1、本文檔來源于第一文庫網： HYPERLINK /news/AF4E342D1187081C.html /news/AF4E342D1187081C.html 幾種表達系統的比較生物技術通報綜述與專論 BIOTECHNOLOGY BULLETIN2002 年第2 期幾種表達系統的比較吳丹 仇華吉 童光志（中國農科院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室,哈爾濱 150001） 摘 要 : 隨著蛋白質工程和 DNA 重組技術的發展 , 許多有應用潛力的蛋白分 子有待開發。不同蛋白在不同系統中表達水平有顯著差異,所以選擇一種合適的表 達系統對蛋白表達水平非常關鍵。對細菌、酵母、昆蟲桿狀病毒、哺乳

2、動物細胞4 種表達體系作一概述,并討論各自優缺點及常見問題。關鍵詞: 表達系統 大腸桿菌 酵母 昆蟲細胞 哺乳動物細胞ComparisonofSeveralExpressionSystemsWuDan QiuHuaji TongGuangzhi (NationalKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnologynVeteriResearchInstitute ChineseAcademyofAgricultSciencesAbstract:Withthedevelopmentofrecombinant,manytypesofproteinthathavepotent

3、ial valuesneedtobeproduced.expressonlevelsamongdifferentproteinex2pressio nsystems.Soitscriticaltosystemforproteinproduction.Thisreviewwillsum2m arizetheadvantagesand,insectandmammalianexpressionsystems,andalsodis cussthesolutionstoKeywords Ecoli Yeast Insectcells Mammaliancells 隨著生物化學和分子生物學技術的發展,使人

4、們得以更深入地了解蛋白質分子 的一級和二級結構,這樣就可以有目的的進行改造,創建新的有價值的蛋白質分子。 為此,各種不同的表達體系應運而生,如細菌1、昆蟲細胞2、酵母3、哺乳動物 細胞表達系統等。ATG 和 SD 序列,其在 SD 序列的位置和大小影響蛋白翻譯效率。SD序列由3 9核苷酸組成,位于起始密碼子上游3 11核苷 酸處。另一個重要調控本文檔來源于第一文庫網： HYPERLINK /news/AF4E342D1187081C.html /news/AF4E342D1187081C.html元件是轉錄終止子，它可以防止轉錄超出目的基因,并增加DNA分子穩定性。1.2 蛋白的加工 在原核細

5、胞胞漿的還原環境中表達的蛋白可形成不溶性包涵體,其中含有未折 疊的蛋白。這就需要采用再折疊的方法恢復蛋白活性。再折疊策略很多,需要針對 特定蛋白進行優化。大多策略包括分離包涵體、增加蛋白質的溶解度、在適當環境 下復性以形成正確的二硫鍵和恰當的空間構象。聚合體形成是在再折疊過程中要克 服的首要問題之一,通過降低再折疊混合物的濃度可使之降低至最小程度。另外,添 加增加穩定性的共溶劑(co-solven ts),如精氨酸，也可以促進再折疊過程。在錯折疊 和未折疊的蛋白中共溶劑排斥的空間比天然的分子大,可促進分子的正確折疊。任何再折疊策略都需要優化許多重要參數,包括再折疊的溫度、蛋白的濃 度、共大腸桿

6、菌表達體系大腸桿菌(E.coli)表達系統的優點是產量高、生長速度快、操作容易、成本低，其缺點是不能對表達蛋白進行糖基化修飾。 1.1 啟動子等元件 為獲得成功的表達,蛋白編碼基因上下游需有合適的序列,確保蛋白有效轉錄和翻譯。用于控制蛋白表達的關鍵元件是啟動子。常用的啟動子有入PLIac、trp啟動子或其復合物，以及入PL啟動子。啟動子專司入DNA分子的 轉錄,受溫敏阻遏物調控。T7RNA啟動子可用于嚴格調控的高水平表達。原核生物的核糖體結合位點(RBS)是E.coli有效轉錄的第二個重要元件。 它包括起始密碼子2002年第2期 吳丹等:幾種表達系統的比較 31 溶劑和氧還偶的存在、反應的 p

