1、關于代謝控制發酵第1頁，共21頁，2022年，5月20日，18點53分，星期四代謝控制發酵的定義 它是利用遺傳學或其它生物、物理、化學方法，人為地在脫氧核糖核酸（DNA）的分子水平上，改變和控制微生物的生長代謝途徑，使有用的代謝產物大量生成、積累的發酵技術。最早在氨基酸發酵中得到成功應用。第2頁，共21頁，2022年，5月20日，18點53分，星期四代謝調節機制微生物細胞的調節機制酶合成的調控（轉錄水平上的調節） 誘導促進酶的合成 阻遏抑制酶的合成（包括終產物阻遏和分解代謝物阻遏） 第3頁，共21頁，2022年，5月20日，18點53分，星期四代謝調節機制酶活性的調控 一定數量的酶通過其分子結

2、構的改變來調節催化反應的速率。 控制機制：終產物抑制或激活；通過輔酶水平的活性調節；酶原的活化；潛在酶的活化細胞膜滲透性的控制 根據酶在代謝調節中作用不同分為：調節酶（變構酶、同功酶、多功能酶）、靜態酶和潛在酶。第4頁，共21頁，2022年，5月20日，18點53分，星期四代謝控制發酵的基本思想 切斷支路代謝選育營養缺陷型突變株 原菌株由于發生基因突變，致使合成途徑中某一步驟發生缺陷，從而喪失了合成某些物質的能力，必須在培養中外源補加該營養物質才能生長的突變型菌株。 最典型例子：高絲氨酸營養缺陷型或蘇氨酸營養缺陷型菌株達到賴氨酸的積累。第5頁，共21頁，2022年，5月20日，18點53分，星

3、期四代謝控制發酵的基本思想選育滲漏缺陷突變株 遺傳性障礙不完全的缺陷型。 （注：這種突變只是其中某一種酶的活性降低，而不是完全喪失。不能合成過量的最終產物，故不會造成反饋抑制而影響中間代謝產物的積累。）第6頁，共21頁，2022年，5月20日，18點53分，星期四代謝控制發酵的基本思想 解除菌體自身的反饋調節選育抗類似物突變株（代謝拮抗物抗性突變株）形成途徑：變構酶結構基因突變；調節基因突變。酶活性的利用營養缺陷型回復突變株的應用 調節酶的失活與否，可能直接表現為某種營養缺陷型。可以采用回復突變的方法，從回復突變株中獲得多途徑中的調節酶接觸反饋調節的調節突變株。第7頁，共21頁，2022年，5

4、月20日，18點53分，星期四代謝控制發酵的基本思想 增加前體物的合成 通過選育某些營養缺陷型或結構類似物抗性突變株以及克隆某些關鍵酶的方法，增加目的產物的前體合成，有利于目的產物的大量積累。去除終產物特殊調節機制的利用：多種產物控制機制的利用平衡合成的利用代謝互鎖的利用優先合成的變換。條件突變株的應用選育不生成副產物的菌株選育生產代謝拮抗物質的菌株 第8頁，共21頁，2022年，5月20日，18點53分，星期四 微生物代謝控制發酵的措施應用營養缺陷型菌株。選育抗反饋調節的突變株。 即已解除了反饋調節作用的突變株。因為反饋抑制和阻遏，或兩者引起的自動調節作用已被削弱或解除，所以能合成較多的最終

5、產物。選育細胞膜通透性突變株：使終產物在細胞內不能大量積累而引起反饋調節。利用營養缺陷型回復突變株或條件突變株的方法，解除終產物對關鍵酶的調節。應用遺傳工程技術，創造理想的超微生物（構建目的工程菌株）。發酵的環境條件的優化。 第9頁，共21頁，2022年，5月20日，18點53分，星期四發酵條件控制當菌株選育確定后，環境條件的合適與否是發酵成敗的重要因素。環境條件既影響微生物生長，又影響代謝速度和方向及產物的形成和積累。影響發酵過程的因素很多，如溫度、pH、通風、攪拌、罐壓力、溶氧量等，必須適當控制各種條件，掌握發酵動態，是整個發酵過程順利進行。例如谷氨酸棒桿菌發酵，可以通過控制發酵條件包括O

6、2濃度、NH4濃度、pH、磷酸鹽濃度、生物素濃度等，轉換代謝方向，使其不生成Glu，而生成乳酸、a-KGA、琥珀酸、谷酰胺等產物。第10頁，共21頁，2022年，5月20日，18點53分，星期四氨基酸的代謝控制與發酵（以Lys生產為例）賴氨酸第11頁，共21頁，2022年，5月20日，18點53分，星期四氨基酸的代謝控制與發酵（以Lys生產為例）切斷或減弱支路代謝切斷支路代謝：選育和應用營養缺陷型菌株，切斷丙氨酸、蘇氨酸和蛋氨酸的分支途徑以積累Lys。變換優先合成： 滲漏缺陷型的選育（高絲氨酸滲漏突變株）降低HD酶（高絲氨酸脫氫酶）活性：增強代謝流 從優先合成Met和Thr轉向合成Lys，Me

