單分子

29、人工跨膜管道是通過有機合成直接構(gòu)筑可以穿透脂雙層的管狀分子，一個分子即可貫穿脂雙層形成通道，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性更高，不存在濃度依賴性，往往在傳輸過程中也就表現(xiàn)出更好的輸送效率以及選擇性。超分子自組裝通道在傳輸過程中往往存在多種不同構(gòu)象，自組裝過程通過控制條件得到特定構(gòu)象是難以控制的，這就成為研究超分子自組裝人工通道性質(zhì)的一大難點。近幾十年來，化學工作者由此展開了大量工作，發(fā)展了一系列單分子人工跨膜通道，下面我們介紹幾類典型的單分子人工跨膜通道。早期，G. W. Gokel 課題組為代表的科研工作者們發(fā)展一類以冠醚結(jié)構(gòu)為基礎的單分子人工跨膜通道(Figure 1-14)25。冠醚是超分子化學中最古老的

30、主體分子之一，其特點是可以與金屬陽離子結(jié)合，不同大小的冠醚也可以結(jié)合不同的金屬陽離子。超分子化學家通過柔性或者剛性的鏈狀結(jié)構(gòu)把若干個冠醚連接起來從而得到對某些金屬陽離子有特殊選擇性的單分子人工跨膜通道。Figure 1-14. Unimolecular synthetic ion channels with oligocrown ionophores.2005年，M. S. Gin 課題組報道了一種以環(huán)糊精為骨架的單分子人工跨膜通道26。他們在環(huán)糊精分子的一側(cè)引入多條低聚乙醚側(cè)鏈，此側(cè)鏈疏水且長度足以穿過磷脂雙分子層，每條側(cè)鏈上靠近環(huán)糊精骨架的位置有一個胺基(Figure 1-15)。文獻報道

31、這類單分子人工通道在傳輸過程中可以高效傳輸陰離子，選擇性為 I- Br- Cl-。Figure 1-15. Structure of aminocyclodextrin channel.2012年，K. Kinbara 課題組報道了一種以線狀分子折疊形成的單分子跨膜通道27。此分子結(jié)構(gòu)分為兩部分，一部分是親水的柔性乙氧基鏈，另一部分為疏水的剛性1,4-雙(苯乙炔基)苯片段(Figure 1-16)。在嵌膜過程中，這類線性分子片段間會產(chǎn)生 - 堆積作用，從而形成貫穿脂雙層的孔道，孔道內(nèi)徑為0.53納米。Figure 1-16. A schematic diagram for a syntheti

32、c ion channel formed by multiblock amphiphilic oligomer in lipid bilayers.我們課題組一直致力于單分子跨膜通道的研究并取得了一些成果，克服了國際上懸而未決的難點。主要的工作是以柱芳烴(柱5或柱6芳烴)為骨架。柱芳烴的結(jié)構(gòu)剛性很強，且內(nèi)部有足夠大的空腔。柱芳烴兩端也有多個易于修飾的基團位點28。在柱芳烴兩端引入適當結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈，可以方便的構(gòu)筑具有合適長短以及兩親性的通道分子(Figure 1-17)。Figure 1-17. A schematic diagram for a synthetic ion channel for

33、med by pillar arene2011年，我們報道了第一例以柱芳烴為骨架的單分子人工跨膜通道29。由于單個柱芳烴片段的長度僅為脂雙層的1/2，故研究者將兩個衍生化的柱芳烴分子同過不同長度的柔性鏈連接起來，從而形成單分子人工跨膜通道(Figure 1-18)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，此通道可以選擇性的傳輸質(zhì)子，當兩柱芳烴片段中間的柔性鏈為4個碳時，這類人工跨膜通道擁有最佳的傳輸能力。還證明了這類人工跨膜通是依靠通道分子中形成的水線來傳輸質(zhì)子。Figure 1-18. A schematic diagram for a synthetic ion channel formed by pillar