7、H 值等。1.3 蛋白的分泌 采用前導序列可將蛋白直接分泌到細菌的周質腔隙中。常用的前導序列有pelB前導序列(來自Erwiniacarotocora的果膠酸鹽裂解酶基因)和衍生于堿性磷 酸酶基因的前導序列。有時周質中的重組蛋白通過外膜“滲漏“到培養基中,這主 要決定于蛋白的氨基酸序列等,而非信號序列31。表達產物分泌到培養基中有利 于快速篩選,當產物產量很高時,可以從培養基上清中直接純化。如果在上清中沒有 發現產物,就需要從周質浸出物中分離蛋白,通常通過溶解的方法。本文檔來源于第一文庫網： HYPERLINK /news/AF4E342D1187081C.html /news/AF4E342

8、D1187081C.html細菌是一個重要的表達體系,特別對于不需糖基化的蛋白,并且表達水平很高。 但由于原核細胞表達體系簡單,所以有其局限性,只適合少數蛋白。常需要富含 A 的序列,如可有效啟動翻譯的基序 AAAAAAATG。該表達體系對于外源基因序列的內在特性要求嚴格,A+T的含量在30 55%, 密碼子的使用也具有選擇性5。2.2 蛋白的修飾與加工在制訂外源蛋白分泌表達策略時,可利用外源蛋白的天然信號肽來促成重組蛋 白的分泌,但有比較研究表明,利用外源蛋白的天然信號肽引導表達的重組蛋白較易 降解,而利用酵母蛋白信號肽引導表達的外源蛋白較為穩定23。通常采用S.cerevisi2aea-M

9、F、PichiaPastorisS.cerevisiaeSUC2。6。，其中包括 N-,相比 之下,酵母所加。新型酵母 PichiaPastoris酵母表達量很高，特別是新型酵母PichiaPas27toris的產量可達100 250mg/L。破傷風毒素片段C的表達量達到 12g/L25。酵母可進行高密度發酵培養，在發酵罐中細胞干重可達120g/L。兔抗 人的白血病抑制因子抗體在PichiaPastoris中表達量比在E.coli中增加100倍。 PichiaPastoris分泌的某些蛋白有多糖基化現象，如HIVgp12026,27。目前，對于 糖鏈的添加機制還知之甚少。 PichiaPast

10、oris 發酵培養產量高,但也有不盡人意之 處。目的蛋白產量增加的同時,也提高了其它細胞分泌的濃度,特別是蛋白水解酶。 在此環境下,有些蛋白穩定,而另一些蛋白則特別容易被降解。通常采用三種方法解 決:(1)補加氨基酸豐富的培養基,如蛋白胨或酪蛋白氨基酸,使其作為蛋白水解酶的底 物，以減少表達產物的降解28。(2)改變培養基的pH值16,PichiaPastoris可在 pH3 7的范圍內生長，可將pH值調至蛋白水解酶活性區間之外。例如表a達 YNAGAL時就是通過維持pH5.5使產物保持穩定,而表達mEGF時則是通過維持 pH6.0和添加1%酪氨酸蛋白水解物以增加產量。使用蛋白水解酶基因缺陷的

11、 PichiaPastoris宿主菌(SMD1168),如在表達乳糖酶時，使用SMD1168較之正常受 體菌GS115表達量提高2倍29。酵母表達體系。腸桿菌不同的是,當,然后分泌到培養基中;,酵母可以在簡單培養基中迅速生 長。可用酵母發酵技術對臨床和工業上有用的重要蛋白進行了工業化生產。目前抗 體及其片段都用該系統進行了表達4。它還可以表達幾乎所有植物蛋白。在大腸 本文檔來源于第一文庫網： HYPERLINK /news/AF4E342D1187081C.html /news/AF4E342D1187081C.html 桿菌中以包涵體形式出現的蛋白,在酵母中表達時可生成可溶性蛋白3,另外,該