7、t和Thr 、Thr合成減少，解除了Thr+Lys的協同反饋抑制。第12頁，共21頁，2022年，5月20日，18點53分，星期四氨基酸的代謝控制與發酵（以Lys生產為例）解除反饋抑制 選育抗結構類似物突變株解除AK酶的反饋調節 通過誘變，使編碼AK酶（天冬氨酸激酶）的結構基因發生突變，使AK酶對Lys及結構類似物不敏感，即使蘇氨酸過量，該激酶也不與Lys或類似物結合。解除PS酶的代謝調節解除代謝互鎖：賴氨酸與亮氨酸的生物合成之間存在代謝互鎖，應考慮選育亮氨酸缺陷型，抗亮氨酸結構類似物突變株。第13頁，共21頁，2022年，5月20日，18點53分，星期四氨基酸的代謝控制與發酵（以Lys生產為

8、例）去除終產物 選育細胞膜通透性突變株，解除反饋調節。選育生物素缺陷型。 生物素是脂肪酸合成中CoA的輔酶。選育生物素缺陷型阻斷生物素合成并限制外源供應量，導致磷脂含量不足，細胞膜結構不完整。選育油酸缺陷型。選育甘油缺陷型。選育溫度敏感性突變株。第14頁，共21頁，2022年，5月20日，18點53分，星期四氨基酸的代謝控制與發酵（以Lys生產為例）增加前體物的合成 反饋抑制（調節）并不意味著完全阻止合成反應，通過受控制反應物的第五積累能拮抗性地克服這種抑制，關鍵酶AK所催化的底物Asp（天門冬氨酸），AK酶的反應速度與底物Asp濃度間的關系呈S型，隨著Asp的增多，AK酶和Asp親和力協同性

9、地增大。根據變構酶S型動力學性質，應設法增加前體物質Asp 的濃度，以抵消變構抑制劑的影響。可以選育丙氨酸缺陷型，抗Asp 結構類似物的突變株。第15頁，共21頁，2022年，5月20日，18點53分，星期四氨基酸的代謝控制與發酵（以Lys生產為例）選育溫度敏感突變株 其突變位置發生在亮氨酸合成酶系，高絲氨酸脫氫酶或丙酮酸-L-氨基酸轉氨酶編碼的基因中，均有利于積累Lys缺陷型。第16頁，共21頁，2022年，5月20日，18點53分，星期四氨基酸的代謝控制與發酵（以Lys生產為例）利用細胞工程和基因工程技術構建賴氨酸工程菌株細胞融合選育高產Lys菌株 操作步驟如下：第17頁，共21頁，202

10、2年，5月20日，18點53分，星期四0.3g/mLPenicilian（31，90分鐘）Centrifugation收集菌體，高滲洗滌后，懸浮于高滲溶液中300g/mLLysozyme（31.5靜止21h）ProtoplantA等量混合離心33%PEG6000+0.1M CaCl2處理，36，15min進行融合，融合反應液離心后，收集融合原生質體懸浮于pH10.5高滲溶液中移植到（涂布）選擇固體瓊脂培養基上的高滲軟瓊脂層中31.5，培養14天記Fusant融合子產酸和遺傳標穩定性測定液體搖瓶10-15次AJ11794 （生長快，耗糖速率高3倍，發酵時間縮短1/3，L-Lys產量維持不變）Gl

11、u產生菌 AJ11638 DECr（德夸香素） KMr（酮丙二酸）對數期細胞 A蛋白胨1%、酵母1%NaCl 0.5%、蔗糖0.5%PH7.0 31.5Lys產生菌AJ11082（低葡萄糖消耗速率）AECr、CLLr、MLr、FPs、L-Ala- 對數期細胞 BProtoplant B懸浮于高滲溶液（pH10.5,0.1M CaCl2）第18頁，共21頁，2022年，5月20日，18點53分，星期四氨基酸的代謝控制與發酵（以Lys生產為例）重組DNA技術選育高產Lys菌株 Renerend將E.coli的Lys生物合成途徑中Asp-半醛（ASA）脫氫酶，二氫吡啶2、6二羧酸（DDP或Ps）合成酶，PPP還原酶和二氨基庚二酸（DAP）脫羧酶的基因Asd,dapA,dapB,LysA從染色體上切下，分別連接到拷貝數高的質粒PBR322上，配制成雜種質粒PADI PDA1 PDB2 PL