34、arene.2014年，我們報道了一類電壓門控單分子人工跨膜通道30。在這類通道分子的結(jié)構(gòu)中，我們在柱5在側(cè)鏈上引入了精氨酸片段。由于精氨酸上的胍基的pKa為12.48，所以在在中性、酸性或堿性的環(huán)境下都是帶正電荷的。多個帶正電荷的側(cè)鏈使得此通道分子在膜上的開關狀態(tài)可通過電壓調(diào)控(Figure 1-19)。Figure 1-19. (a) Structure of channels. (b) Schematic presentation for the voltage- driven channel inserting into and leaving of lipid bilayer.盡管單

35、分子通道的研究已取得一些突破，但它同樣存在著問題：結(jié)構(gòu)復雜，難于合成，因此其應用范圍就受到了限制。由上可知，雖然人工合成跨膜通道已取得巨大進步，但是發(fā)展新的、具有高選擇性以及傳輸效率的或者對新物種傳輸具有特異性效果的人工跨膜輸送體系仍具有重要意義。同樣，單分子人工離子通道的結(jié)構(gòu)簡化與功能優(yōu)化同樣是亟待化學工作者解決的問題。1.6 人工離子通道的表征方法-基于囊泡的熒光實驗囊泡(vesicle)是由磷脂分子自組裝形成的空心球狀組裝體，是由磷脂雙分子層形成的密封結(jié)構(gòu)(Figure 1-20)。囊泡具有與活體細胞相近的膜脂結(jié)構(gòu)，在生物、藥物等研究方向得到了非常廣泛的應用。常見的囊泡類型有：多層囊泡(

36、multi-lamellar vesicles, MLVs)，尺寸大小不均一(200 nm到1 m)；小尺寸單層囊泡(small unilamellar vesicles, SUVs)，大小在30-50 nm；大尺寸單層囊泡(large unilamellar vesicles, LUVs)，尺寸在100-200 nm；以及巨型囊泡(Giant unilamellar vesicles, GUVs)，尺寸大于300 nm31。Figure 1-20. A schematic diagram for liposome.在人工跨膜輸送體系中基于囊泡的熒光實驗占有重要地位，這是由于囊泡的制備方法較為

37、成熟，具有高度可重復性，以普通熒光分光光度計即可測定，且具有普適性。此方法使超分子化學工作者可以簡單快捷的了解人工跨膜輸送體系的輸送活性。通常在囊泡內(nèi)部包結(jié)不同的熒光探針就能實現(xiàn)對不同輸送物質(zhì)的檢測。進行基于囊泡的熒光實驗前先要制備LUVs，常用冷凍-解冷凍-過膜的方法32。制備囊泡時，將熒光探針包結(jié)到囊泡內(nèi)部，待囊泡制備完成后，通過透析可以除去游離在囊泡外部的熒光素，即可得到囊泡儲備液。我們知道跨膜輸送離子的過程中存在電荷補償?shù)默F(xiàn)象，通常分為同向傳遞(Symport)以及異向傳遞(Antiport)兩種方式。當跨膜輸送方式為同向傳遞時，可直接在囊泡儲備液外加入待轉(zhuǎn)運的離子，依靠內(nèi)外濃度差推動

38、待轉(zhuǎn)運的離子進入囊泡，從而引起熒光探針熒光強度的改變；當跨膜輸送方式為異向傳遞時，需提前在囊泡內(nèi)包結(jié)一定濃度的鹽溶液，以便在離子輸送過程中平衡電荷(Figure 1-21a)。實驗過程中，在未加入目標分子時，被輸送的離子很難通過自由擴散進入囊泡內(nèi)部，熒光探針的熒光強度不會明顯變化，此時的熒光強度為I0；當加入人工合成輸送體系后，被輸送離子通過人工合成輸送體系進入囊泡內(nèi)部，熒光強度會發(fā)生顯著變化；當一段時間后熒光強度趨于穩(wěn)定時，以表面活性劑破壞囊泡，囊泡內(nèi)部的熒光探針就完全暴露在外部環(huán)境中，此時的熒光強度為I。通過公式：(It-I0)/(I-I0)進行歸一化處理后，即可得到相對熒光強度曲線。該曲