12、系統 可以克服異源蛋白降解問題。2.1 轉錄、轉譯調控元件要使生長階段和誘導階段分開,啟動子的嚴格調控至關重要,特別是表達有毒性 的毒素蛋白,否則在生長階段會殺死宿主細胞。異源的啟動子在酵母中無效,只有酵 母的啟動子才能用于表達外源基因。常用的啟動子有 GAL1、GAL7、GAL5、 AOX1 啟動子,可被葡萄糖所抑制和被半乳糖或甲醇所誘導。許多選擇性標記可用 于轉化子的篩選，包括HIS4和抗生素Zeocin等。酵母的轉錄終止過程近似于高等 真核生物,包括轉錄終止、內切核苷酸加工、多聚腺苷酸化。在酵母中,5端非翻譯區的二級結構和過高的G含量可抑制翻譯的起始。起始 密碼子ATG前通生物技術通報

13、32昆蟲細胞表達體系Biotechnology Bulletin2002 年第2期除了以桿狀病毒介導的昆蟲細胞表達體系外,又開發比較新型的穩定轉化系統, 用于大量制備具有功能活性的目的蛋白8,9。其表達水平高于哺乳動物細胞表達 系統,并且在表達真核蛋白時,可以對其進行翻譯后修飾,其優越性遠超過細菌表達體 系。 3.1 桿狀病毒和宿主細胞在典型的桿狀病毒載體中,外源基因由強大的多角體啟動子所控制,以確保基因 高水平轉錄,便于重組病毒的篩選,并且可將重組蛋白大量分泌至培養液中。常用的 桿狀病毒是Autographacaliforni2ca多核型多角體病毒(AcNPV)和家蠶 (Bombyxmori

14、)多核型多角體病毒(BmNPV)。宿主細胞通常來源于雙翅目昆蟲，包 括果蠅、蚊子。其中有Schneider2和從Drosophilamelanogaster中衍生的 Kc。來源于Spodopterafrugiperda的是最常用的宿主細胞10。3.2翻譯后的 修飾、 ,雖然糖,但寡糖鏈的性質有所不同,這可能是由于昆蟲細胞不能將成熟糖鏈加 工成哺乳動物細胞中那樣的形式11。桿狀病毒表達載體的翻譯后修飾還有磷酸 化、酰化、十六烷基化。曾有報道說，某些蛋白如乙肝表面抗原(Hb2sAg),在桿狀病 毒中表達時還可被十四烷基化。蛋白前體的水解也很重要,雖然哺乳動物的蛋白分 泌信號在昆蟲細胞中能被正確加工

15、,但其它蛋白裂解位點在昆蟲細胞培養物中不能 夠有效地或根本不能被識別12。 3.3 誘導表達桿狀病毒表達體系能夠方便、快 捷地表達外源蛋白,但主要缺點是外源蛋白表達受病毒晚期啟動子的控制,蛋白產量 本文檔來源于第一文庫網： HYPERLINK /news/AF4E342D1187081C.html /news/AF4E342D1187081C.html 出現峰值時,細胞卻由于病毒感染而即將死亡。Drosophilamelanogaster金屬硫 因啟動子是常用啟動子，研究表明該啟動子受到嚴格調控，當用重金屬（如Cd、Cu）誘 導時，可實現高水平轉錄。雖然Cd可能有毒性，但添加少量Cd誘導時可將

16、表達量 提高30 100倍。抗生素如新霉素、潮霉素抗性基因被用作選擇性標記，可與外源 基因進行共轉染。桿狀病毒表達體系能夠高效表達目的蛋白。曾有報道說,每升感染的昆蟲細胞 中重組蛋白可達1 500mg13。一種抗E-選擇素的sFv在該系統中表達時培養 基上清可達到0.2 0.4mg/L水平,而在細菌表達系統中，無論在培養基上清中還是 可溶性周質浸出物中,均未檢測到該蛋白的表達。外源蛋白的表達取決于許多因素, 優質培養和精心培養是必要的。要取得最佳結果,昆蟲細胞必須富有活力并處于對 數生長期。昆蟲細胞對氧需求很大,攪動是必要的,但又是危險的,因為攪動過程對高 度敏感的細胞形成很大壓力。所要表達的

