1、基因轉(zhuǎn)化方法與轉(zhuǎn)基因 植株判定LOREM IPSUM DOLOR第1頁(yè)遺傳轉(zhuǎn)化主要方法農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化基因槍法電擊法注射法化學(xué)藥劑誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化花粉管通道法第2頁(yè)一、農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因?qū)?植物細(xì)胞)Transferring genes into plant cells by cointegration using T-DNA，Ti plasmids，and agrobacterium基因?qū)敕椒?第3頁(yè)轉(zhuǎn)化步驟可簡(jiǎn)單概括為以下方面： 1、獲取目標(biāo)基因。用限制酶切割下目標(biāo)基因。 2、基因表示載體構(gòu)建。將目標(biāo)基因與載體（大多數(shù)選取質(zhì)粒）用DNA連接酶連接起來(lái)。 3、將目標(biāo)基因?qū)胧荏w細(xì)胞。將含目標(biāo)基因重

2、組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌（農(nóng)桿菌為受體細(xì)胞）。 4、目標(biāo)基因檢測(cè)與判定。用DNA分子雜交技術(shù)/分子雜交技術(shù)/抗原-抗體雜交/個(gè)體生物學(xué)水平判定（這個(gè)方法需要導(dǎo)入重組后細(xì)胞植物體，詳見(jiàn)第五步） 幾個(gè)方法進(jìn)行檢驗(yàn)（依據(jù)要求選取不一樣方法）。 5、最終將成功表示細(xì)胞導(dǎo)入植物體內(nèi)，對(duì)植物體進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平判定。第4頁(yè)第5頁(yè)技術(shù)特點(diǎn)： 轉(zhuǎn)化拷貝數(shù)低 攜帶目標(biāo)基因片段大 整合后外源基因結(jié)構(gòu)變異小 操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn) 該技術(shù)已成為轉(zhuǎn)化成功最多一個(gè)轉(zhuǎn)化方法第6頁(yè)基因槍法(particle gun) 又稱微彈轟擊法(microprojectile bombardment或particle bombardment) 。 該

3、法借助高速運(yùn)動(dòng)金屬粒子將附著于其表面核酸分子引入受體細(xì)胞，外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞核后整合到染色體組，然后經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)再生出完整個(gè)體(植株)。第7頁(yè)程序與方法：轟擊微彈制備 基因槍轟擊參數(shù) 受體材料 轟擊樣品第8頁(yè)優(yōu)點(diǎn)：受體材料起源廣泛靶受體類型廣泛縮短了轉(zhuǎn)基因周期、轉(zhuǎn)基因植株變異率低及通常含有正常育性缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)化效率不高多拷貝插入 費(fèi)用較高 第9頁(yè)基因槍（particle gun）又稱微彈轟擊法（microprojectile bombardment, particle bombardment, biolistic)。最早是由Cornell大學(xué)研制火藥基因槍。1990年，美國(guó)杜邦企業(yè)推出了商品基因

4、槍PDS-1000系統(tǒng)。基因槍組成部分有：點(diǎn)火裝置、發(fā)射裝置、擋板、樣品室、真空系統(tǒng)組成。基因槍轉(zhuǎn)化基本步驟以下： DNA微彈制備 DNA-微彈載體制備 靶外植體準(zhǔn)備 DNA微彈轟擊 轟擊后外植體培養(yǎng)第10頁(yè)基因?qū)敕椒?三、電擊法 (Gene transfer by electroporation)第11頁(yè)優(yōu)點(diǎn)：不受宿主限制操作簡(jiǎn)便對(duì)植物細(xì)胞不產(chǎn)生毒性轉(zhuǎn)化效率較高，尤其適于瞬間表示缺點(diǎn)：易造成原生質(zhì)體損傷存在原生質(zhì)體再生困難第12頁(yè)注射法 開(kāi)始用于動(dòng)物卵細(xì)胞，以后被用于植物。 用顯微注射儀把外源DNA 溶液注入到子房或胚囊中，因?yàn)樽臃炕蚺吣抑挟a(chǎn)生高壓力及卵細(xì)胞吸收，使外源DNA進(jìn)入受精卵細(xì)胞

5、中，從而取得轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)于子房大、多胚珠作物，能夠說(shuō)是一個(gè)簡(jiǎn)便可行轉(zhuǎn)化路徑。第13頁(yè)化學(xué)藥劑誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化 慣用化學(xué)誘導(dǎo)劑：聚乙二醇(PEG)多聚鳥(niǎo)氨酸(PLO)聚乙烯醇(PVA) PEG是一個(gè)細(xì)胞融合劑。PEG法是最慣用化學(xué)基因轉(zhuǎn)化方法,它是將Ti質(zhì)粒與原生質(zhì)體共同培養(yǎng)在含有PEG和Ca2+溶液中，在高pH值條件下,原生質(zhì)體攝取外源DNA分子,然后經(jīng)再生取得轉(zhuǎn)基因植株。第14頁(yè)優(yōu)點(diǎn)：不受宿主范圍限制操作簡(jiǎn)便成本底缺點(diǎn)： 普通只適合用于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，而原生質(zhì)體再生植株并不輕易，轉(zhuǎn)化效率低;再生植株常不可育或形態(tài)異常、多拷貝插入等現(xiàn)象。 第15頁(yè)四、花粉管通道法花粉管通道法是利用植物授粉后所形成天然