39、線能夠反映跨膜輸送體系輸送能力的強弱(Figure 1-21b)31。Figure 1-21. (a) General configuration; (b) typical result, and (c) data analysis of vesicle flux experiments.基于囊泡的熒光實驗操作簡單，可方便考察嵌膜能力、離子輸送效率等重要參數(shù)。一般在人工離子通道的研究中，通常先使用熒光實驗研究目標分子的嵌膜能力等信息，然后再通過膜片鉗實驗對輸送機理進行深層次的研究。膜片鉗實驗由于本論文不涉及，故不做介紹。正文2.1 目標分子的設計與合成早期的超分子芳香折疊體研究中，多使用芳香酰

40、胺類的化合物，后來又發(fā)展出了芳香酰肼結(jié)構(gòu)。酰肼結(jié)構(gòu)與酰胺結(jié)構(gòu)相比更為剛性，成氫鍵中心更多，選擇性更豐富，也能組成更大孔徑的折疊體，因此得以迅速發(fā)展。近幾年來，我們課題組發(fā)展了幾種管狀單分子人工跨膜通道，實現(xiàn)了水、離子及小分子生物活性物質(zhì)(如氨基酸)的跨膜輸送(Figure 2-1)28, 30, 33-35，其中包括一類以芳酰肼為骨架，成螺旋管狀構(gòu)象的單分子人工離子通道，通過分子內(nèi)氫鍵其骨架螺旋結(jié)構(gòu)得以穩(wěn)定。Figure 2-1. Several single-molecular channels reported by our group.與曾經(jīng)的以芳酰肼為骨架螺旋管狀結(jié)構(gòu)不同，以芳酰肼為骨

41、架的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的骨架更為剛性，環(huán)狀骨架所形成的內(nèi)穴更為穩(wěn)定。我們設計了三種具有不同芳酰肼骨架結(jié)構(gòu)的環(huán)狀分子(11, 12 and 13)(Figure 2-2)，它們的內(nèi)穴大小有較明顯的區(qū)別，我們希望借此研究內(nèi)穴大小對跨膜通道性質(zhì)產(chǎn)生的影響。在之前的報道中，我們發(fā)現(xiàn)在芳酰肼骨架上引入多條L-苯丙氨酸三肽側(cè)鏈所形成的螺旋管狀結(jié)構(gòu)具有良好的嵌膜能力。所以在本工作中，我們同樣在芳酰肼骨架上引入多條L-苯丙氨酸三肽側(cè)鏈，以增強目標分子的嵌膜能力。Figure 2-2. Structures of compounds M-1, M-2 and M-3.2004年，Gong 課題組報道了一種簡便一步合成芳酰

42、胺骨架大環(huán)36的方法。這一方法大大縮短了合成過程(Figure 2-3)。借鑒此法，我們期望發(fā)展一類新的、合成步驟簡單的單分子人工離子通道。Figure 2-3. One-Step macrocyclizations mssisted by the folding and preorganization of precursor oligomers按照設計的合成路線，在合成過程中我們對個別反應的條件進行了微調(diào)，最終獲得了較成熟的、產(chǎn)率較高的合成路線。在該合成路線中，三肽的合成參考了組內(nèi)以前的路線。之后以化合物4為原料，與氯乙酰氯發(fā)生親核取代反應獲得化合物5。化合物與已有的二酚二甲酯發(fā)生雙邊取代

43、反應獲得化合物6，化合物6發(fā)生肼解反應獲得聚合物單體7。化合物7與二酰氯在DMAP做堿的條件下通過縮合反應一步成環(huán)就可得大環(huán)分子8(具體合成步驟見實驗部分)(Figure 2-4)。Figure 2-4. Synthetic protocols for 8.同以上反應類似，通過化合物7與間苯二甲酰氯之間的一步成環(huán)反應可得大環(huán)分子9。通過化合物7與萘二酰氯之間的一步成環(huán)反應可得大環(huán)分子10。將環(huán)狀分子8、9及10芳酰肼骨架上L-苯丙氨酸三肽側(cè)鏈端基的叔丁酯基水解為羧基即得目標分子M-1、M-2以及M-3(Figure 2-5)。Figure 2-5. Synthetic protocols fo