17、基因本身的特性是一個不容忽視的因 素,14,154效地識別。因為在哺乳動物細胞內質網中有完善的再折疊機構,也可以 對蛋白分子進行糖基化,因此適于表達完整的大分子蛋白。載體的選擇取決于外源 基因導入哺乳動物細胞的方法和用來高效表達mRNA和合成蛋白的調控元件。有 兩種方法可將外源基因導入哺乳動物細胞:一種是病毒感染介導的,另一種是用化學 方法（如脂質體法、磷酸鈣法、 DEAE 沉淀法）和物理方法（如電轉化法和微注射法） 將DNA直接導入細胞中。4.1 轉錄、轉譯調控因素轉錄調控元件（如啟動子、增強子）的效率在不 同細胞系中有很大差異。啟動子是影響外源基因表達效率的關鍵元件。因為細 菌的啟動子和增

18、強子在動物細胞中不起作用,所以該系統調控元件大多分離自啟動 效率高而且生物背景清楚的病毒基因組。其中 SV40、 AdMLP、 LTR、 CMV 在 CHO中效果較好。另一個轉錄元件是位于TATA框上游100 200bp處的增強子, 能增強轉錄起始速率。許多基因的另一個元件是mRNA帽子上游多拷貝的GC富 含區。只有將順式作用元件合理、有效地構建至表達栽體,才能達到高效表達。在哺乳動物細胞中表達的所有克隆基因都包含核糖體結合位點和起始密碼子。 真核核糖體靠識別序列GCCGCCA/GCCAUGG+416,17啟動翻譯,1 2002年第2期吳丹等:幾種表達系統的比較336位的核苷酸位置及+4位的G

19、對克隆基因有效翻本文檔來源于第一文庫網： HYPERLINK /news/AF4E342D1187081C.html /news/AF4E342D1187081C.html譯都很重要。增強子可用于增強表達,許多增強子受細胞類型的限制。像SV40、CMV和勞斯肉瘤病毒的LTR在許多類型細胞 中都有活性,只是表達量有差異。在啟動子確定的情況下,可通過引入指導前體 mRNA合成的內含子序列、促進mRNA翻譯的序列、拼接一個信號前導肽、解決 密碼子偏愛性等途徑來提高表達水平30。 4.2 用于表達的細胞系穩定細胞系的 篩選比較費時。瞬時表達系統可作為遺傳工程構建是否正確的早期指征。基因工程 嵌合抗體通

20、常用COS細胞進行瞬時表達18,19。病毒轉染的CHO-K1細胞系通 常也用于蛋白的瞬時表達20。采用導源啟動子、增強子和可擴增的遺傳標記,可 提高蛋白產量。一般選擇的遺傳標記是一些便于分析的、，E.coli的LacZ基因 比較了表達Ig物細胞表達體系22,二氫葉酸的中國倉鼠卵巢細胞系(CHO)和谷氨 酰胺的鼠NSO骨髓瘤細胞合成酶系統可產生相同產量的抗體，但在CHO細胞中抗體基因拷貝數和可選擇標記基因 的拷貝數高于NSO細胞。4.3存在的問題目前該系統存在的問題有:(1)產率低;(2)某些糖基化產物不穩定、不易純化;(3) 重組細胞上游與下游工作脫節,構建時著重考慮它的高效表達,而對表達產物

21、是否能 有效地純化則考慮較少;(4)費用昂貴,自動化水平低。結語,它們有各種的優缺點(見表1)。 ,如、是否是毒、是否需大量表達、如。每種 蛋白的表達都會遇,沒有通用的表達系統可用。有些蛋白表達量本身就少,這就需要 研究者在表達特定蛋白分子時優化實驗條件或對蛋白基因進行特殊改造以提高表達 量。表 1 各種表達體系的特性比較表達體系原 大腸桿菌核體系 酵母甲醇營養型真酵母核體昆蟲細胞系哺乳動物細胞系統優缺點具有良好的可操作性,成本低,但不能進行糖基化修飾,胞內形成包涵體本文檔來源于第一文庫網： HYPERLINK /news/AF4E342D1187081C.html /news/AF4E342

