1、5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate (5-漠-4-氯-3引哚基-磷酸鹽)，BCIP/NBT (四唑硝基 藍(lán))是堿性磷酸酶底物，產(chǎn)物為深藍(lán)色，在堿性磷酸酯酶的催化下，BCIP被水解，水解產(chǎn)物 與NBT發(fā)生反應(yīng)，形成不溶性的深藍(lán)色至藍(lán)紫色的NBT-formazan。使用方法在膜或組織切片，最后一次洗滌完畢后，加入適量BCIP/NBT染色工作液室溫避光孵育5-30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間(可長(zhǎng)達(dá)24小時(shí))，直至顯色至預(yù)期深度.用蒸餾水洗滌1-2次即可終止顯色反應(yīng)膜標(biāo)本可干燥后避光保存；組織切片或細(xì)胞樣品，顯色反應(yīng)終止后，可以用中性紅復(fù)染 染色干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)的常用染色方法有

2、幾種堿性磷酸酶(ALP)是成熟成骨細(xì)胞的標(biāo)志性酶，同時(shí)成骨細(xì)胞形成的鈣結(jié)節(jié)也是成骨細(xì)胞 的標(biāo)記物。成骨細(xì)胞染色方法 以ALP為目標(biāo)物的檢測(cè)方法：1 Gomori鈣鉆法【染色原理】ALP在pH值9.4的環(huán)境下，以鎂離子作為激活劑，能夠把8 -甘油磷酸鈉水解出磷酸，磷酸 與高濃度的鈣鹽結(jié)合形成無(wú)色的磷酸鈣，再與硝酸鉆作用形成磷酸鉆，經(jīng)硫化胺處理形成黑 色的硫化鉆沉淀在酶活性處。【孵育液配制】3%8 -甘油磷酸鈉5ml2%巴比妥鈉5ml蒸餾水10ml2% CaCl2 10ml2% MgSO4 1ml【步驟】將無(wú)菌的玻片放入培養(yǎng)皿中，傳代時(shí)加入適量的細(xì)胞懸液，作細(xì)胞爬片，呆細(xì)胞長(zhǎng)滿 玻片后取出。PBS

3、沖洗后用冷丙醇固定10min，蒸餾水沖洗數(shù)次。入孵育液中，37C孵育4-6h。自來(lái)水沖洗數(shù)次。2%硝酸鉆中浸3-5min，蒸餾水洗數(shù)次。1%的硫化銨中2min，自來(lái)水沖洗，自然干燥，封固。【結(jié)果】胞質(zhì)中陽(yáng)性反應(yīng)呈現(xiàn)灰黑色顆粒或塊狀沉淀。2偶氮偶聯(lián)法：【孵育液配制】萘酚AS-BI磷酸鹽20mgDMSO 0.5ml0.2mol/L巴比妥醋酸緩沖液(PH 9.2) 50ml六偶氮副品紅0.5ml1mol/L NaOH調(diào)PH 9-10，混合后過(guò)濾使用。(六偶氮副品紅：副品紅400mg，濃鹽酸2ml，雙蒸水8ml混合過(guò)濾；臨用前與等體積4% 亞硝酸鈉混合)【步驟】干細(xì)胞爬片成功后，PBS沖洗后，置入4C

4、10%甲醛固定10min。蒸餾水沖洗。將過(guò)濾孵液直接滴加于玻片上，室溫下作用45min。流水沖洗，晾干。甘油明膠封固。【結(jié)果】成骨細(xì)胞胞質(zhì)中可見紅色ALP陽(yáng)性顆粒。3堿性磷酸酶染色試劑盒法：【作用原理】干細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶在Ph9.4-9.6條件下水解磷酸萘酚AS-MX產(chǎn)生萘酚，后 者被重氮鹽捕獲，生成不溶性有色沉淀。【作用液配制】取2號(hào)儲(chǔ)備液10ml，加3號(hào)液200ul，再加4號(hào)粉劑10mg，振搖速溶，立即過(guò)濾到細(xì)胞爬 片上。【步驟】細(xì)胞爬片滴加數(shù)滴1號(hào)液，室溫固定一分鐘(不可以延長(zhǎng))，流水漂洗2分，晾干。滴加作用液數(shù)滴，置濕盒內(nèi)于37C孵育2小時(shí)，流水沖洗2分鐘。滴加5號(hào)液數(shù)滴，復(fù)染5分鐘，