44、r M-1, M-2 and M-3.得到目標分子M-1至M-3后，我們通過1H NMR對目標分子結(jié)構(gòu)進行了研究，并結(jié)合組內(nèi)已有數(shù)據(jù)，表征結(jié)果均與目標分子結(jié)構(gòu)相符合。具體數(shù)據(jù)見文末實驗部分。2.2 芳酰肼大環(huán)分子M-1至M-3的嵌膜能力研究在確證了環(huán)狀分子M-1至M-3的結(jié)構(gòu)以后，我們進一步研究了它們的跨膜輸送性質(zhì)，主要是跨膜輸送質(zhì)子熒光實驗37，看此類分子能否嵌入磷脂雙層并實現(xiàn)質(zhì)子的跨膜輸送。我們在囊泡內(nèi)部包結(jié)熒光探針HPTS(8-hydroxypyrene-1,3,6- trisulfonate, 0.1 mM)。HPTS對pH非常敏感，pH發(fā)生微擾，探針熒光強度就會發(fā)生明顯變化，由此判斷

45、大環(huán)分子的嵌膜能力。實驗過程如下：以卵磷脂(EYPC)制備囊泡(LUVs)，控制囊泡內(nèi)部環(huán)境為pH=7.2。在熒光比色皿中加入100 L的囊泡儲備液和2 mL pH=6.0的磷酸鹽緩沖液。此時，熒光比色皿中囊泡內(nèi)外環(huán)境的pH不同，囊泡外部質(zhì)子濃度較高，質(zhì)子很難通過自由擴散穿過脂雙層進入囊泡，因此探針熒光強度不會有明顯變化（如圖所示DMSO空白實驗，F(xiàn)igure 3-7)。當在裝有同樣量囊泡儲備液和緩沖液的熒光比色皿中加入環(huán)狀分子M-1至M-3(0.03%, molar ratio relative to lipid, represented by x)后，我們發(fā)現(xiàn)HPTS熒光強度發(fā)生明顯的猝滅

46、。數(shù)據(jù)經(jīng)歸一化處理后發(fā)現(xiàn)，HPTS的相對熒光強度均有明顯上升，在8分鐘內(nèi)分別達到了81%、77%和57%(Figure 3-7)。此實驗證明環(huán)狀分子M-1至M-3具有良好的嵌膜能力，可以加快質(zhì)子通過脂雙層的速率。Figure 2-6. Changes in fluorescent intensity of HPTS (ex = 460 nm, em = 510 nm) in vesicles with time after addition of M-1, M-2 and M-3 (x = 0.03%).2.3 實驗部分實驗中用到的試劑均購自百靈威科技有限公司(J&K)、Alfa Aesar、

47、Sigma-Aldrich以及國藥集團化學試劑有限公司等化學試劑公司；實驗中所用到的溶劑均購自上海萊盈化工有限公司和國藥集團化學試劑有限公司；所有無水溶劑均購自Acros。以上所有試劑如未特別說明，均直接使用。1H NMR實驗使用Varain Mercury plus 400型核磁共振儀測定(298K)；熒光光譜數(shù)據(jù)使用CARY ECLIPSE 熒光分光光度計測得。化合物5的合成稱取2.0g三肽加入烘干的三頸瓶并連接帶氣球的三通和恒壓滴液漏斗，并置換氮氣。向三頸瓶中加入15mL無水DCM，向恒壓滴液漏斗中加入5mL。將反應體系放入冰浴中攪拌，待冷卻后，向三頸瓶中加入三乙胺1.89mL，再向恒壓

48、滴液漏斗中加入氯乙酰氯0.73mL。打開滴液漏斗旋鈕向反應體系中滴加氯乙酰氯，控制在20分鐘左右滴完。以TLC監(jiān)測反應。反應完成后將三頸瓶中的不溶物搗碎，并加入DCM稀釋，然后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，先用飽和氯化鈉溶液洗3次，然后用飽和碳酸氫鈉水溶液洗兩次，再用飽和氯化鈉溶液洗3次，有機相經(jīng)無水硫酸鈉干燥后旋干得粗產(chǎn)品，后經(jīng)柱層析分離得純品2.057g，收率89%。Yellow solid. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 7.29-7.15 (m, 10H), 7.08-7.03 (m, 5H), 6.46 (d, J = 7.2 Hz,1H), 6.32 (d, J = 7.6