22、D1187081C.html兼具原核細胞良好的可操作性和真核系統的后加工能力,但存在產量低及過度 糖基化等問題第二代酵母表達系統,部分克服了過度糖基化缺點,有較好的分泌性,產量較高,但 產物結構與天然分子仍有一些差異。具有高等真核生物表達系統的優點,產物的抗原性、免疫原性和功能與天然蛋 白質相似,表達水平較高,但糖基化程度較低,形式單一。產物的抗原性、免疫原性和 功能與天然蛋白質最接近,糖基化等后加工最準確,但表達水平較低。產量夕卜源蛋白10% 70%胞內表達,0.3% 4%胞外表達外源蛋白約占菌體總蛋白的10%夕卜源蛋白占菌體總蛋白的10 30%夕卜源蛋白占菌體總蛋白的1 500mg/L發酵

23、液中表達產物含量為0.2 200mg/L參考文獻B,etterM,ChangCP,RobinsonRR,etal.Science,1988,240:1041.BeiR,SchlomJ,KashmiriSV.JImmunolMethods,1995,186 245.RidderR,SchmitzR,LegayF,etal.Bio/Technology,1995,13:255.WoodC,BossMA,KentenJH,etal.Nature,1985:314 446.生物技術通報345彭毅，楊希才,康良儀生物技術通報,2000(4):33 36.Biotechnology Bulletin200

24、2 年第 2 期252:7163.ColcherD,MilenicD,RoselliM,etal.CancerRes,1989:49,1738.PeakmanTC,WordenJ,HarrisRH,etal.HumAntibodiesHy2bridomas,1994,5:65.本文檔來源于第一文庫網： HYPERLINK /news/AF4E342D1187081C.html /news/AF4E342D1187081C.htmlFarraressL,TrainottiL,GattolinS,etal.FEBSlett,1998,422:23-26.TschoppJF,SverlowG,Kos

25、sonR,etal.Bio/Technology,1996,5:1305- 1308.ClareJJ,RaymentFB,etal.Bio/Techmology,1991,9:455 -460.ScorerCA,BuckholzRG,ClareJJ,etal.Gene,1993,136:111KukuruzinskaMA,BerghMLE,KacksonBJ.AnnuRevBiochem, 1987,56:915.EldinP,PauzaME,HiedaY,etal.JimmunolMethods,1997, 201:67.HasemannCA,CapraJD.ProcNatlAcadSciU

26、SA,1990,87:3942.9 ZuPutlitzJ,KubasekWL,DucheneM,etal.BioTechnology,1990,8:651.10 SummersMD,SmithGE.TexAgricExpStationBull,1987,56.11HseihP,RobbinsPW.JBiolChem,1984,259:2375.12KurodaK,HauserC,RottR,etal.EMBOJ,1986.5:1359.13LuckowVA,SummersMD.Virology,1989,170:31.14EllisL,LevitanA,CobbMH,etal.JVirol,1

27、988,62:1634.15GreenfieldC,PatelG,ClarkS,etal.EMBOJ,1988,7:169.16 KozakM.JMolBiol,1987,196:947.17 KozakM.JCellBiol,1989,108:229.18 WhittleN,AdairJ,LloydC,etal.ProteinEng,1987,1:499.19DaughertyBL,DeMartinoJA.LawMF,etal.NucleicAcidsRes,1991,19:247120 CockettMI,BebbinftonCR,Yarranton,- 119.ScorerCA,Clar

28、eJJ,McCombie,etal.Bio/Technology,1993,12:181- 184.JJ,etal.Gene,1991,105:,32:425- 430.本文檔來源于第一文庫網： HYPERLINK /news/AF4E342D1187081C.html /news/AF4E342D1187081C.html，生物工程進展,2000,20(4):23 25.I,KarpM,LahdeM,etal.Gene,1987,61:161.(上接第 29 頁)GilbertHJ,HazlewoodGP.JGenMicrobiol,1993,139:187 194.5 TayaM,etal.JFermentTechnol,1979,57:178 182.6 陳華癸.土壤微生物學,北京: 農業出版社,1985.7 GoyalA,GhoshB,EveleighD.BioresTechnol,1991,36:31 50.8 WikeCR,MaiorellaB,SciamanaA,etal.NewJersey,1983.9 DrewSW,KadamKL,Dev.IndMicrobiol,1979,20:153 181.10 周慧明.木材防腐. 北京:中國林業出版社,1988.11 DumlapCE.ArcheSympSe