5、流水沖洗2分鐘，晾干。【結(jié)果】陽(yáng)性結(jié)果是胞漿內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色沉淀。針對(duì)鈣沉積物“鈣結(jié)節(jié)”的染色方法：4茜素紅法【作用原理】利用沉積的鈣于茜素紅發(fā)生顯色反應(yīng)，得到紅色的染色效果。【步驟】培養(yǎng)皿用PBS沖洗2次，95%乙醇固定10min，雙蒸水沖洗3次。0.1%茜素紅-Tris-Hcl (PH 8.3) 37C，30min。蒸餾水沖洗，干燥，封片。【結(jié)果】染料品種的不同，礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)不同的紅色。5 von Kossa 法【作用原理】Von Kossa s礦化結(jié)節(jié)染色法原理是將礦化基質(zhì)中的磷酸鹽(鈣)、碳酸鹽(鈣)轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿徙y、 碳酸銀，然后用日光、紫外線或強(qiáng)還原劑使其還原為黑色的金屬銀。本試驗(yàn)染色過(guò)程中

6、未作 細(xì)胞襯染。【步驟】培養(yǎng)皿用PBS沖洗2次，4%多聚甲醛固定5分鐘，雙蒸水沖洗3次。培養(yǎng)皿中加入5%硝酸銀溶液1ml，將培養(yǎng)板開蓋在紫外燈下照射1小時(shí)。倒出殘留的硝酸銀溶液，蒸餾水沖洗3遍。培養(yǎng)皿中加入5%硫代硫酸鈉溶液1ml，中和殘留的硝酸銀溶液，吸出殘液。（5）室溫下晾干，封固0.1%茜素紅一Tris-Hcl（PH 8.3）溶液配方具體配制方法：1g Tris （1g左右Tris均可）加入三蒸水100ml中用滴管往配制液中加HCl （分析醇），一滴滴地加，邊加邊測(cè)試PH待PH為8.3左右即可（無(wú)精密PH測(cè)試儀，用PH試紙也是一樣的，但是要能測(cè)到8點(diǎn)幾 的PH試紙）配好后往里面加0.1g

7、的茜素紅于是0.1%茜素紅一Tris-Hcl（PH 8.3）溶液就配好了。茜素紅S中文名稱： 茜素紅 S 英文名稱:alizarin red S; sodium alizarin sulfonateCAS: 130-22-3 分子式：C14H7NaO7H2O 分子量：360.28 中文別名：9,10-二氫-3,4-二羥基 -9,10-二氧代-2-蒽磺酸單鈉鹽；茜素紅；（3）茜素磺酸鈉；茜素S ；酸性媒介茜素紅； 酸性媒介紅 S-80 （Acid Mordnat Reds-80）； C. I.媒介紅 3 （C. I. Mordant Red 3）。性質(zhì)：橙黃色的針狀體。溶于水，微溶于醇，不溶于氯仿和苯。1%水溶液pH2.15。由茜素 經(jīng)發(fā)煙硫酸磺化，然后轉(zhuǎn)變?yōu)殁c鹽制得。茜素紅能和許多金屬離子生成穩(wěn)定的紅色絡(luò)色物， 在分析中常用作金屬指示劑；光度法測(cè)定金屬離子的顯色劑；在分析中常用作金屬指示劑; 光度法測(cè)定金屬離子的顯色劑；酸堿指示劑，第一變色范圍PH值3.7（黃）5.2（紫），第二變 色范圍PH值10.1（紫）12.0（淺黃）；用于極譜法測(cè)定金屬離子。用途：絡(luò)合滴定指示劑和酸堿指示劑。配制：將托盤天平上稱取0.1g茜素磺酸鈉定溶于100ml蒸餾水中