49、Hz, 1H), 4.63-4.56 (m, 3H), 3.89 (q, J = 15.2 Hz, 2H), 3.05-2.96 (m, 6H), 1.38 (s, 9H).Figure 2-7. 1H NMR spectrum of 5 in CDCl3.化合物6的合成稱取二酚二甲酯(0.68 g, 3.0 mmol)、5(5.33 g, 9.0 mmol)、碳酸鉀(2.49 g, 18 mmol)以及碘化鉀(0.25 g, 1.5 mmol)加入到烘干的三頸瓶中，加入100mL乙腈溶解。在三頸瓶上連接回流冷凝管并接上帶氣球三通，置換氮氣后移入60度油浴反應。TLC監(jiān)測反應結(jié)束后，停止加熱，

50、旋干溶劑，使用水/DCM體系萃取，合并有機相，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后旋干。柱層析得白色固體，收率95%。Yield: 95%. 1H NMR (CDCl3): 8.69 (s, 1 H), 8.43 (d, J = 8 Hz, 2 H), 7.24-6.99 (m, 30 H), 6.86 (s, 1 H), 6.60 (d, J = 8 Hz, 1 H), 6.37 (s, 1 H), 6.31(d, J = 8 Hz, 2 H), 4.8 (m, 2 H), 4.66-4.58 (m, 4 H), 4.36 (m, 4 H), 3.95 (s, 6 H), 3.21 (d, J = 4 Hz,

51、 1 H), 3.18 (d, J = 4 Hz, 1 H), 3.10-2.92 (m, 10 H), 1.34 (s, 18 H).Figure 2-8. 1H NMR spectrum of 6 in CDCl3.化合物7的合成稱取6(1.34 g, 1.0 mmol)溶于EtOH/THF(20/30 mL)的混合溶劑中。加入水合肼(85%, 9.7 mL, 200 mmol)后置換氮氣，置于油浴50度反應24小時。反應有白色絮狀物產(chǎn)生。TLC監(jiān)測反應完成后，移除油浴靜置，抽濾，水洗，得白色固體。Yield: 45%. 1H NMR (DMSO-d6): 9.61 (s, 2 H), 8

52、.52-8.48 (m, 4 H), 8.32 (d, J = 8 Hz, 2H), 8.16 (s, 1 H), 7.28-7.03 (m, 30 H), 6.26 (s, 1 H), 4.61-4.56(m, 6 H), 4.42-4.37 (m, 8 H), 3.04-2.96 (m, 8 H), 2.82-2.65 (m, 4 H), 1.30 (s, 18 H).Figure 2-9. 1H NMR spectrum of 7 in DMSO-d6.化合物8的合成取烘干的50ml具支燒瓶，取出后密封并無水無氧處理，加入2-甲氧基異酞酸(2-Methoxyisophthalic aci

53、d)(1eq), 置換氮氣后，加入無水DCM，并加入1滴DMF，攪拌，取草酰氯(8eq)加入反應體系，室溫攪拌2-3小時，抽干溶劑，制得二酰氯備用。從干燥箱中取出50ml具支燒瓶，并做無水無氧處理，加入7(0.67 g, 0.5 mmol)、DMAP(122mg, 1.0 mmol), 置換氮氣后，加入無水二氯甲烷(20 mL)，并于冰鹽浴中攪拌。隨后取間苯二酰氯(0.12 g, 0.50 mmol)溶于無水二氯甲烷(10 mL)中，將此溶液在冰鹽浴下逐滴加至含有化合物7的反應瓶中，加入完畢后維持冰鹽浴2小時。待反應體系自然回至室溫后，移入油浴回流反應24小時。反應結(jié)束后，旋干溶劑后，固體殘渣