6、花粉管通道（ 又叫花粉管引導(dǎo)組織），經(jīng)珠心通道，將外源DNA 攜帶入胚囊，轉(zhuǎn)化受精卵或其前后生殖細(xì)胞（ 精子、卵子），因?yàn)樗鼈內(nèi)蕴幱谖葱纬杉?xì)胞壁類似“ 原生質(zhì)體”狀態(tài)，而且正在進(jìn)行活躍DNA 復(fù)制、分離和重組，所以很輕易將外源DNA 片段整合到受體基因組中，以到達(dá)遺傳轉(zhuǎn)化之目標(biāo)。第16頁(yè)花粉管通道法 步驟：）去除花冠;）用微量注射器從斷面沿花柱中軸插入子房長(zhǎng)度約處，再退回毫米左右;）注入含外源目標(biāo)基因緩沖液;）正常管理，收獲種子, 經(jīng)篩選取得轉(zhuǎn)基因植株。第17頁(yè)技術(shù)特點(diǎn)：直接、簡(jiǎn)便易行;不需要組織培養(yǎng)繼代，從而排除了植株再生障礙； 但轉(zhuǎn)化效率較低；適合于花器官較大植物。該方法可用于任何開(kāi)花植物

7、，將供體總DNA片斷，在受體自花授粉后一定時(shí)期涂抹于柱頭上，使能沿著花粉管通道進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化受精卵或其前后細(xì)胞。實(shí)際應(yīng)用時(shí)普通切除柱頭進(jìn)行涂抹，這么可降低DNA 進(jìn)入胚囊距離，提升轉(zhuǎn)化率，但會(huì)影響堅(jiān)固率。第18頁(yè)轉(zhuǎn)基因植物判定第19頁(yè)轉(zhuǎn)基因植物判定遺傳判定表示判定表型分析判定利用匯報(bào)基因Northern 雜交Western 雜交 直接鑒定DNA分子是否整合到基因組上。1）擴(kuò)增目片段；2）雜交信號(hào)鑒定。（Southern 雜交）第20頁(yè)檢測(cè)拷貝數(shù)一、Southern blot檢測(cè)第21頁(yè)Southern blot制作探針：-依據(jù)試劑盒要求確定DNA用量， 普通不超出100ng.-反應(yīng)結(jié)束后對(duì)探針

8、最好用層析柱進(jìn) 行純化第22頁(yè)-不一樣植物用于Southern雜交DNA量不一樣，普通每泳道擬南芥DNA用量為10-25ug.-普通用高于酶切需要量DNA10倍酶量，DNA濃度不要過(guò)高。注意不一樣酶要求反應(yīng)溫度不一樣。-酶切后取少許樣品檢測(cè)酶切是否完全，假如不完全，可加酶后繼續(xù)酶切。DNA酶切第23頁(yè)依據(jù)酶切后目標(biāo)片斷大小，普通采取0.7或0.8%agarose。但當(dāng)酶切后目標(biāo)片斷較小時(shí)，要適當(dāng)提升膠濃度。記住電泳時(shí)兩邊泳道要加標(biāo)準(zhǔn)分子標(biāo)識(shí)。電泳是電壓不要過(guò)高， 普通為1v/cm。最好電泳完成后進(jìn)行染色。電泳完成要用百分比尺對(duì)膠進(jìn)行攝影。DNA凝膠電泳第24頁(yè)普通用尼龍莫普通試驗(yàn)室多采取毛細(xì)管

9、法轉(zhuǎn)膜緩沖液普通為10XSSC或SSPE,轉(zhuǎn)膜時(shí)間普通為48hr。用UV確認(rèn)轉(zhuǎn)膜是否完全。固定：UV0.4M NaOH,80oC烘烤1.5-2小時(shí)轉(zhuǎn)膜第25頁(yè)二、 Northern blot從植物中提取RNA方法1. 熱酚法試劑：提取緩沖液：100mM LiCl1%SDS100mMTris-HCl (p8.0)10mMEDTATE緩沖液飽和酚氯仿4MLiCl乙醇75%乙醇300mM醋酸鈉（pH5.2)第26頁(yè)-電泳槽用5%過(guò)氧化氫處理2個(gè)小時(shí)以上，DEPC處理水清洗2次。-滅菌、RNA專用瓶中加入80mlDEPC處理水及1.2克瓊脂糖，微波爐加熱溶解，60oC水浴上放置15分鐘，加入5ml20

10、 xMOPS及15ml甲醛溶液，灌膠。與通風(fēng)櫥中進(jìn)行。變性凝膠制備第27頁(yè)-RNA加樣緩沖液：35ul 37%甲醛100ul 甲酰胺5ul 20XMOPS20ul 10 xDye累計(jì)160ul- 4ul RNA樣品（ 4ul DEPC或甲酰胺中溶解 10-20ugRNA）-加入16ul RNA加樣緩沖液，混合-65oC加熱10分鐘-冰中放置5分鐘電泳用RNA樣品準(zhǔn)備第28頁(yè)-把制作凝膠置于電泳槽中，加1XMOPS緩沖液 （用20XMOPS繼DEPC處理水配置）-5V/cm,預(yù)電泳5-10分鐘-于凝膠孔中加入熱變性后RNA樣品-3-4V/cm，電泳1-2兩個(gè)小時(shí)-電泳結(jié)束后，用百分比尺攝影RNA電泳第29頁(yè)轉(zhuǎn)膜10XSSPE 或10XSSC固定：0.0