54、重新溶于二氯甲烷中(50 mL)，并用稀鹽酸洗(0.5 M, 50 mL)、水洗(50 mL)，最后用飽和食鹽水洗(50 mL)。所得有機相經(jīng)無水硫酸鈉干燥后旋干。柱層析得化合物8，白色固體 (0.47 g, 63%)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 10.45-10.39 (m, 10H), 8.51-8.33 (m, 20H), 7.74-7.70 (m, 6H), 7.22- 7.07 (m, 96H), 6.33-6.29 (m, 3H), 4.68-4.34(m, 30H), 4.01 (s, 6H), 3.9 (s, 3H), 3.04-2.96 (m, 24

55、H), 2.80-2.67 (m, 12H), 1.28 (s, 54H).Figure 2-10. 1H NMR spectrum of 8 in DMSO-d6.化合物9的合成化合物9由化合物7和間苯二甲酰氯反應制得，具體實驗步驟參見化合物8。白色固體，收率51%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 10.80 (s, 5H), 10.38 (s, 5H), 8.55-8.14 (m, 29H), 7.66-7.64 (m, 3H), 7.22-7.07 (m, 93H), 6.25 (br, 3H), 4.65-4.33(m, 30H), 3.02-2.94 (m, 2

56、4H), 2.75-2.67 (m, 12H), 1.27 (s, 54H).Figure 2-11. 1H NMR spectrum of 9 in DMSO-d6.化合物10的合成化合物10由化合物7和化合物萘二酰氯反應制得，具體實驗步驟參見化合物8。白色固體，收率59%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 10.93 (s, 5H), 10.44 (s, 5H), 8.68-8.14 (m, 41H), 7.20-7.07 (m, 90H), 6.35 (br, 3H), 4.66-4.34(m, 30H), 2.99-2.94 (br, 24H), 2.74 (br,

57、12H), 1.26 (s, 54H).Figure 2-12. 1H NMR spectrum of 10 in DMSO-d6.化合物M-1的合成在烘干的圓底燒瓶中加入11(90 mg, 0.020 mmol)，DCM(10 mL)，TFA(1 mL)。室溫攪拌24小時。反應結(jié)束后減壓除去溶劑，固體殘渣用乙醚反復抽濾洗滌，最后用乙醇重結(jié)晶得到淺黃色固體(73 mg, 88%)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 12.81 (s, 6H), 10.46-10.41 (m, 10H), 8.54-8.33 (m, 20H), 7.73-7.67 (m, 6H), 7.22-

58、7.07 (m, 96H), 6.31-6.27 (br, 3H), 4.65-4.31(m, 30H), 4.01 (s, 6H), 3.90 (s, 3H), 3.08-2.89 (m, 24H), 2.77-2.67 (m, 12H).Figure 2-13. 1H NMR spectrum of M-1 in DMSO-d6.化合物M-2的合成化合物M-2由化合物12合成，其合成步驟參照化合物M-1。淺黃色固體，收率84%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 12.80 (br, 6H), 10.80 (s, 5H), 10.38 (s, 5H), 8.56-8.14

59、 (m, 29H), 7.66-7.65 (m, 3H), 7.21-7.05 (m, 93H), 6.25 (br, 3H), 4.65-4.33(m, 30H), 3.07-2.91 (m, 24H), 2.76-2.71 (m, 12H).Figure 2-14. 1H NMR spectrum of M-2 in DMSO-d6.化合物M-3的合成化合物M-3由化合物13合成，其合成步驟參照化合物M-1。淺黃色固體，收率91%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 12.78 (br, 6H), 10.91 (s, 5H), 10.44 (s, 5H), 8.68-8.

60、15 (m, 41H), 7.21-7.07 (m, 90H), 6.35 (br, 3H), 4.66-4.36(m, 30H), 3.03-2.92 (m, 24H), 2.74 (br, 12H).Figure 2-15. 1H NMR spectrum of M-3 in DMSO-d6.參考文獻1 Lehn, J. M. Pure Appl. Chem. 1978, 50, 871.2 Nobel Lecture: a) Lehn, J. M. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1988, 27, 89. b) Cram, D. J. Angew. Chem.